Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора
биологических наук. — Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2011. — 48 с.
Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология.
Научный руководитель: Член-корреспондент РАН, д.б.н. Лукьянов С.А. Цель работы: Создание нового поколения генетически кодируемых флуоресцентных инструментов для флуоресцентной микроскопии и визуализации структур и процессов в живых тканях. Научная новизна: В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, существенно расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем. Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET. Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной. Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки - регистрировать активность и исследовать динамику работы промотеров исследуемых генов. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках. Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью.
Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в
сотнях лабораторий по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Практическая ценность: Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: «FEBS meeting on Advanced Light Microscopy» (Семмеринг, Австрия, 2005, приглашенный доклад), «The 32nd Loe Conference on Protein Structure and Function» (Лорне, Австралия, 2007, приглашенный доклад), «3rd Annual FABLS Workshop» (Мельбурн, Австралия, 2007, приглашенный доклад), "Лазерная конфокальная микроскопия в биологии и медицине" (Звенигород, Россия, 2005, приглашенный доклад), Четвертая международная конференция "Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии" (Пущино, Россия, 2007, приглашенный
доклад), «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm Conference.» (Вашингтон, США, 2007, приглашенный доклад), «Международная конференция им. Гельмгольца» (Москва, Россия, 2008, приглашенный доклад), «Symposium on Watching Biomolecules in Action» (Осака, Япония, 2009, приглашенный доклад), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), "Molecular Imaging" (Крит, Греция, 2005), съезд Биохимического и молекулярно-биологического общества Германии (Мюнстер, Германия, 2004), «ASDD Symposium» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-петербург, Россия, 2004), «BIOCATALYSIS–2005» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «BIOCATALYSIS–2007» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007), Национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, Россия, 2009).
Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология.
Научный руководитель: Член-корреспондент РАН, д.б.н. Лукьянов С.А. Цель работы: Создание нового поколения генетически кодируемых флуоресцентных инструментов для флуоресцентной микроскопии и визуализации структур и процессов в живых тканях. Научная новизна: В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, существенно расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем. Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET. Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной. Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки - регистрировать активность и исследовать динамику работы промотеров исследуемых генов. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках. Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью.
Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в
сотнях лабораторий по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Практическая ценность: Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: «FEBS meeting on Advanced Light Microscopy» (Семмеринг, Австрия, 2005, приглашенный доклад), «The 32nd Loe Conference on Protein Structure and Function» (Лорне, Австралия, 2007, приглашенный доклад), «3rd Annual FABLS Workshop» (Мельбурн, Австралия, 2007, приглашенный доклад), "Лазерная конфокальная микроскопия в биологии и медицине" (Звенигород, Россия, 2005, приглашенный доклад), Четвертая международная конференция "Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии" (Пущино, Россия, 2007, приглашенный
доклад), «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm Conference.» (Вашингтон, США, 2007, приглашенный доклад), «Международная конференция им. Гельмгольца» (Москва, Россия, 2008, приглашенный доклад), «Symposium on Watching Biomolecules in Action» (Осака, Япония, 2009, приглашенный доклад), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), "Molecular Imaging" (Крит, Греция, 2005), съезд Биохимического и молекулярно-биологического общества Германии (Мюнстер, Германия, 2004), «ASDD Symposium» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-петербург, Россия, 2004), «BIOCATALYSIS–2005» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «BIOCATALYSIS–2007» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007), Национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, Россия, 2009).