Через колонку, заполненную набухшим сефадексом, пропускают
исследуемый белковый экстракт. Белки, молекулы которых по своим размерам
превосходят размеры ячеек в гранулах сефадекса, проходят между частицами
геля и выходят из колонки раньше низкомолекулярных белков, которые
задерживаются внутри гранул сефадекса. Происходит разделение белков по
молекулярной массе.
Электрофоретическое разделение белков основано на том, что белки,
имеющие разные по величине и знаку заряды в электрическом поле
постоянного тока, будут двигаться к катоду или аноду. Скорость движения
определяется величиной заряда.
Классификация методов связана с типом электролитической системы,
типом носителя, конструкцией аппаратуры, а также способом обнаружения
разделяемых белковых фракций.
Широкое распространение получил электрофорез в полиакриламидном
геле.
Метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) основан на разделении
белков, имеющих разные изоэлектрические точки. ИЭФ осуществляется в
процессе их электрофоретического разделения на колонке, по высоте которой
создается градиент рН. Белок движется под воздействием электрического поля,
пока не достигнет той области колонки, где рН равен изоэлектрической точке
данного белка. Суммарный электрический заряд белка становится равным
нулю; белок теряет подвижность и концентрируется в этой области в виде
узкой зоны. Молекулы различных белков будут образовывать зоны в той или
иной части колонки в соответствии со значениями их изоэлектрических точек.
ИЭФ позволяет разделять белки, различающиеся значениями изоэлектрических
точек на 0,02 единицы.
Применяются и другие разновидности электрического разделения:
иммуноэлектрофорез, изотахофорез, метод пептидных карт и
ультрацентрифугирование.
Для установления первичной структуры белка (последовательности
расположения аминокислотных остатков в одной или нескольких
полипептидных цепях) проводят ряд сложных операций (схема 2).
Определение последовательности аминокислотных остатков в
индивидуальных пептидах проводят фенилизотиоцианатным методом Эдмана,
масс-спектрометрическим, ферментативным, генетическим, методом лазерной
фотодиссоциации, обладающего высокой чувствительностью (для анализа
достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 кДа).
В методе масс-спектрометрии фрагментацию осуществляют воздействием
электронного удара, а разделение фрагментов – в масс-спектрометре. В
результате получают масс-спектр фрагментов пептида (рис.2).
Схема 2
Последовательность операций
при установлении первичной структуры белка
Белок