ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 59
С развитием знаний о генетических элементах и совершенствованием
методов генной инженерии новые векторы под конкретные задачи начали
собирать из отдельных блоков – различных хорошо охарактеризованных ге-
нетических элементов (см рис. 2.6
). В настоящее время имеется огромное ко-
личество коммерчески доступных разнообразных синтетических векторов,
сконструированных практически под любые задачи.
Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на
размер вставок чужеродной ДНК. Основные типы современных векторов
рассмотрены ниже.
Плазмидные векторы – кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК,
имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч
пар нуклеотидов). Плазми-
ды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10
видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции.
Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей –
три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как
молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например,
устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать
определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плаз-
миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида
содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которо-
го определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться
только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры
плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида име-
ет постоянную определенную копийность в клетке – количество молекул на
клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных
векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды явля-
ется небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательно-
стью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного
вектора рассмотрена более подробно п. 2.1.5
(см. рис. 2.7).
Основным недостатком плазмидных векторов является их малая ем-
кость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирова-
ние больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селек-
тивное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным вре-
менем репликации.
Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них.
Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Ем-
кость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой
векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома мож-
но заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клони-
рующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дико-
го типа (рис. 2.4
). Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы осно-
ван на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует
ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных моле-
кул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда
производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизоген-
ных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных ли-