ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 65
используются для конструирования векторов. Например, в экспрессионных
векторах для E. coli серии pET (Novagen) использованы регуляторные эле-
менты фага Т7, для конструирования серии pQE (Qiagen) – элементы фага T5.
В настоящее время имеется широкий спектр хорошо охарактеризованных
сигнальных и регуляторных элементов, из которых конструируют экспресси-
онные вектора, и список этот регулярно пополняется.
5. Ген-репрессор транскрипции с векторного индуцибельного промо-
тора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования
синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при
клонировании токсичных для клетки-хозяина белков. Наличие в составе век-
тора гена-репрессора транскрипции позволяет строже регулировать синтез
клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы.
6. Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде
фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы,
при этом целевой белок синтезируется в виде N- или C-концевого фьюжина
(гибридного белка). Цели могут быть различными – повышение уровня экс-
прессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и
сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие
эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка. Напри-
мер, наличие полигистидиновой последовательности (His-tag) из 6 или 10
аминокислотных остатков позволяет проводить очистку рекомбинантного
белка аффинной хроматографией с использованием иммобилизованных на
твердом носителе ионов металлов (Co
2+
, Ni
2+
), фрагмент глутатион-S-
трансферазы может быть использован для очистки на смоле, содержащей
связанный глутатион. Как правило, присоединяют такие белковые фрагменты
через последовательности, содержащие сайты расщепления специфических
протеаз. В этом случае после очистки рекомбинантного белка лишние после-
довательности можно удалить протеазной обработкой.
7. Редкие кодоны в составе чужеродного гена, приводящие к снижению
скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего
одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, –
по крайней мере, двумя, чаще четырьмя, а иногда и шестью кодонами (лей-
цин, серин, аргинин). При этом живые организмы используют синонимичные
си-кодоны для кодирования белков статистически не пропорционально. Из
четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах чело-
века в 26 % случаев, а в Escherichia coli – в 9 %. Такая же ситуация наблюда-
ется и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования кодонов
UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у E. coli —
0,62, 0,09 и 0,30. Для каждого типа организмов существует своя предпочти-
тельная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно,
свой концентрационный набор изоакцепторных транспортных тРНК.
Таким образом, при гетерологичной экспрессии плохая трансляция це-
левого гена, имеющего в своем составе редкие для клетки-мишени кодоны,
может происходить вследствие низкой внутриклеточной концентрации
тРНК, узнающей такие кодоны. Проблему можно решить химико-