Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук: 03.01.03 - молекулярная биология. — Институт
молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. — Москва, 2010. —
70 с.
Цель работы: сравнительный анализ различных
векторных систем, клонирование и экспрессия целевых рекомбинантных
генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных
и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов
в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных
векторов.
Научная новизна и практическая ценность работы заключается в разработке и совершенствовании систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать in vitro и in vivo гетерологичные белки, имеющие практическое значение.
Предложена схема организации фрагментированного генома вируса штриховатой мозаики ячменя, показано, что исследуемые штаммы ВШМЯ являются близкородственными. Впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ.
Предложена бактериальная система селекции рибозимов на основе B. subtilis, которая может быть применена для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.
Предложенная векторная система дрожжей с использованием промотора гена PHO5 может быть использована для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae.
Разработанные условия синтеза серотонинового рецептора 5HT1c мозга мыши в клетках растений и его функциональной активности в клетках растений и в ооцитах Xenopus laevis могут быть использованы для анализа клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы в клетках растений.
Новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов позволят в одной инфицированной клетке насекомого экспрессировать одновременно несколько генов и получать мультимерные белки, функционально близкие природным аналогам.
Предложенный роллерный метод препаративного выращивания рекомбинантных бакуловирусов может использоваться для получения штаммов-продуцентов белков, имеющих практическое значение.
Новые бакуловирусные векторы с экспрессирующими кассетами под контролем промотора, функционирующего в клетках млекопитающих, и разработанные условия доставки модифицированных векторов в клетки млекопитающих могут быть успешно использованы для эффективнго переноса и экспрессии целевых генов как in vitro, так и in vivo.
Разработанные условия синтеза CYP21A2 с большим выходом в бакуловирусной системе, могут быть использованы для функционального анализа мутаций стероид-21-гидроксилазы. Данные о влиянии мутаций на свойства стероид-21 - гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести течения классической формы адреногенитального синдрома.
Мультисубъединичные вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС), полученные в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы могут использоваться для иммунологических и терапевтических исследований, для получения вакцин, для поиска новых соединений с антивирусной активностью, а также в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ВГС с клетками, механизмов размножения вируса.
Исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.
Воздействие новых синтетических N-алкилированных DNJ на вирусный морфогенез ВГС может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.
Научная новизна и практическая ценность работы заключается в разработке и совершенствовании систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать in vitro и in vivo гетерологичные белки, имеющие практическое значение.
Предложена схема организации фрагментированного генома вируса штриховатой мозаики ячменя, показано, что исследуемые штаммы ВШМЯ являются близкородственными. Впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ.
Предложена бактериальная система селекции рибозимов на основе B. subtilis, которая может быть применена для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.
Предложенная векторная система дрожжей с использованием промотора гена PHO5 может быть использована для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae.
Разработанные условия синтеза серотонинового рецептора 5HT1c мозга мыши в клетках растений и его функциональной активности в клетках растений и в ооцитах Xenopus laevis могут быть использованы для анализа клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы в клетках растений.
Новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов позволят в одной инфицированной клетке насекомого экспрессировать одновременно несколько генов и получать мультимерные белки, функционально близкие природным аналогам.
Предложенный роллерный метод препаративного выращивания рекомбинантных бакуловирусов может использоваться для получения штаммов-продуцентов белков, имеющих практическое значение.
Новые бакуловирусные векторы с экспрессирующими кассетами под контролем промотора, функционирующего в клетках млекопитающих, и разработанные условия доставки модифицированных векторов в клетки млекопитающих могут быть успешно использованы для эффективнго переноса и экспрессии целевых генов как in vitro, так и in vivo.
Разработанные условия синтеза CYP21A2 с большим выходом в бакуловирусной системе, могут быть использованы для функционального анализа мутаций стероид-21-гидроксилазы. Данные о влиянии мутаций на свойства стероид-21 - гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести течения классической формы адреногенитального синдрома.
Мультисубъединичные вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС), полученные в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы могут использоваться для иммунологических и терапевтических исследований, для получения вакцин, для поиска новых соединений с антивирусной активностью, а также в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ВГС с клетками, механизмов размножения вируса.
Исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.
Воздействие новых синтетических N-алкилированных DNJ на вирусный морфогенез ВГС может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.