Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора
химических наук: 02.00.10 – биоорганическая химия. — Московский
государственный университет им. М.В. Ломоносова. — Москва, 2011. —
50 с.
Цель работы. Обнаружение, идентификация, выяснение
структуры, свойств и роли апоптотической протеазы растений –
фитаспазы.
Научная новизна и практическая значимость. В структуре белка человека протимозина альфа идентифицирован сигнал ядерной локализации. Одной из выявленных ядерных функций протимозина альфа является участие в защите клеток от окислительного стресса.
Обнаружено, что в процессе апоптоза в клетках человека происходит фрагментация протимозина альфа каспазой. В результате гидролиза протимозин альфа теряет сигнал ядерной локализации и меняет свою внутриклеточную локализацию с ядерной на цитоплазматическую.
Биоинформатический поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина каспазой, выявил белок VirD2 агробактерии Agrobacterium tumefaciens (патогена растений) в качестве потенциальной мишени каспаз. Экспериментально установлено, что белок VirD2 фрагментируется каспазой-3 человека и идентифицированы места гидролиза.
Используя принцип изменения внутриклеточной локализации белка вследствие фрагментации каспазой, выявленный на примере протимозина альфа, мы обнаружили активацию фитаспазы при индукции ПКС в листьях табака. Показано, что фитаспаза гидролизует белок VirD2 после остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Фитаспаза выявлена у широкого круга растительных организмов.
Разработана процедура выделения фитаспазы из растительных экстрактов. Фитаспазы табака и риса получены в индивидуальном состоянии. Определена субстратная специфичность фитаспаз, показавшая, что эти растительные ферменты, как и каспазы, гидролизуют субстраты строго после остатка D в благоприятном аминокислотном контексте.
Установлена роль фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной как биотическим (вирусная инфекция), так и абиотическими стрессами (окислительный и осмотический стресс).
Фитаспазы табака и риса идентифицированы как субтилизин-подобные (сериновые) протеазы растений.
Активация фитаспазы происходит путем автокаталитического процессинга профермента в соответствии со специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования активной фитаспазы и для ее секреции.
В здоровых листьях растений фитаспаза накапливается в межклеточной жидкости (апопласте), куда направляется N-концевым сигнальным пептидом профермента. Индукция ПКС сопровождается перемещением фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.
Фрагментация агробактериального белка VirD2 фитаспазой является защитным механизмом, препятствующим доставке чужеродной ДНК в ядро растительной клетки.
Таким образом, у растений идентифицирован и охарактеризован новый тип протеаз, являющихся функциональными аналогами каспаз животных, и выявлены свойства апоптотических протеаз, специфичные для растений.
Все результаты диссертационной работы получены впервые.
Результаты работы опубликованы в виде 15 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах, 1 главы в книге и 1 международного патента.
Работа была поддержана грантами РФФИ, Королевского общества Великобритании, CRDF.
Научная новизна и практическая значимость. В структуре белка человека протимозина альфа идентифицирован сигнал ядерной локализации. Одной из выявленных ядерных функций протимозина альфа является участие в защите клеток от окислительного стресса.
Обнаружено, что в процессе апоптоза в клетках человека происходит фрагментация протимозина альфа каспазой. В результате гидролиза протимозин альфа теряет сигнал ядерной локализации и меняет свою внутриклеточную локализацию с ядерной на цитоплазматическую.
Биоинформатический поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина каспазой, выявил белок VirD2 агробактерии Agrobacterium tumefaciens (патогена растений) в качестве потенциальной мишени каспаз. Экспериментально установлено, что белок VirD2 фрагментируется каспазой-3 человека и идентифицированы места гидролиза.
Используя принцип изменения внутриклеточной локализации белка вследствие фрагментации каспазой, выявленный на примере протимозина альфа, мы обнаружили активацию фитаспазы при индукции ПКС в листьях табака. Показано, что фитаспаза гидролизует белок VirD2 после остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Фитаспаза выявлена у широкого круга растительных организмов.
Разработана процедура выделения фитаспазы из растительных экстрактов. Фитаспазы табака и риса получены в индивидуальном состоянии. Определена субстратная специфичность фитаспаз, показавшая, что эти растительные ферменты, как и каспазы, гидролизуют субстраты строго после остатка D в благоприятном аминокислотном контексте.
Установлена роль фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной как биотическим (вирусная инфекция), так и абиотическими стрессами (окислительный и осмотический стресс).
Фитаспазы табака и риса идентифицированы как субтилизин-подобные (сериновые) протеазы растений.
Активация фитаспазы происходит путем автокаталитического процессинга профермента в соответствии со специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования активной фитаспазы и для ее секреции.
В здоровых листьях растений фитаспаза накапливается в межклеточной жидкости (апопласте), куда направляется N-концевым сигнальным пептидом профермента. Индукция ПКС сопровождается перемещением фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.
Фрагментация агробактериального белка VirD2 фитаспазой является защитным механизмом, препятствующим доставке чужеродной ДНК в ядро растительной клетки.
Таким образом, у растений идентифицирован и охарактеризован новый тип протеаз, являющихся функциональными аналогами каспаз животных, и выявлены свойства апоптотических протеаз, специфичные для растений.
Все результаты диссертационной работы получены впервые.
Результаты работы опубликованы в виде 15 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах, 1 главы в книге и 1 международного патента.
Работа была поддержана грантами РФФИ, Королевского общества Великобритании, CRDF.