Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук. — Всероссийский научный центр молекулярной
диагностики и лечения. Московский научно-исследовательский институт
медицинской экологии. — Москва, 2009. — 36 с.
Специальность 03.00.04 - Биохимия. Целями работы являются: изучение биосинтетического сворачивания белков, в том числе котрансляционного этапа и вклада молекулярных шаперонов в процесс сворачивания; разработка подходов для изучения сворачивания, структурно-функционального и иммунологического анализа белков в бесклеточных системах экспрессии; изучение природных и искусственных белков с применением, в том числе, разработанных подходов;
изучение подходов к созданию противотуберкулезной вакцины на основе молекулярных шаперонов.
Научная новизна работы: Детально исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Для этой цели разработаны целый ряд оригинальных подходов.
Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. При этом образующаяся структура рибосомосвязанного полипептида близка к структуре нативного белка.
Впервые, на примере b субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса.
Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной b субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.
На основании полученных результатов выдвинуты некоторые основные принципы котрансляционного сворачивания.
Практическая значимость работы: Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.
Разработанные подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов, в том числе синтезированных в бесклеточных системах, могут применяться для быстрого анализа природных и искусственных полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена, например из-за токсичности, подверженности протеолизу и т.д. Возможности подхода продемонстрированы на начальном структурном анализе альбебетина, полипептида с заранее заданной пространственной структурой.
Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС.
В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с данными белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа.
Установлена его доменная организация.
Показано, что конъюгат шаперона HSP70 M. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием может являться основой противотуберкулезной вакцины.
Специальность 03.00.04 - Биохимия. Целями работы являются: изучение биосинтетического сворачивания белков, в том числе котрансляционного этапа и вклада молекулярных шаперонов в процесс сворачивания; разработка подходов для изучения сворачивания, структурно-функционального и иммунологического анализа белков в бесклеточных системах экспрессии; изучение природных и искусственных белков с применением, в том числе, разработанных подходов;
изучение подходов к созданию противотуберкулезной вакцины на основе молекулярных шаперонов.
Научная новизна работы: Детально исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Для этой цели разработаны целый ряд оригинальных подходов.
Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. При этом образующаяся структура рибосомосвязанного полипептида близка к структуре нативного белка.
Впервые, на примере b субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса.
Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной b субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.
На основании полученных результатов выдвинуты некоторые основные принципы котрансляционного сворачивания.
Практическая значимость работы: Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.
Разработанные подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов, в том числе синтезированных в бесклеточных системах, могут применяться для быстрого анализа природных и искусственных полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена, например из-за токсичности, подверженности протеолизу и т.д. Возможности подхода продемонстрированы на начальном структурном анализе альбебетина, полипептида с заранее заданной пространственной структурой.
Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС.
В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с данными белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа.
Установлена его доменная организация.
Показано, что конъюгат шаперона HSP70 M. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием может являться основой противотуберкулезной вакцины.