Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия

Подождите немного. Документ загружается.

ной активности соответственно. Гормонрецепторный комплекс сообщает

G-белку способность не только легко обменивать эндогенный связанный

ГДФ на ГТФ, но и переводить G

-белок в активированное состояние, при

этом активный G-белок диссоциирует в присутствии ионов Mg

на β-,

γ-субъединицы и комплекс α-субъединицы G

в ГТФ-форме; этот активный

комплекс затем перемещается к молекуле аденилатциклазы и активирует ее.

Сам комплекс затем подвергается самоинактивации за счет энергии распада

ГТФ и реассоциации β- и γ-субъединиц с образованием первоначальной

ГДФ-формы G

Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок плазма-

тических мембран, его активный центр ориентирован в сторону цитоплаз-

мы и катализирует реакцию синтеза цАМФ из АТФ:

Каталитический компонент аденилатциклазы, выделенный из разных

тканей животных, представлен одним полипептидом с мол. массой 120000–

150000; в отсутствие G-белков он практически неактивен; содержит две

SH-группы, одна из которых вовлечена в сопряжение с G

-белком, а вторая

необходима для проявления каталитической активности. В молекуле фер-

мента имеется несколько аллостерических центров, через которые осущест-

вляется регуляция активности низкомолекулярными соединениями: ионами

, Mn

и Са

, аденозином и форсколином. Под действием фосфоди-

эстеразы цАМФ гидролизуется с образованием неактивного 5'-АМФ.

Протеинкиназа – это внутриклеточный фермент, через который

цАМФ реализует свой эффект. Протеинкиназа может существовать в 2 фор-

мах. В отсутствие цАМФ Протеинкиназа представлена в виде тетрамерного

комплекса, состоящего из двух каталитических (С

) и двух регуляторных

) субъединиц с мол. массами 49000 и 38000 соответственно; в этой

форме фермент неактивен. В присутствии цАМФ протеинкиназный комп-

лекс обратимо диссоциирует на одну R

-субъединицу и две свободные

каталитические субъединицы С; последние обладают ферментативной ак-

тивностью, катализируя фосфорилирование белков и ферментов, соответ-

ственно изменяя клеточную активность.

291

Неактивная

протеинкиназа

Диссоциирован-

ные активные

каталитические

субъединицы

Неактивные

регуляторные

субъединицы

Аденилат-

циклаза

АТФ

3',5'-цАМФ

Фосфо-

диэстераза

5'-АМФ

цАМФ

Рис. 8.6. Ковалентная регуляция гликогенфосфорилазы.

Следует отметить, что в клетках открыт большой класс цАМФ-зависи-

мых протеинкиназ *, названных протеинкиназами А; они катализируют

перенос фосфатной группы на ОН-группы серина и треонина (так называ-

емые серин-треонин-киназы). Другой класс протеинкиназ, в частности

активируемый инсулиновым рецептором (см. ранее), действует только на

ОН-группу тирозина. Однако во всех случаях добавление высокозарядной

и объемной фосфатной группы вызывает не только конформационные

изменения фосфорилированных белков, но изменяет их активность или

кинетические свойства.

Активность многих ферментов регулируется цАМФ-зависимым фосфо-

рилированием, соответственно большинство гормонов белково-пептидной

природы активирует этот процесс. Однако ряд гормонов оказывает тормо-

зящий эффект на аденилатциклазу, соответственно снижая уровень цАМФ

и фосфорилирование белков. В частности, гормон соматостатин, соеди-

няясь со своим специфическим рецептором – ингибиторным G-белком

, являющимся структурным гомологом G

-белка (см. ранее), ингиби-

рует аденилатциклазу и синтез цАМФ, т.е. вызывает эффект, прямо

противоположный вызываемому адреналином и глюкагоном. В ряде орга-

нов простагландины (в частности, РGЕ

) также оказывают ингибиторный

эффект на аденилатциклазу, хотя в том же органе (в зависимости от типа

клеток) и тот же PGE

может активировать синтез цАМФ.

Более подробно изучен механизм активирования и регуляции мышечной

гликогенфосфорилазы, активирующей распад гликогена. Выделяют 2 фор-

мы: каталитически активную – фосфорилаза а и неактивную – фосфо-

рилаза b. Обе фосфорилазы построены из двух идентичных субъединиц

(мол. массой 94500), в каждой остаток серина в положении 14 подвергается

процессу фосфорилирования–дефосфорилирования, соответственно акти-

вированию и инактивированию (рис. 8.6).

Под действием киназы фосфорилазы b, активность которой регулиру-

ется цАМФ-зависимой протеинкиназой, обе субъединицы молекулы неак-

тивной формы фосфорилазы b подвергаются ковалентному фосфорилиро-

ванию и превращаются в активную фосфорилазу а. Дефосфорилирование

последней под действием специфической фосфатазы фосфорилазы

а приводит к инактивации фермента и возврату в исходное состояние.

В мышечной ткани открыты 3 типа регуляции гликогенфосфорилазы.

Первый тип – ковалентная регуляция, основанная на гормонзависимом

фосфорилировании–дефосфорилировании субъединиц фосфорилазы (см.

рис. 8.6).

* За открытие класса протеинкиназ и фосфатаз Э. Кребс (Edwin Krebs) и Э. Фишер

(Edmund Fischer) в 1992 г. были удостоены Нобелевской премии.

292

Киназа фосфо-

рилазы b

2АТФ

2АДФ

Фосфорилаза b

(неактивная)

2Р

2Н

Фосфорилаза а

(активная)

Рис. 8.7. Аллостерическая регуляция гликогенфосфорилазы.

Второй тип – аллостерическая регуляция. Она основана на реакциях

аденилирования–деаденилирования субъединиц гликогенфосфорилазы b

(соответственно активирование–инактивирование). Направление реакций

определяется отношением концентраций АМФ и АТФ, присоединяющихся

не к активному центру, а к аллостерическому центру каждой субъединицы

(рис. 8.7).

В работающей мышце накопление АМФ, обусловленное тратой АТФ,

вызывает аденилирование и активирование фосфорилазы b. В покое, наобо-

рот, высокие концентрации АТФ, вытесняя АМФ, приводят к аллостериче-

скому ингибированию этого фермента путем деаденилирования.

цАМФ и протеинкиназа играют центральную роль в гормональной

регуляции синтеза и распада гликогена в печени (рис. 8.8). Подробно

о химических превращениях гликогена см. в главе 10 *.

Третий тип – кальциевая регуляция, основанная на аллостерическом

активировании киназы фосфорилазы b ионами Са

, концентрация которых

повышается при мышечном сокращении, способствуя тем самым образова-

нию активной фосфорилазы а.

Гуанилатциклазная мессенджерная система

Довольно долгое время циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) рас-

сматривался как антипод цАМФ. Ему приписывали функции, противопо-

ложные цАМФ. К настоящему времени получено много данных, что цГМФ

принадлежит самостоятельная роль в регуляции функции клеток. В частно-

сти, в почках и кишечнике он контролирует ионный транспорт и обмен

воды, в сердечной мышце служит сигналом релаксации и т.д.

Биосинтез цГМФ из ГТФ осуществляется под действием специфической

гуанилатциклазы по аналогии с синтезом цАМФ:

* Гликогенфосфорилаза печени также регулируется гормонами (адреналин и глюкагон) и,

кроме того, концентрацией в крови глюкозы, которая оказалась, как и глюкозо-6-фосфат,

аллостерическим ингибитором фосфорилазы а; связывание глюкозы (когда уровень глюкозы

повышается в крови) с аллостерическим участком активной фосфорилазы а вызывает ряд

конформационных изменений структуры, способствуя активированию фосфатазы фосфорила-

зы а (см. рис. 10.1), соответственно дефосфорилированию фосфорилазы а и превращению ее

в неактивную фосфорилазу b.

293

2АМФ

АМФ

Фосфорилаза b

неактивная

Фосфорилаза b

активная

ГТФ

Гуанилатциклаза

цГМФ + РР

Рис. 8.8. Схематическое выражение центральной роли цАМФ и протеинкиназы

в гормональной регуляции синтеза и распада гликогена.

Адреналинрецепторный комплекс: АЦ - аденилатциклаза, G - G-белок; С и R - соответственно

каталитические и регуляторные субъединицы протеинкиназы; КФ - киназа фосфорилазы b

Ф - фосфорилаза; Глк-1-P - глюкозо-1-фосфат; Глк-6-P - глюкозо-6-фосфат; УДФ-Глк - ури-

диндифосфатглюкоза; ГС - гликогенсинтаза.

Известны четыре разные формы гуанилатциклазы, три из которых

являются мембраносвязанными и одна – растворимая открыта в цитозоле.

Показано, что мембраносвязанные формы (мол. массой ~ 180000) состоят

из 3 участков: рецепторного, локализованного на внешней поверхности

плазматической мембраны; внутримембранного домена и каталитического

компонента, одинакового у разных форм фермента. Гуанилатциклаза от-

крыта во многих органах (сердце, легкие, почки, надпочечники, эндотелий

кишечника, сетчатка и др.), что свидетельствует о широком ее участии

в регуляции внутриклеточного метаболизма, опосредованном через цГМФ.

Мембраносвязанный фермент активируется через соответствующие рецеп-

294

Адреналин

Са

АЦ

АТФ

РР

цАМФ

5'-АМФ

ПРОТЕИНКИНАЗА

АТФ

Киназа Ф b

неактивная

Фосфатаза

КФ b

активная

2АТФ

2АДФ

АДФ

Фосфорилаза

неактивная

Фосфорилаза

активная

АТФ

АДФ

УДФ

УТФ

РР

ГС

активная

ГС

неак-

тивная

2Р

2Н

Фосфатаза

Ф а

Са

УДФ-Глк

Глк-6-

Глк-1

Глюкоза

Кровь

Фосфатаза

ГС

ИНСУЛИН

торы короткими внеклеточными пептидами (18–20 аминокислотных остат-

ков), в частности гормоном предсердным натрийуретическим пеп-

тидом (АНФ), термостабильным токсином грамотрицательных бактерий

и др. АНФ, как известно, синтезируется в предсердии в ответ на увеличение

объема крови, поступает с кровью в почки, активирует гуанилатциклазу

(соответственно повышает уровень цГМФ), способствуя экскреции Na

и воды. Гладкие мышечные клетки сосудов также содержат аналогичную

рецептор-гуанилатциклазную систему, посредством которой связанный с

рецептором АНФ оказывает сосудорасширяющее действие, способствуя

снижению кровяного давления. В эпителиальных клетках кишечника акти-

ватором рецептор–гуанилатциклазной системы может служить бактериаль-

ный эндотоксин, который приводит к замедлению всасывания воды в ки-

шечнике и развитию диареи.

Растворимая форма гуанилатциклазы (мол. масса 152000) является

гемсодержащим ферментом, состоящим из 2 субъединиц. В регуляции

этой формы гуанилатциклазы принимают участие нитровазодилататоры,

свободные радикалы – продукты перекисного окисления липидов. Одним из

хорошо известных активаторов является эндотелиальный фактор (EDRF),

вызывающий релаксацию сосудов. Действующим компонентом, естествен-

ным лигандом, этого фактора служит оксид азота NO. Эта форма

фермента активируется также некоторыми нитрозовазодилататорами (нит-

роглицерин, нитропруссид и др.), используемыми при болезнях сердца; при

распаде этих препаратов также освобождается NO.

Оксид азота образуется из аминокислоты аргинина при участии сложной

Са

-зависимой ферментной системы со смешанной функцией, названной

NO-синтазой:

Оксид азота при взаимодействии с гемом гуанилатциклазы способствует

быстрому образованию цГМФ, который снижает силу сердечных сокраще-

ний путем стимулирования ионных насосов, функционирующих при низких

концентрациях Са

. Однако действие NO кратковременное, несколько

секунд, локализованное – вблизи места его синтеза. Подобный эффект, но

более длительный оказывает нитроглицерин, который медленнее освобож-

дает NO.

Получены доказательства, что большинство эффектов цГМФ опосредо-

вано через цГМФ-зависимую протеинкиназу, названную протеинкина-

зой G. Этот широко распространенный в эукариотических клетках фермент

получен в чистом виде (мол. масса 80000). Он состоит из 2 субъединиц –

каталитического домена с последовательностью, аналогичной последова-

тельности С-субъединицы протеинкиназы А (цАМФ-зависимой), и регуля-

торного домена, сходного с R-субъединицей протеинкиназы А (см. ранее).

Однако протеинкиназы А и G узнают разные последовательности белков,

регулируя соответственно фосфорилирование ОН-группы серина и треони-

295

Аргинин

NO-синтаза

Цитруллин

НАДФН + Н

НАДФ

NО

на разных внутриклеточных белков и оказывая тем самым разные биологи-

ческие эффекты.

Уровень циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в клетке контроли-

руется соответствующими фосфодиэстеразами, катализирующими их

гидролиз до 5'-нуклеотидмонофосфатов и различающимися по сродству

к цАМФ и цГМФ. Выделены и охарактеризованы растворимая кальмоду-

линзависимая фосфодиэстераза и мембраносвязанная изоформа, не регули-

руемая Са

и кальмодулином.

Са

-мессенджерная система

Ионам Са

принадлежит центральная роль в регуляции многих клеточных

функций. Изменение концентрации внутриклеточного свободного Са

является сигналом для активации или ингибирования ферментов, которые

в свою очередь регулируют метаболизм, сократительную и секреторную

активность, адгезию и клеточный рост. Источники Са

могут быть

внутри- и внеклеточными. В норме концентрация Са

в цитозоле не

превышает 10

–7

М, и основными источниками его являются эндоплазмати-

ческий ретикулум и митохондрии. Нейрогормональные сигналы приводят

к резкому повышению концентрации Са

(до 10

–6

М), поступающего как

извне через плазматическую мембрану (точнее, через потенциалзависимые

и рецепторзависимые кальциевые каналы), так и из внутриклеточных

источников. Одним из важнейших механизмов проведения гормонального

сигнала в кальций–мессенджерной системе является запуск клеточных реак-

ций (ответов) путем активирования специфической Са

-кальмодулин-

зависимой протеинкиназы. Регуляторной субъединицей этого фермен-

та оказался Са

-связывающий белок кальмодулин (мол. масса 17000).

При повышении концентрации Са

в клетке в ответ на поступающие

сигналы специфическая протеинкиназа катализирует фосфорилирование

множества внутриклеточных ферментов – мишеней, регулируя тем самым

их активность. Показано, что в состав киназы фосфорилазы b, активируе-

мой ионами Са

, как и NO-синтазы, входит кальмодулин в качестве

субъединицы. Кальмодулин является частью множества других Са

-свя-

зывающих белков. При повышении концентрации кальция связывание Са

с кальмодулином сопровождается конформационными его изменениями,

и в этой Са

-связанной форме кальмодулин модулирует активность

множества внутриклеточных белков (отсюда его название).

К внутриклеточной системе мессенджеров относят также производные

фосфолипидов мембран эукариотических клеток, в частности фосфорили-

рованные производные фосфатидилинозитола. Эти производные освобож-

даются в ответ на гормональный сигнал (например, от вазопрессина или

тиротропина) под действием специфической мембраносвязанной фосфо-

липазы С. В результате последовательных реакций образуются два потен-

циальных вторичных мессенджера – диацилглицерол и инозитол-1,4,5-три-

фосфат.

Биологические эффекты этих вторичных мессенджеров реализуются

по-разному. Действие диацилглицерола, как и свободных ионов Са

опосредовано через мембраносвязанный Са-зависимый фермент протеин-

киназу С, которая катализирует фосфорилирование внутриклеточных

ферментов, изменяя их активность. Инозитол-1,4,5-трифосфат связывается

со специфическим рецептором на эндоплазматическом ретикулуме, способ-

ствуя выходу из него ионов Са

в цитозоль.

296

Таким образом, представленные данные о вторичных мессенджерах

свидетельствуют о том, что каждой из этих систем посредников гормональ-

ного эффекта соответствует определенный класс протеинкиназ, хотя нельзя

исключить возможности существования тесной связи между этими система-

ми. Активность протеинкиназ типа А регулируется цАМФ, протеин-

киназы G – цГМФ; Са

-кальмодулинзависимые протеинкиназы на-

ходятся

под

контролем внутриклеточной

[Са

протеинкиназа типа

С регулируется диацилглицеролом в синергизме со свободным Са

и кис-

лыми фосфолипидами. Повышение уровня какого-либо вторичного мес-

сенджера приводит к активации соответствующего класса протеинкиназ

и последующему фосфорилированию их белковых субстратов. В результате

меняется не только активность, но и регуляторные и каталитические

свойства многих ферментных систем клетки: ионных каналов, внутрикле-

точных структурных элементов и генетического аппарата.

Известно, что эффект стероидных гормонов реализуется через генетиче-

ский аппарат путем изменения экспрессии генов. Гормон после доставки

с белками крови в клетку проникает (путем диффузии) через плазматиче-

скую мембрану и далее через ядерную мембрану и связывается с внутри-

ядерным рецептором–белком. Комплекс стероид–белок затем связывается

с регуляторной областью ДНК, с так называемыми гормончувствительны-

ми элементами, способствуя транскрипции соответствующих структурных

генов, индукции синтеза белка de novo (см. главу 14) и изменению

метаболизма клетки в ответ на гормональный сигнал.

Следует подчеркнуть, что главной и отличительной особенностью моле-

кулярных механизмов действия двух основных классов гормонов является

то, что действие пептидных гормонов реализуется в основном путем

посттрансляционных (постсинтетических) модификаций белков в клетках,

в то время как стероидные гормоны (а также тиреоидные гормоны,

ретиноиды, витамин D

-гормоны) выступают в качестве регуляторов

экспрессии генов. Это обобщение, однако, не является абсолютным, и

здесь возможны модификации, рассмотренные при описании отдельных

гормонов.

297

Фосфатидил-инозитол

Фосфатидил-

инозитол-

киназа

Фосфатидил-инозитол-бисфосфат

Фосфолипаза С

Диацилглицерол

Инозитол-1,4,5-три-

фосфат

2АТФ

2АДФ

Глава 9

БИОМЕМБРАНЫ И БИОЭНЕРГЕТИКА

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ БИОМЕМБРАН

Все клетки отграничены друг от друга и от окружающей среды с помощью

специальной оболочки – клеточной мембраны. Со времен К. Негели, опи-

савшего в 1855 г. структуру мембран, окружающих живые клетки, пред-

ставления об устройстве и функциях мембран существенно обогатились.

Клеточная мембрана во многом определяет свойства, поведение и даже

форму клетки. Мембраны прокариот и эукариот различаются между собой

по составу и свойствам. Растительные и животные клетки также отличаются

друг от друга как по набору органелл, так и по свойствам мембран

(рис. 9.1).

Состав и строение биологических мембран. Биологические мембраны

состоят из белков и липидов. Углеводы присутствуют лишь в качестве

составных частей сложных белков (гликопротеинов) и сложных липидов

(гликолипидов). Нуклеиновые кислоты в небольшом количестве бывают

ассоциированы с мембранами, но в состав мембранных структур не

включаются. Вода составляет 20% от мембранного материала, а отноше-

ние белок/липид в зависимости от вида мембран колеблется от 0,25 (клетки

миелиновой оболочки) до 3,0 (митохондриальные мембраны).

Липиды мембран представлены четырьмя основными группами: фосфо-

липидами (основная доля), сфинголипидами, гликолипидами и стероидами.

Фосфолипиды – это сложные эфиры фосфатидной кислоты. Основными

фосфолипидами являются фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фос-

фатидилинозит и фосфатидилхолин. В состав фосфолипидов входят также

дифосфатидилглицерины (кардиолипин), плазмалогены (1-О-алкенил-2-О

ацилфосфолипиды) и диольные фосфолипиды. Сфинголипиды, которые

являются производными церамида и монофосфорных эфиров различных

спиртов, представлены в основном сфингомиелином. Гликолипиды – глико-

зильные производные церамида – представлены как нейтральными церебро-

зидами, так и их кислыми сульфоэфирами – сульфатидами. Производные

церамида и нейраминовой кислоты – ганглиозиды – часто выделяют в от-

дельную группу липидов – гликосфинголипиды. Стероиды представлены

холестерином (в мембранах животных клеток), ситостерином (в раститель-

ных клетках) и тетрахименином (обнаружен у тетрахимены).

Несмотря на различия в составе, все мембранные липиды построены по

единому плану и легко смешиваются друг с другом, образуя монослойные

или бислойные структуры (рис. 9.2). В этих структурах реализуется 2 типа

взаимодействий: ионные взаимодействия полярных «голов» и гидрофобные

взаимодействия жирнокислотных цепей. Благодаря этому мицеллы и липо-

сомы, создаваемые протяженными бислойными структурами, достаточно

стабильны в водном окружении.

В наружных (плазматических) мембранах животных клеток обнаружива-

ется большое количество холестерина (около 21 моль%), меньше – фос-

298

Рис. 9.1. Схематическое изображение животной (слева) и растительной (справа)

клетки.

фатидилэтаноламина и еще меньше фосфатидилхолина. Для внутриклеточ-

ных мембран основным компонентом является фосфатидилхолин, и соотно-

шение фосфатидилхолин/фосфатидилэтаноламин в них всегда больше 1.

Соотношение основных классов липидов мембран нейронов у различных

животных почти не подвержено изменениям. По-видимому, это соотноше-

ние сформировалось на самых ранних стадиях эволюции и обеспечивает как

стабильность липидного бислоя, так и возможность включения в него

белковых молекул. В то же время жирнокислотные компоненты мембран-

ных липидов сильно подвержены эволюционной и сезонной изменчивости.

Жирные кислоты, составляющие «хвост» липидных молекул, представ-

лены насыщенными

[от

лауриновой (С

)

до

лигноцериновой

(С

)]

нена-

сыщенными (мононенасыщенные пальмитоолеиновая и олеиновая; полине-

насыщенные линолевая, линоленовая, арахидоновая) кислотами. У высших

растений преобладают пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты,

а стеариновая почти не обнаруживается; в ряде случаев выявляются

оксикислоты. В мембранах животных клеток, кроме пальмитиновой и олеи-

новой, много стеариновой кислоты и больше высокомолекулярных жирных

кислот (содержат 20–24 углеродных фрагмента). Жирные кислоты, как

299

Клеточная стенка

Хлоропласт

Плазматическая

мембрана

Митохондрии

Эндоплаз-

матический

ретикулум

Ядро

Митохондрии

Аппарат

Гольджи

Вакуоль

(тонопласт)

Лизосома

10 мкм

Рис. 9.2. Химические формулы распространенных липидов биологических мембран.

1 - фосфатидилэтаноламин; 2 - фосфатидилсерин; 3 - фосфатидилинозит; 4 - фосфатидилхолин;

5 - кардиолипин; 6 - сфингомиелин; 7 - цереброзид; 8 - холестерин; 9 - расположение молекулы

холестерина между двумя молекулами фосфолипидов: а - наименее упорядоченная область

бислоя, б - область, упорядочиваемая холестерином, в - область полярных «голов». Красным

отмечены полярные области молекул.

правило, имеют четное число атомов углерода, но у цереброзидов и ган-

глиозидов встречаются и нечетные углеводородные остовы. У бактерий

полиненасыщенные жирные кислоты практически отсутствуют, но часто

имеются разветвленные окси- и циклопропансодержащие кислоты. Для

мембран термоацидофильных, галофильных и метанообразующих архебак-

терий характерно наличие нетипичных липидов, содержащих изопреноид-

300