Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

6,5] ФИЗИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

171

существу,

идентичны и

приводят к одинаковым следстви-

ям.

В рамках второго способа релаксационную стадию b

можно представить в виде

S + Е a SE — SE

z=r ЬЕ

(2)

^ ... ^ РЁ.

(6.11)

S + E

t2)

Естественно, результирующая константа к

представляет

собой

сугубо

эффективную величину.

Если

концентрация продукта Р превышает равновес-

ное

значение, то процесс протекает в обратном направле-

нии,

через

другие

неравновесные конформационные состо-

яния

(см. (6.10)), но все вышеприведенные рассуждения

остаются в силе. В условиях химического равновесия все

стадии становятся обратимым и схемы (6.9) и

(6.10)

объе-

диняются:

*-a

-d

S + E P + E

(

6.12)

I» 1 if j* fib"

„

—с'

-ь'

Отношения

концентраций свободных S и Р в равновесии

не

зависят от присутствия фермента. В то же время зна-

чения

констант скоростей^шеханических» стадий, вклю-

чающих конформационные изменения (т. е. к

, А_

, к

к-а, к

к_ъ>,

/c_d'),

должны уменьшаться по мере

приближения

системы к химическому равновесию. Для

настоящих механических систем равновесие означает

покой.

Для таких систем, как макромолекулы белка,

можно ожидать заметного замедления релаксационных

стадий. Действительно, в работе 1/6] было показано, что

условиях динамического окислительно-восстановитель-

ного равновесия не удается зарегистрировать конфор-

мационных

переходов

между

равновесными^формами окис-

ленного и восстановленного цитохрома с. Можно

думать,

что для большинства ферментативных процессов при

172 ФИЗИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

[ГЯ. 6

приближении

системы к условиям химического равновесия

релаксационные (и вообще «машинные») механизмы ката-

лиза перестают быть эффективными и заменяются обыч-

ными

химическими реакциями

субстрата

с каталитиче-

скими

группами активного центра, не требующими кон-

формационных

изменений и возникновения напряженных

кинетических неравновесных состояний, которые направ-

ленно

толкают систему вдоль координаты реакции. Хо-

рошо известно, что в клетке большинство ферментатив-

ных процессов реализуется в условиях, далеких от

химического равновесия (для данной реакции), и преиму-

щества «машинных» механизмов

могут

быть использованы

полной мере.

6.6.

ДИНАМИЧЕСКАЯ

МОДЕЛЬ

ДЕЙСТВИЯ

ФЕРМЕНТА

АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ

За

последние годы выполнено много исследований,

посвященных выяснению деталей механизма ряда кон-

кретных ферментативных процессов. Чем больше мы

узнаем, тем очевиднее становится механичность, машин-

ность,

работы ферментативных конструкций. В настоя-

щем параграфе

будут

рассмотрены результаты подобных

исследований одного из наиболее хорошо изученных

ферментативных процессов — переаминирования а-амино-

кислот, открытого еще в 1937 г. Браунштейном и

Криц-

ман

[77]:

Ri—С—СООН

+ R

—С—СООН ^ R

—C-COOH + R

—С—СООН.

II II I

О О NH

(6.13)

Эту реакцию катализируют аминотрансферазы

пиридо-

ксальфосфатом

(ПЛФ)

РОН

СН | ОН

N СНз

6.6]

МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЯ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ

173

качестве кофермента. Существенные результаты,

про-

ясняющие

механизм действия одного

из

таких

пи-

ридоксалевых ферментов

—

аспартатаминотрансферазы

(ААТ),

были получены

нескольких

ведущих

лаборато-

риях:

Браунштейна, Снелла, Хаммеса

и др.

Наше изло-

жение здесь основано

на

прекрасном обзоре Иванова

Карпейского

[78],

работы которых внесли определяющий

вклад

создание модели.

Даже

если

отдельные детали

будущие

исследования

внесут некоторые исправления,

можно

не

сомневаться

правильности общей картины

действия фермента, возникающей

на

основе проведенного

изучения.

модельной конгруэнтной реакции

ПЛФ

играет роль

временного акцептора аминогруппы, превращаясь

в пер-

вых стадиях реакции через альдимин

кетоимин

пири-

доксаминофосфат

(ПМФ):

к,—с—

соон

R— с—

соон

"\ /Р -и.о "\ I /

нн

к,—с;—соон

+ с . ' C=N у*" сн, . *•_

[ Т +11,0 I I " -Н,0

^A. " /*К. хА^

ПЛФ

Альдиммн

Кетоимин

Н„С—

NH,

R,—С— СООН

+ 1^

(6-14)

Затем ПМФ, взаимодействуя с соответствующей кетокис-

лотой R

—С—СООН, претерпевает те же превращения

обратном направлении и образует ПЛФ и аминокислоту,

ААТ катализирует реакцию

(6.14)

между

аспарагиновой

а-кетоглютаровой кислотами. Белок состоит из

двух

одинаковых субъединиц молекулярным весом по 45 000.

В исходном состоянии, когда кофермент находится в

форме ПЛФ, он образует альдиминную двойную связь

с e-NH

-rpynnofi одного из лизиновых остатков ААТ

(рис.

6.3). Однако в связывании белка с ПЛФ принимает

участие не только карбонильная группа последнего.

Было

показано, что все заместители пиридинового кольца

взаимодействуют с теми или иными белковыми группами.

Существенную роль в связывании кофермента играет,

174

ФИЗИКА.

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

[ГЛ. 6

по-видимому, фосфатная группа, находящаяся в форме

однозарядного аниона и взаимодействующая с одной из

катионных

групп белка.

Атом

азота пиридинового кольца

ПЛФ

акцептирует протон, по-видимому, от ОН-группы

тирозинового остатка белка и становится положительно

заряженным

(гибридизация sp

). Образовавшийся таким

фен

Рис.

6.3.

Пиридоксальфосфат

активном центре аспартатамино

трансферазы

(по

[78]).

Заштрихованные области соответствуют белку

—

апоферменту.

образом иминный азот взаимодействует с отрицательно

заряженным

кислородом (Z) тирозинового остатка (силь-

ная

водородная связь).

Имеются

убедительные доказательства существования

заметного ван-дер-ваальсовского взаимодействия метиль-

ной

группы ПЛФ с гидрофобным участком апофермента.

На

основании сильного понижения рК

оксигруппы ПЛФ

комплексе с ААТ по сравнению с рК

той же группы

свободном ПЛФ (рК„ 6,2 вместо 10,5), которое нельзя

объяснить только за счет протонирования атома N кольца,

можно прийти к выводу, что вблизи оксигруппы находится

положительно заряженная группа апофермента Х

. Воз-

можно,

этой группой является лизиновый остаток (см.

i 6.6] МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЯ

АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ

175

рис.

6.3). Таким образом, в равновесном стабильном

комплексе кофермента ПЛФ с ферментом взаимодействия

осуществляются с помощью

всех

способных к связыванию

групп ПЛФ («многоточечное связывание», однозначно

фиксирующее ПЛФ на белке). Если исходными реаген-

тами являются свободные ПЛФ и апофермент, то комплек-

сообразование приводит к такому конформационному

изменению белка, которое позволяет возникнуть всем

вышеперечисленным связям и одновременно химически

модифицирует кофермент (образование альдиминной кова-

лентной связи и перенос протона к

атому

азота пириди-

нового кольца).

Проследим теперь за отдельными стадиями фермента-

тивной реакции (6.13), начиная от свободного фермент-

субстратного комплекса (1 на рис. 6.4).

Субстрат

а-аминокислота (1-аспарагиновая кислота)

образует

ионный (аминогруппа свободной аминокислоты

протонизована, а карбонильная ионизована при физиоло-

гических значениях рН) комплекс 2. Противоионом для

аминогруппы

субстрата

служит

отрицательно заряженная

оксигруппа ПЛФ, а для карбонильной группы — один из

катионных центров белка. Следующим этапом должно быть

нуклеофильное присоединение аминогруппы

субстрата

двойной внутренней альдиминной связи C=N, соеди-

няющей карбонильную

группу

ПЛФ с лизиновым остат-

ком

апофермента. Для образования этой связи необходимо

выполнение

двух

условий: а) аминогруппа должна перей-

ти из заряженной (—NHJ) в нейтральную (—NH

) фор-

му, и б) расстояние

между

атомом азота аминогруппы и

атомом

углерода

альдиминной связи C=N должно умень-

шиться от 3,5 А (сумма ван-дер-ваальсовских радиусов

и N) до 1,5 А. Условие а) реализуется благодаря изме-

нениям

рК NHj-грушш

субстрата

и оксигруппы ПЛФ

при

комплексообразовании. Иванов и Карпейский пока-

зывают, что в фермент-субстратном комплексе должен

произойти перенос протона от —NHj-rpynnH

субстрата

на

—О~-группу

ПЛФ (3 на рис. 6.4). Исследование с по-

мощью молекулярных моделей показало, что условие

б) выполняется, если повернуть кофермент вокруг оси,

образованной группами

—СН

и фосфата, фиксированны-

ми

апоферментом (рис. 6.5). Для этого поворота нужно,

176

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

[ГЛ.

^Mr-Z —

X \j-

нэ8

-@о

а,

ев

О.

U—2 > /

:-г » /—

?•

х /

\ 9ъ

U=2+ > (Г

ос

/ЛЛ\ +

у—<(°°)

z—х—м

„

u=z ^—^

а;

i I

та

па

£0

Сч

о,

ев

В"

ис. 6.4

6.6] МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЯ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ 177

чтобы разорвались связи ПЛФ с белком через атом

азота пиридинового кольца и через оксигруппу. Послед-

няя

связь уже разорвана вследствие протонизации

груп-

пы

—О" (см. условие а)). Протонизация должна привести,

кроме того, к понижению основности атома азота кольца

и,

следовательно, к разрыву его водородной связи. Связь

ПЛФ

с лизином апофермента, однако, должна остаться,

Рис.

6.5.

Пространственная структура фермент-субстратного

ком-

плекса

3 (см. рис. 6.4) (по

[78]).

Стрелки указывают направления поворота

смещений

при

переходе

Заштрихованы участки, относящиеся

апоферменту.

превратившись в процессе нуклеофильного замещения

из

двойной в одинарную. Вероятно, именно конформацион-

ное релаксационное изменение, вызванное образованием

первоначального комплекса с субстратом, приводит к со-

ответствующему

смещению лизинового остатка и, следова-

тельно, к повороту плоскости кольца ПЛФ вокруг оси

метил — фосфат *). Все химические изменения, в том

числе нуклеофильное присоединение

субстрата,

проис-

ходят

в процессе этого конформационного превращения

(4 на рис. 6.4).

Затем должна образоваться двойная альдиминная

связь

между

карбонильным

углеродом

ПЛФ и'аминогруп-

пой

субстрата

с одновременным разрывом оставшейся

Это не

обсуждается

обзоре Иванова

Карпейского.

178 ФИЗИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

(ГЛ. 6

одинарной

связи

между

этим

углеродом

и аминогруппой

лизина

(5 и 6 на рис. 6.4). Возможно, конечно, что в фер-

ментативном процессе последние две стадии реализуются

ходе

конформационного превращения белка без фикса-

ции

состояний 5 и 6. Таким образом, образование альдими-

на

приводит к возникновению свободной аминогруппы

лизинового остатка апофермента в непосредственной бли-

зости от связи

—Н—.

Это способствует превращению

альдиминной|

группировки^ \C=N/" В кетоиминную

-—N=C

с передачей протона на лизиновый остаток

образованием карбаниона (7 на рис. 6.4). По всей

вероятности, именно взаимодействие с лизином приводит

к'конформационному

превращению, которое в свою оче-

редь вызывает обратный поворот плоскости кольца кофер-

мента вокруг оси метил — фосфат (это также не

обсуждалось

Ивановым

и Карпейским). В

результате

карбанион сбли-

жается с протондонорной группировкой YH апофермента

(вероятно,

YH представляет собой имидазол гистидино-

вого остатка), передающей протон на С" карбаниона

(8,

9 на рис. 6.4). Одновременно восстанавливается фик-

сация

кофермента на белке остальными связями. Осталь-

ные

стадии (состояния

10—12),

приводящие в конце концов

отделению кетокислоты и образованию ПМФ, очевидны

из

рис. 6.4. Вероятно, аминогруппа ПМФ поддерживается

нейтральной форме с низким значением рК (что необ-

ходимо для протекания второй половины процесса, начи-

нающейся

с взаимодействия ПМФ со вторым

субстратом

—

а-кетокислотой) благодаря присутствию поблизости от нее

сильных катионных групп апофермента, в том числе

—NHJ-группы

лизинового остатка (12 на рис. 6.4). Стадии

второй половины процесса повторяют в обратной последо-

вательности стадии первой его половины.

В обзоре Иванова и Карпейского, на основе которого

был рассмотрен механизм ферментативного переамини-

рования,

приведены не только более подробные описания

структурных

изменений, сопровождающих

каждую

ста-

дию, но и экспериментальные факты, подтверждающие

изложенные представления.

$ 6.7]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

179

Отметим, что две основные стадии процесса — нуклео-

фильное присоединение

субстрата

с образованием кова-

лентной связи и альдимин-кетоиминнаятаутомеризация,

идущая через стадию карбаниона *), реализуются благо-

даря вполне определенным конформационным превра-

щениям

макромолекулы,» обеспечивающим с исключи-

тельной точностью необходимые изменения ориентации

отдельных групп и расстояний

между

ними. Именно эти

механические стадии не позволяют подходить к описанию

объяснению ферментативного процесса с позиций клас-

сической газовой химической кинетики.

6.7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой

главе

предложены новые представления о

физи-

ческих механизмах элементарных актов в ферментативном

катализе. Из изложенного

ясно,

что проблема создания

количественной физической теории ферментативного ка-

тализа сводится к созданию количественной теории

кине-

тики

конформационной релаксации белковых макромо-

лекул

и их комплексов. Работа в этом направлении прак-

тически еще не начата.

Следует

помнить, что количественная физическая тео-

рия

(даже

если она

будет

создана) не может заменить су-

ществующие и в настоящее время широко используемые

(с моей точки зрения — необоснованно) полуколичест-

венные эмпирические подходы, основанные в конечном

счете

на уравнении

Аррениуса

и теории активированного

комплекса. Экспериментаторам необходимы простые со-

отношения типа уравнения

Аррениуса;

кроме того, нужно

найти параметры, характеризующие кинетику процесса

имеющие явный физический смысл. Поэтому еще более

важной задачей, нежели создание количественной

физи-

ческой теории конформационной релаксации белков,

является формулировка новых полуэмпирических соотно-

шений

и выбор новых параметров, которые, с одной сторо-

ны,

помогут

классифицировать и систематизировать ре-

зультаты

экспериментальных исследований и позволят

ставить кинетические эксперименты более осмысленно,

*) Именно эта стадия лимитирует скорость всего процесса пере-

аминирования.

180

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА [ГЛ. в

чем это делается теперь, а с

другой

—

будут

хоть

до ка-

кой-то

степени правильно отражать физическую природу

процессов,

протекающих при ферментативном катализе

биохимических реакций.

Вероятно, для создания таких полуэмпирических соот-

ношений

необходимы экспериментальные исследования

кинетики

ферментативных процессов, главным образом,

релаксационными

методами, позволяющими характери-

зовать реагирующую систему в неравновесных конформа-

циях

после мгновенного изменения условий (рН, темпе-

ратуры и т. д.).

Работы подобного типа сейчас проводятся на различных

ферментах.