Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ПЯТАЯ

136

данным на 2001 год, в странах ЕС три тысячи пациентов были госпитализированы с

диагнозом «анафилактический шок» вследствие иммунного ответа на пищевые аллер-

гены [Edler, 2003]. Следует также отметить, что не известно лекарственной терапии, по-

средством которой можно было бы излечиться от пищевой аллергии. Людям, стра-

дающим данным заболеванием, рекомендуется избегать пищевых продуктов, к кото-

рым они чувствительны. Таким образом, несмотря на относительную редкость, пище-

вая аллергия представляет собой совершенно определенную опасность для здоровья

человека и является одним из основных факторов риска при оценке безопасности ген-

но-инженерной деятельности.

Таблица 5.6

Пищевые аллергены растительного и животного происхождения (по Metkalfe et al., 1996)

Видовое название

растения или

животного

Традиционное

название

Аллерген (систематическое

и оригинальное название)

Молекулярный

вес kDa

Аллергены растительного происхождения

Arachis hypogea Арахис Ara h 1

Bertholletia ecscelsa Бразильский орех Ber e 1 (2S альбумин)

Brassica juncea Горчица листовая Braj 1; 2S альбумин

Sinapis alba Горчица белая Sin a 1 (2S albumin)

Glycine max Соя Глицинин (субъединица AlaBx, субъеди-

ница А2В1а, субъединица АЗВ4 и др.),

β-конглицинин (α-субъединица, субъеди-

ница CG4),

соевый лектин (соевый агглютинин),

ингибитор трипсина Куница (Kunitz)

Hordeum vulgare Ячмень Hor v 1; BMAI-1

(α-амилаза/ингибитор трипсина)

Oriza sativa Рис RAP (рисовый аллергенный белок),

RAG1 (рисовый аллерген 1)

Phaseolus vulgaris Фасоль PR-1 (белок, связанный с патогенезом – 1)

Triticum aestivum Пшеница мягкая WGA (зародышевый агглютинин A, D

пшеницы)

Triticum durum Пшеница твердая WGA (зародышевый агглютинин пшени-

цы)

Аллергены животного происхождения

Bos taurus Крупный рогатый BSA(бычий сывороточный альбумин),

скот β-лактоглобулин (белок молока),

α-лактальбумин (белок молока),

казеин (типы α-S1, α-S2, β-)

Gadus callaria Треска Gad c1; allergen M, β-парвальбумин 12

Gallus domesticus Домашние куры Gal d1 (овомукоид), 28

Gal d2 (овальбумин) 44

Gal d4 (лизоцим) 14

Metapenaeus ensis Креветки Met el; тропомиозин 34

5.9.4. Может ли генно-инженерная деятельность увеличить потребление аллер-

генных продуктов. Риск того, что в ряде новых продуктов питания (изготовленных из

ГИО, включающих ГИО или являющихся ГИО) может возрасти аллергенный потенци-

ал, в значительной степени обоснован. Диагноз пищевой аллергии ставят пациенту,

исходя из точной истории воспроизведения аллергических реакций при употреблении

определенных продуктов и отсутствия данных реакций при исключении этих продук-

тов из его рациона. Потенциальный риск аллергенности новых продуктов питания со-

стоит в том, что люди, чувствительные к аллергену – продукту трансгена, не смогут

идентифицировать данный провоцирующий аллергию компонент, если он будет

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

137

включен в целый ряд продуктов питания. В этом случае будет намного сложнее уста-

новить первопричину аллергической реакции, так как аллергию, вероятно, будут вы-

зывать не сходные пищевые источники аллергена [The Royal Society of Canada, 2001].

В процессе генно-инженерной модификации в исходный организм-хозяин вклю-

чаются один или несколько трансгенов, ответственных за продукцию очень неболь-

шой фракции (обычно менее 0,4%) белка относительно общего содержания белка ГИО.

Однако, как указывалось выше, этого может быть достаточно для развития пищевой

аллергии у чувствительных к ней людей. До настоящего времени не зафиксировано

случаев аллергических реакций у людей от употребления новых продуктов питания

или их трансгенных источников, высвобожденных для обращения на товарном рынке.

При этом все же существует определенная вероятность того, что в процессе генетиче-

ской модификации может быть увеличен аллергенный потенциал ГИО и соответст-

вующих новых продуктов питания. Теоретически такое увеличение аллергенного по-

тенциала новых продуктов питания может произойти вследствие двух событий [Lehrer,

2000]. Во-первых, экспрессия трансгенов, переданных исходному организму вследствие

генетической модификации, может привести к продукции не свойственных ему ранее

аллергенных белков (т.е. молекулярные продукты трансгенов могут быть аллергена-

ми). Во-вторых, вероятно, что природный аллергенный потенциал организма-хозяина

может быть увеличен вследствие непреднамеренных эффектов генетической модифи-

кации. Различные пищевые культуры, такие как арахис, авокадо, пшеница, характери-

зуются значительной вариабельностью количества аллергенов [Bush, Hefle, 1996], и их

уровень может подвергнуться дальнейшему изменению в результате генетической мо-

дификации. Кроме того, есть вероятность, что присущие организму-хозяину неаллер-

генные ранее белки после генетической трансформации станут аллергенными (на-

пример, вследствие гликозилирования).

Действительно, известно, что многие белковые аллергены обладают биологиче-

ской активностью, которая может найти применение в трансгенных организмах (мо-

жет быть целевым эффектом модификации). Например, многочисленные белки с по-

тенциальной антимикробной, антигрибной активностью являются известными аллер-

генами. Важные запасные белки семян многих двудольных растений – 2S альбумины

являются одновременно главными аллергенами горчицы, бразильского ореха, грецко-

го ореха, семян хлопчатника (см. табл. 5.6) [Shewry et al., 2001]. Известна попытка пере-

носа гена, ответственного за синтез 2S альбумина, от бразильского ореха растениям сои

с целью увеличения у нее содержания аминокислоты метионина и улучшения ее кор-

мовых качеств. Однако продуцируемый в трансгенных растениях сои 2S альбумин, со-

ставивший значительную часть от общего соевого белка (6%), оказался аллергенным

для чувствительных к бразильскому ореху людей [Nordlee et al., 1996]. И хотя этот сорт

трансгенной сои предназначался исключительно для кормления животных, он не был

допущен к коммерческому использованию. Данный пример весьма показателен в пла-

не того, что существует реальный риск переноса генов, отвечающих за продукцию ал-

лергенов, от организма-донора, обладающего аллергенным потенциалом, организму-

реципиенту. Более того, если вероятность привнесения известного аллергенного белка

в итоговый ГИО можно относительно просто проконтролировать (см. ниже), то слож-

нее оценить вероятный аллергенный потенциал новых для исходного организма

трансгенных белков, у которых не было длительной истории употребления в пищу

(например, GFP, Bt-протеина и др.). Вероятность неблагоприятного воздействия ГИД

на здоровье человека, обусловленного проявлением пищевой аллергии, потребовала

разработки специальных подходов для оценки риска аллергенности новых продуктов

питания.

ГЛАВА ПЯТАЯ

138

5.9.5. Оценка риска увеличения исходного аллергенного потенциала организмов

вследствие их генетической модификации. При оценке риска генно-инженерной дея-

тельности в соответствии с принципом существенной эквивалентности оценивается

риск того, что новые продукты питания не увеличили свой аллергенный потенциал по

сравнению с их аналогами, имевшими длительную историю безопасного употребле-

ния в пищу. Эксперты ряда международных организаций (ILCI –Allergy and

Immunology Institute; IFBC – International Food Biotechnology Council; FAO/WHO) раз-

работали систему оценки риска аллергенности новых продуктов питания и исходных

ГИО, включающую целый ряд анализов. Ниже мы приводим процедуру оценки аллер-

генности, принятую экспертами FAO/WHO [FAO/WHO, 2001]. При этом надо иметь в

виду, что процедура оценки аллергенности ГИО и новых продуктов питания (ее стан-

дарты) не является раз и навсегда данной. Она постоянно модифицируется междуна-

родными рабочими группами по пищевой аллергии с целью увеличения эффективно-

сти оценки риска [FAO/WHO, 2003].

Процедура оценки риска аллергенности ГИО и новых продуктов питания исхо-

дит из следующих положений. Во-первых, из того, что все новые для исходного орга-

низма белки – продукты трансгенов должны быть оценены с точки зрения их потенци-

альной аллергенности для человека. Это могут быть как белки с известным аллерген-

ным потенциалом, так и белки, которые ранее в пищу не употреблялись и аллерген-

ный потенциал которых не известен. Во-вторых, она исходит из необходимости оценки

риска увеличения аллергенности организма-хозяина вследствие НЭГМ. В-третьих, из

того, что не существует единого универсального теста для уверенной оценки уровня

аллергенности антигенов. Поэтому процедура должна предусматривать интегриро-

ванный, последовательный подход, рассматривающий каждый случай ГИО в отдель-

ности. Конечным выводом оценки риска должно быть заключение, является ли ново-

синтезируемый белок (белки) аллергеном, изменился ли аллергенный потенциал ГИО

и соответствующих продуктов вследствие непреднамеренных эффектов модифика-

ции.

Процедура оценки риска начинается с характеристики аллергенного потенциала

источника трансгенов (потенциальной аллергенности донорного организма). Протеин

– продукт трансгена, который никогда не вызывал аллергической реакции при упот-

реблении в пищу не будет с большой вероятностью вызывать ее и при экспрессии в

трансгенном организме. Например, трансгенный ферритин

, продуцирующийся в

генно-инженерном рисе с повышенным содержанием железа, – белок не аллергенный,

и данный ГИО не будет с большой вероятностью представлять риска аллергенности.

Напротив, велика вероятность того, что экспрессия аллергенного белка организма-

донора в ГИО увеличит аллергенный потенциал исходного организма-хозяина. На-

пример, продукция трансгенного 2S альбумина бразильских орехов в семенах сои сде-

лала ее аллергенным продуктом для людей, чувствительных к бразильскому ореху (но

не чувствительных ранее к сое и соевым продуктам) [Nordlee et al., 1996]. Исходя из

этого, на первом этапе оценки риска по имеющейся информации устанавливают: яв-

ляется ли источник трансгенов общепризнанным (главным) или минорным аллерге-

ном, или он не является известным аллергеном. Если

источник трансгена принадле-

жит к указанным выше восьми главным или 160 минорным аллергенным источникам,

то итоговый ГИО и соответствующие пищевые продукты признаются аллергенными,

пока не доказано обратное.

После установления аллергенного потенциала организма-донора следующим ша-

гом принятой процедуры является сравнение аминокислотной последовательности

всех новых белков – продуктов трансгенов из аллергенных и не аллергенных источни-

ков – с аминокислотной последовательностью уже известных аллергенов. В настоящее

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

139

время идентифицирована аминокислотная последовательность более 200 аллергенов и

созданы специальные компьютерные базы данных (Swiss Prot, TrEMBL, GenBank, PIR)

для сравнения структуры целевых белков ГИО и аллергенов. Цель сравнения амино-

кислотной последовательности – установление факта, является ли новосинтезируемый

белок сходным по структуре с известными аллергенами. Структурное сходство счита-

ется установленным, если обнаружена 35%-ная идентичность последовательностей

случайных фрагментов из 80 аминокислот или если обнаружена полная идентичность

6 последовательных аминокислот у сравниваемых белков (вероятный минимальный

линейный эпитоп) [FAO/WHO, 2001].

Позитивный результат структурного сравнительного анализа свидетельствует о

том, что оцениваемый белок является с большой вероятностью аллергеном и ГИО не

может высвобождаться для обращения на товарном рынке. Чтобы доказать обратное,

требуются дальнейшие специфические иммунологические исследования (см. ниже

Структурное сходство с известными аллергенами может рассматриваться как сущест-

венное и в случае менее чем 35%-ной идентичности сравниваемых белков, если испы-

туемый белок принадлежит к семействам белков, содержащим ряд известных аллерге-

нов. Примерами могут быть: липокалины, напины (2S альбумины семян), парвальбу-

мины и др. Если рассматриваемый белок принадлежит к таким семействам,

он с боль-

шой вероятностью может быть аллергеном для человека. Негативный результат струк-

турного анализа свидетельствует о том, что оцениваемый белок не относится к извест-

ным к настоящему времени аллергенам и не обладает перекрестной реактивностью с

известными аллергенами. При этом, однако, не исключается, что он может иметь ал-

лергенный потенциал (особенно если речь идет о белках, которые ранее в пищу нико-

гда не употреблялись, например о GFP).

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности имеет свои недос-

татки. В частности, он ограничен только сравнением с уже известными аллергенами,

внесенными в базы данных. Он не выявляет пространственные (не линейные) эпито-

пы, формирующиеся вследствие особенностей третичной структуры белка (к примеру,

аллерген Bet V3 березовой пыльцы содержит именно такие конформационные эпито-

пы). Напротив, определенные белки, гомологичные известным аллергенам, сами по

себе аллергенами не являются. Например, главный аллерген креветок (тропомиозин) –

белок, который присутствует во многих других продуктах питания, таких как говяди-

на, свинина и мясо кур. Тропомиозин из перечисленных источников обладает 60%-ной

гомологией с соответствующим белком креветок. При этом названные продукты не от-

носятся к аллергенным [Lehrer et al., 1996].

Кроме сравнительного анализа аминокислотной последовательности на первых

этапах исследования проводится также физико-химический тест на устойчивость про-

веряемых белков к протеазам желудочно-кишечного тракта (тест на разрушение пеп-

сином). Выше уже отмечалось, что аллергенами являются белки,

в основном устойчи-

вые к разрушению реагентами желудочно-кишечного тракта (иначе они не могут дос-

тигнуть в нативном состоянии реактивных тучных клеток слизистой кишечника).

Стандартная процедура оценки протеолитической активности пепсина предусматри-

вает обработку целевого белка раствором пепсина [FAO/WHO, 2001]. Негативный ре-

зультат теста говорит о том, что исследуемый белок лишь с небольшой (но

требующей

внимания) вероятностью может являться аллергеном. Напротив, устойчивость оцени-

ваемых белков к разрушению пепсином в подходящих условиях показывает, что они

могут быть аллергенами. Оценки ряда физико-химических характеристик белков –

продуктов трансгенов, часто используемых для модификации различных организмов,

представлены в таблице 5.7.

ГЛАВА ПЯТАЯ

140

В совокупности предварительные непрямые тесты на аллергенность позволяют с

определенной вероятностью судить о том, является ли оцениваемый белок аллергеном.

Положительный результат свидетельствует о том, что с большой вероятностью тести-

руемые белки могут быть аллергенными (но это не обязательно так).

Отрицательный результат непрямых тестов не является абсолютным доказатель-

ством того, что тестируемые белки не обладают аллергенным потенциалом. Поэтому

после предварительной характеристики структурных и физико-химических особенно-

стей исследуемых белков процедура оценки риска обычно продолжается. Она преду-

сматривает проведение специфических иммунологических исследований, оконча-

тельно устанавливающих, являются ли тестируемые белки аллергенами. Для белков,

ведущих свое происхождение из известных аллергенных источников или имеющих

структурную гомологию с известными аллергенами, процедура оценки риска реко-

мендует проведение так называемого специфического сывороточного скрининга. Это

тесты in vitro на реактивность трансгенного белка со специфическими IgE из сыворот-

ки крови людей, чувствительных к белкам организма-донора (из ДНК которого выде-

лен трансген). Данные исследования показывают, распознаются ли анализируемые

белки антителами IgE из сыворотки крови людей, чувствительных к аллергенам доно-

ра. Анализ in vitro может установить факт присутствия и количество аллергенного бел-

ка в исследуемых продуктах питания и в определенной степени показать изменение

аллергенных свойств белка. Стандартными, применяемыми для иммунологических

исследований in vitro являются тесты твердофазной иммунологической диагностики –

радиоаллергосорбентный анализ (RAST) и ферментный иммуносорбентный анализ

(ELISA). Например, в случае теста RAST сыворотка чувствительных индивидов инку-

бируется с испытуемым потенциальным аллергеном (экстрактом пищевых продуктов),

закрепленным на подходящем твердофазном носителе. Аллерген-специфичные IgE

связываются с закрепленным на носителе аллергеном и могут определяться при ис-

пользовании меченных радиоактивным йодом антител против IgE человека [OECD,

1997].

Таблица 5.7

Физико-химические характеристики белков–продуктов некоторых трансгенов

Время переваривания

Белок

дена-

тура-

ции

Темпера-

тура

денату-

рации

Концентрация

в тканях

в желудочном

соке

в дуоденаль-

ном соке

NPT II Картофель (клубни) – 2,7 мкг/г

Хлопок (семена) – 7 мкг/г

50% – менее 10 с

100% –20 мин

50% –

2–5 мин

EPSPS 5 65°C в

течение

15 мин

Хлопок (семена) – 60–70 мкг/г 50% – менее 15с 50% – менее

10 мин

PAT 4 75°C 1 мин

при рН4 – 10 мин

CP PVY Менее 2 мкг/г (в 12–244 раза ниже

естественного уровня)

CRY I

A(b)

Кукуруза:

во время цветения – 8–16 г/га

в конце вегетации – менее 0,8 г/га

90% в течение 2

мин

Разведение:

1:1000 – 10мин

1:100 – 5 мин

Не перева-

ривается

CRY IIIA Картофель: листья –20–63 мкг/г

клубни – 0,2–0,6 мкг/г

Примечание. рН желудочного сока равна 1,0, дуоденального – 7,5. 50% поглощенной твердой пищи пере-

ходит из желудка в тонкий кишечник в течение 2 ч, жидкой – в течение 25 мин. Общая продолжитель-

ность нахождения пиши в желудочно-кишечном тракте от 4–10 ч до 68–165 ч.

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

141

Для получения достоверных оценок риска в тестах in vitro критической является

доступность сыворотки крови достаточного количества индивидов, чувствительных к

определенному аллергену. Анализ по возможности должен проводиться с 25 пробами

сыворотки людей, страдающих пищевой аллергией. Испытания с использованием ми-

нимум восьми соответствующих сывороток необходимы для достижения 99%-ной дос-

товерности того, что испытуемый белок не является главным аллергеном. Соответст-

венно 24 сыворотки необходимы для достижения такой же достоверности в случае ми-

норных аллергенов. При наличии по крайней мере 14 индивидуальных сывороток не-

гативный результат специфического сывороточного скрининга с вероятностью более

99,9% свидетельствует о том, что испытуемый белок не относится к главным аллерге-

нам. В аналогичных условиях негативный результат с вероятностью более 95% свиде-

тельствует о том, что испытуемый белок не относится к минорным аллергенам, вызы-

вающим аллергическую реакцию, по крайней мере, у 20% чувствительных индивидов

[FAO/WHO, 2001; Metcalfe et al., 1996; Taylor, 2000]. Если тест in vitro дает положитель-

ный результат, ГИО или соответствующий продукт признаются аллергенными. При

негативном результате теста (в совокупности с данными об отсутствии структурной

гомологии испытуемого белка с известными аллергенами и отсутствии устойчивости к

протеазам желудочно-кишечного тракта) трансгенный белок с большой вероятностью

не является аллергеном.

Если трансген не был выделен из известного аллергенного источника и не было

установлено гомологии последовательности аминокислот тестируемого белка и из-

вестных аллергенов, это еще не свидетельствует окончательно о том, что трансгенный

белок не является аллергеном. Возможно, что в имеющихся базах данных на момент

испытаний отсутствует информация о структурно сходных с ним аллергенах. В этом

случае иммунологические тесты in vitro рекомендуется проводить с привлечением сы-

воротки людей, чувствительных к аллергенам, из сходных источников (так называемый

целевой сывороточный скрининг). Например, при тестировании белка однодольных

растений, не являющегося известным аллергеном, в тестах RAST, ELISA могут быть ис-

пользованы сыворотки людей, чувствительных к травам, рису и т.д. В случае анализа

трансгенного белка двудольных растений к использованию рекомендуются образцы

сывороток пациентов с высоким содержанием IgE против аллергенов двудольных рас-

тений (пыльцы деревьев, арахиса, древесных орехов и т.д.). Обычно для целевого скри-

нинга используют 25 индивидуальных сывороток с высоким содержанием IgE к вы-

бранной группе респираторных аллергенов и, если возможно, 25 сывороток с IgE к вы-

бранной группе пищевых аллергенов [FAO/WHO, 2001]. Положительный результат

целевого сывороточного скрининга свидетельствует о том, что трансгенный белок с

большой вероятностью является аллергеном. Негативный результат целевого сыворо-

точного скрининга (в совокупности с отсутствием устойчивости к протеазам, отсутст-

вием гомологии с известными аллергенами) свидетельствует о том, что тестируемый

белок с большой вероятностью не является аллергеном.

В случае, когда источник трансгенов – известный аллерген, негативный результат

иммунологического теста in vitro может быть недостаточным для того, чтобы сделать

заключение об отсутствии аллергенного потенциала у продукта трансгена. В основном

это относится к случаям, когда источник трансгена – организм, содержащий минорные

аллергены, которые вызывают аллергию менее чем у 20% чувствительных индивидов.

При этом зачастую бывает недоступно необходимое количество сывороток крови ин-

дивидов, содержащих IgE к таким аллергенам, и соответственно результат теста in vitro

не убедителен. В подобных обстоятельствах процедура предусматривает возможность

дополнительного иммунологического исследования in vivo на модельных животных

или с привлечением пациентов-добровольцев. Известно, что разработанные к настоя-

ГЛАВА ПЯТАЯ

142

щему времени модели на животных далеко не всегда дают адекватные оценки аллер-

генности тех или иных антигенов по отношению к человеку. В то же время использо-

вание клинических испытаний с участием добровольцев, чувствительных к пищевым

аллергенам организма – донора трансгенов (за исключением людей, подверженных

системным реакциям), осложнено этическими соображениями. Однако в отдельных

случаях такие испытания необходимы и осуществляются.

В случае клинического анализа аллергенности трансгенных белков in vivo обычно

используется кожный тест (SPT – skin prick test). Экстракты нужной концентрации, вы-

деленные из организма-реципиента, донора и ГИО (пищевых продуктов, полученных

на их основе), вводятся в эпидермальный слой кожи чувствительных индивидов. В те-

чение 15 минут после введения регистрируется локальная аллергическая реакция,

проявляющаяся покраснением тестовой зоны (наподобие следа от укуса комара). Если

реакции за этот промежуток времени не наблюдается, испытуемые продукты с боль-

шой вероятностью не содержат пищевых аллергенов. Критическим для данного мето-

да является изготовление экстрактов с адекватным содержанием потенциального ал-

лергена. На результаты SPT также оказывают влияние способы приготовления испы-

туемых продуктов (например, нагревание может как разрушить, так и создать новые

антигенные детерминанты у аллергена) [IFIC, 2001].

Если это необходимо и есть добровольцы, на

конечной стадии оценки риска может применяться

более чувствительный иммунологический тест–

DBPCFC (double-blind placebo-controlled food

challenge). Для проведения теста отбираются люди

с известной чувствительностью к пищевым аллер-

генам и позитивной реакцией на SPT. В дозирован-

ный рацион испытуемых «скрытно» включают

предполагаемую аллергенную пищу в повышаю-

щихся концентрациях, чтобы окончательно выяс-

нить, содержит ли анализируемая пища аллергены,

вызывающие реакцию. В качестве контроля в такой

же рацион включают сходные продукты, не содер-

жащие потенциального аллергена (placebo). Дан-

ные наблюдений за пациентами, получающими

потенциальный аллерген и placebo, кодируются

(так, чтобы ожидание реакции у пациента и (или)

врача не повлияло на результат анализа). Пациен-

ты получают повышающуюся дозу потенциального

аллергена до регистрации объективных аллергиче-

ских симптомов. Определяется минимальная, провоцирующая реакцию доза аллерге-

на. В таблице 5.8 приведены стандартные повышающиеся дозы испытуемого антигена.

Тест DBPCFC – наиболее точный для подтверждения аллергенности того или иного

вещества, но при этом и наиболее трудно осуществимый на практике, так как он тре-

бует прежде всего наличия добровольцев.

Процедура оценки потенциальной аллергенности более проста и надежна, если

аллергенный потенциал рассматриваемых белков – продуктов трансгенов уже известен

ко времени испытаний. В этой ситуации доступна сыворотка чувствительных индиви-

дов для специфического скрининга in vitro – метода с хорошей доказательной базой.

Гораздо сложнее проводить оценку трансгенных белков, если они не имели истории

употребления в пищу и соответственно нет никакой информации об их аллергенном

потенциале. В данном случае сыворотки крови людей, содержащие специфические к

Таблица 5.8

Пример стандартной дозировки

потенциального аллергена

(земляные орехи) в испытании in vivo

(DBPCFC)

Группы

наблюдаемых

пациентов

(№)

Дозировка

протеина

арахиса,

мкг

1 30

2 100

3 300

4 1 000 = 1 мг

5 3 000

6 10 000

7 30 000

8 100 000

9 300 000

10 1 000 000 = 1 г

Пример показан в докладе L. Edler

(2003).

Проводятся два раздельных испыта-

ния – в дози

овках 1–7 и 6–10.

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

143

испытуемому белку IgE, недоступны. На первый план здесь выходят указанные выше

непрямые методы оценки потенциальной аллергенности: сравнительный анализ ами-

нокислотной последовательности испытуемых белков с известными аллергенами и их

физико-химическая характеристика. При этом к результатам таких испытаний, не яв-

ляющихся собственно иммунологическими, следует относиться с определенной осто-

рожностью. Обычно для «новых» с точки зрения питания человека белков производит-

ся полная процедура оценки риска, в том числе иммунологические испытания на доб-

ровольцах. Практический пример такой последовательной оценки «нового» пищевого

белка показан на рисунке 5.4 [Astwood et al., 1996, цит. по Taylor, 2000].

Отказ от использования

или маркировка

Есть

еакция

Есть

еакция

Гены перенесены из

аллергенного

источника

Гены перенесены

из не

аллергенного

источника

Лабораторные тесты:

RAST

ELISA

Нет

реакции

Нет

реакции

Кожный тест на

добровольцах

Испытание

DBPCFC с

привлечением

пациентов

добровольцев

Рассматривается:

сходство с известными аллергенами;

устойчивость к перевариванию;

характеристики переработки;

место в пищевом рационе;

сходство с безопасными белками.

Одобрено для

помещения на рынок

Есть

еакция

Нет

реакции

Рис. 5.4. Оценка потенциальной аллергенности продуктов питания, изготовленных из генетически мо-

дифицированного исходного сырья (практический пример из работы Astwood et al. [1996])

Генетическая модификация, как уже говорилось выше, вследствие непреднаме-

ренных (плейотропных) эффектов может увеличить аллергенный потенциал исходно-

го организма-хозяина. Процедура оценки риска должна предусматривать и такую воз-

можность качественного и количественного изменения исходного состава аллергенов

организма-реципиента. Прежде всего, в данном случае важнейшее значение имеет

предварительный анализ существенной эквивалентности, оценивающий, насколько

ГИО эквивалентен исходному организму (см. раздел 5.5). В случае доказательства неэк-

вивалентности ГИО аналогу по существенным признакам (обусловленной не только

продукцией новых трансгенных белков) должны применяться методы оценки аллер-

генности, адекватные для идентификации НЭГМ. В принципе выявить непреднаме-

ренные эффекты генетической модификации возможно с помощью методов иммуно-

логического твердофазного анализа in vitro и DBPCFC, так как они дают количествен-

ную оценку уровня аллергенности продукта. При этом для оценки изменения аллер-

генного потенциала организма-реципиента иммунологическая аллергическая реакция

измеряется в ответ на смесь (экстракт) белков ГИО (а не на выделенный отдельный

продукт трансгена).

Ниже приводятся основные характеристики предложенной процедуры оценки

аллергенности новых продуктов питания и ГИО и выводы из возможных ее результа-

тов [FAO/WHO, 2001].

ГЛАВА ПЯТАЯ

144

• Комбинация тестов, включающих тесты с привлечением людей, подверженных

аллергии, или их сывороток крови, обеспечивает высокий уровень достоверности того,

что главные аллергены не появятся в новых продуктах питания вследствие генетиче-

ской модификации исходного материала. Принятая процедура допускает небольшую

вероятность появления в данных продуктах минорных аллергенов, действующих на

ограниченное число людей.

• Любой позитивный результат, полученный в системе иммунологических тестов,

с большой вероятностью свидетельствует об аллергенности нового белка – продукта

трансгена.

• Новый для организма-хозяина белок, не имеющий сходства аминокислотной

последовательности с известными аллергенами или происходящий из неаллергенного

источника и не связывающийся с IgE из сывороток чувствительных людей (>5 сыворо-

ток), но при этом стабильный к

перевариванию в желудочно-кишечном тракте и к пе-

реработке, должен рассматриваться как потенциальный аллерген. Дальнейшие иссле-

дования должны предприниматься для преодоления такой неопределенности.

• Новый для организма-хозяина белок, не имеющий сходства аминокислотной

последовательности с известными аллергенами и не устойчивый к перевариванию в

желудочно-кишечном тракте и к переработке, с высокой

вероятностью не является ал-

лергеном. Сходным образом новый белок, происходящий из неаллергенного источни-

ка и не связывающийся с IgE из сывороток чувствительных людей (> 5, но < 14 сыворо-

ток), с высокой вероятностью не будет аллергенным.

Описанная выше процедура оценки аллергенного потенциала ГИО и новых про-

дуктов питания представлена на рисунке 5.5.

Является ли организм-источник трансгенов

аллергенным?

А НЕТ

Осуществляется твердофазное

иммунологическое тестирование in vitro

(специфический сывороточный скрининг).

Результат скрининга позитивный?

Есть ли сходство в аминокислотной

последовательности оцениваемого

белка и известных аллергенов?

Результат кожной пробы

позитивный?

А НЕТ

ДА НЕТ

Результат DBPCFC

позитивный?

А НЕТ

БЕЛОК АЛЛЕРГЕННЫЙ

Является ли белок ГИО

устойчивым к перевариванию и

переработке?

А НЕТ

потенциальный

аллерген

Нет

доказательств

его

аллергенности

БЕЛОК НЕ АЛЛЕРГЕННЫЙ

Рис. 5.5. Оценка риска аллергенности пищевых продуктов, изготовленных из ГИО, являющихся ГИО,

содержащих ГИО. Последовательность тестов и решений, предложенная экспертами FAO/WHO [2001]

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

145

Разработанные и действующие в разных странах системы оценки аллергенности

ГИО и соответствующих продуктов питания (которые не отличаются принципиально

друг от друга) хорошо себя зарекомендовали. Широко известный пример, когда в ре-

зультате оценки риска было выявлено изменение аллергенного потенциала кормовой

сои (вследствие продукции в генно-инженерной сое трансгенного 2S альбумина бра-

зильского ореха), уже приводился выше. Другим характерным примером эффективно-

сти предложенной системы оценки риска аллергенности служит оценка инсектицид-

ного белка (Bt-протеина) – продукта трансгена Сгу9С, синтезирующегося в модифи-

цированной кукурузе [USEPA, 1999, цит. по Kuiper et al., 2001]. Bt-протеин не являлся

традиционным пищевым белком, и его аллергенный потенциал как пищевого белка не

был известен. Поэтому, хотя более 30 лет он использовался в качестве микробиологиче-

ского инсектицидного препарата и никаких указаний на его аллергенность не было

получено, для масштабного высвобождения генно-инженерной кукурузы требовалось

проведение полной процедуры оценки его аллергенности. Сравнение аминокислот-

ной последовательности не выявило структурной гомологии Bt-протеина с известными

пищевыми аллергенами. Возможности проведения специфического иммунологическо-

го анализа были ограничены из-за отсутствия сывороток крови людей, чувствительных

к Bt-протеину. Исследование на модельных животных дало противоречивые результа-

ты, хотя отмечалось, что оцениваемый белок провоцирует в ряде случаев иммунный

ответ. Физико-химические характеристики протеина Сгу9С показали его относитель-

ную устойчивость к перевариванию в желудочно-кишечном тракте и определенную

термостабильность. В дополнение молекулярный вес белка (68,7 kDa) соответствовал

верхней границе варьирования, характерного для известных аллергенов. На основа-

нии двух позитивных биохимических характеристик, указывающих на потенциальную

аллергенность протеина Сгу9С, соответствующая трансгенная кукуруза была запре-

щена для коммерческого производства как в качестве продукта питания человека, так

и в качестве кормовой культуры. Причем оценка сходных эндотоксинов (продуктов

трансгенов Cry 1 А, СгуЗ А) не выявила биохимических и иных характеристик, прису-

щих аллергенам. Соответствующие генно-инженерные растительные культуры зани-

мают в настоящее время значительные посевные площади в США и Канаде [Stewart et

al., 2000]. Ни один поступивший до настоящего времени на товарный рынок продукт

питания, изготовленный из ГИО, не представляет большей опасности аллергенности

для человека, чем его традиционные аналоги. При этом, как уже говорилось выше, по-

стоянно продолжается работа по оптимизации предложенной процедуры оценки ал-

лергенности и выработки единых международных стандартов оценки.

5.10. Риск, обусловленный возможностью горизонтального

переноса маркерных генов устойчивости к антибиотикам

Используемые для создания генно-инженерных организмов методы генетической

трансформации (будь то агробактериальная трансформация, бомбардировка микро-

частицами с закрепленными на них фрагментами ДНК, микроинъекция и др.) относи-

тельно малоэффективны. Чтобы отобрать в общей массе единичные трансформиро-

ванные клетки, в трансгенную молекулярную конструкцию кроме целевого гена

обычно включают селективный маркерный ген (см. главу 2). Экспрессия маркерного

гена позволяет делиться трансформированным клеткам в присутствии антипролифе-

ративного селективного агента; небольшое число трансформированных клеток стано-

вятся легко доступными для отбора среди большой популяции нетрансформирован-

ных клеток. В качестве таких агентов наиболее часто используются антибиотики и гер-

бициды, а в качестве селективных маркерных генов – гены устойчивости к антибиоти-

кам и гербицидам (таблица 5.9).