Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 381

прочно

связывающийся конкурентный ингибитор L-бензилсук-

цинат.

Этот ингибитор не вытеснял из фермента циннамоильный

остаток, указывая на то, что последний связан ковалентно.

Имеются

данные, что это ковалентное промежуточное соедине-

ние

является ангидридом кислоты: при частичной денатурации

ацилфермента мочевиной происходит деацилирование с кон-

стантой скорости, отвечающей гидролизу ангидрида кислоты.

Результаты

другого

недавно проведенного эксперимента, в

котором исследовался изотопный обмен [124], свидетельствова-

ли

против образования ацилфермента. Если гидролиз протекает

по

схеме

(12.25)

(с образованием ангидрида), то для синтеза

пептида в

ходе

обратной реакции необходимо предварительное

образование ангидрида из фермента и RCOJ. Следовательно,

фермент должен обладать способностью катализировать обмен

между

субстратом и водой [схема (12.27)]. Однако без

+E—COJ

~Y Е—CO

OCR т— RCO

CT + Е—COJ

'«о

(1227)

добавления свободной аминокислоты

ЫНЗСН(Д')СОГ

обмена не

происходит, он имеет место лишь в ее присутствии в

результате

синтеза пептида в

ходе

обратной реакции. Обмен не стимулиру-

ется аналогом указанной кислотыHOCH(R')CO2. Все эти дан-

ные

исключают возможность протекания реакции через образо-

вание ангидрида, если только не предположить, что добавляе-

мая

аминокислота (но не ее гидроксилсодержащий аналог)

является активатором реакции обмена или высвобождающаяся

ходе

реакции

(12.27)

Нг

О не обменивается со средой, оста-

ваясь связанной с ферментом. Все сказанное выше вместе с

данными

о том, что метанол не может заменить

воду

в реакции

сольватации, привели к механизму, представленному на стр. 382

[124].

Этот механизм объясняет неспособность метанола заменить

воду,

поскольку промежуточное соединение III имеет два отри-

цательно заряженных атома кислорода. Гидроксильная группа

Туг-248,

вероятно, выступает в роли «мостика» при переносе

протона от гидроксильной группы тетраэдрического промежу-

точного соединения II на атом азота.

Возможно, результаты описанных экспериментов и не проти-

воречат

друг

другу.

Имея в виду упоминавшиеся ранее данные

том, что химическая модификация фермента или вытеснение

иона

металла по-разному сказываются на активности эстеразы

пептидазы, можно предположить, что гидролиз эфира корич-

ной

кислоты протекает через образование ацилфермента,

тогда

382

ГЛАВА

О"

R—С—NHCH(R')CO

•

R—С—NHCH(R')CO2

(Tyr-248?)

О"

ОН

(Glu-270)—С. (Glu-270)—С

(12.28)

iv 4

III

6" 6"

R—С

+NH

CH(R')COT

R-C—NH;CH(R')CO

О О" НО

(Tyr-248?)-

как

гидролиз пептидов

— по

механизму общего основного ката-

лиза,

котором роль катализатора выполняет остаток Glu-270.

в.

Зимоген

Прокарбоксипептидаза

активируется

при

отщеплении

помощью трипсина около

аминокислотных остатков

N-конца

полипептидной цепи [125]. Этот зимоген

обладает

довольно

высокой каталитической активностью. Проявляя способность

гидролизовать небольшие эфиры

пептиды

[126, 127],

прокар-

боксипептидаза отщепляет

от

лизоцима С-концевой лейцин

только

семь

раз

медленнее,

чем

карбоксипептидаза. Зимоген

гидролизует

также бензоил-Gly-L-Phe

= 3 c

-1

и Км =

2,7 мМ

(соответствующие величины

для

фермента равны

120

с"

и 1,9 мМ)

[126].

отличие

от

химотрипсина

прокар-

боксипептидазе, несомненно, имеется центр связывания

ката-

литический аппарат практически полностью сформирован.

4. Кислые протеазы

[128—130]

Кислые протеазы названы

так

потому,

что

функционируют

при

низком

рН.

Наиболее известный представитель этой

груп-

пы

—

пепсин, первый

из

ферментов, получивший наименование

(Шванн,

1825 г.). К

этой

же

группе относятся химозин (реннин),

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 383

катепсин D,

Rhizopus-пепсш

(выделенный из

Rhizopus

chinensis)

и пенициллопепсин (выделенный из

Penicillium

janthinellum).

Гомологичны

между

собой пепсин, химозин и

пенициллопепсин [131, 132]. Определена

структура

нескольких

ферментов, но лишь при низком разрешении [133, 134]. Правда,

недавно

структура

пепсина уточнена с разрешением 2,7 А

[135], а

структура

пенициллопепсина [136] —с разрешением

2,8 А. О механизме действия пепсина и пенициллопепсина из-

вестно гораздо меньше, чем о механизме действия любой дру-

гой кислой протеазы; нет

даже

никакой простой химической

модели, которая могла бы

служить

руководством при исследо-

вании.

Рассмотренные ниже данные относятся к обоим фер-

ментам, близким по

структуре

и по своим кинетическим свой-

ствам.

а.

Пепсин

Пепсин,

мол. вес которого равен 34 644, состоит из един-

ственной полипептидной цепи, содержащей 327 аминокислотных

остатков [137, 138].

Ser-68

фосфорилирован, однако удаление

фосфата не приводит к существенным изменениям каталитиче-

ских свойств фермента [139]. Как и у

других

кислых протеаз,

активный центр пепсина занимает обширную область, в которую

может поместиться по крайней мере четыре-пять, а возможно, и

до семи остатков молекулы

субстрата

[140, 141]. Наиболее

благоприятной для функционирования пепсина является такая

ситуация, когда по обе стороны от расщепляемой связи нахо-

дятся гидрофобные аминокислоты. Статистический анализ про-

цесса расщепления связей в белках показывает, что подцентр

Si специфичен к лейцину, фенилаланину, триптофану и

глутама-

ту (!), а подцентр Si — к триптофану, тирозину, изолейцину и

фенилаланину [141]. Пепсин, как правило, негидролизует эфи-

ры;

исключение составляют эфиры L-p-фенилмолочной кислоты

некоторые эфиры сернистой кислоты.

Механизм

действия

пепсина.

Пепсин имеет два катали-

тически активных остатка —

Asp-32

Asp-215.

Их ионизацию

можно исследовать, воспользовавшись рН-зависимостью актив-

ности фермента, оптимум которой находится при рН 2—3 и

определяется ионизацией кислой формы группы с рК

~ 4,5 и

основной формы группы с р/Са — 1,1 [142, 143]. Значения рКа

идентифицированы с помощью опытов по связыванию необрати-

мых ингибиторов, способных специфически взаимодействовать с

ионизированными

или неионизированными карбоксильными

группами. Диазосоединения типа метилового эфира N-диазоа-

цетил-Ь-фенилаланина, взаимодействующие с неионизирован-

ными

карбоксильными группами, специфически

реагируют

384

ГЛАВА

Asp-215

вплоть до рН ~ 5 [уравнение

(12.29)]

[144—146]:

(Asp-215)—CO

H +

CHCONHCH(Ph)CO

—•

—>

(Asp-215)—CO

CONHCH(Ph)CO

Me + N».

(12.29)

Эпоксиды,

специфически реагирующие с ионизируемыми кар-

боксильными

группами, модифицируют

Asp-32

[уравнение

(12.30)]. рН-зависимость скорости модификации показывает,

что рКа этого остатка менее 3 [147].

(Asp-32)—СО," +

СН

—CHR

—• (Asp-32)—CO

CHR.

(12.30)

\/ 1

О ОН

Исследование кристаллической структуры фермента при вы-

соком

разрешении показывает, что карбоксильные группы

двух

указанных остатков аспарагиновой кислоты связаны

друг

другом

водородной связью [145, 146]. Аналогичная картина

имеет место при ионизации малеиновой кислоты, имеющей рК

1,9 и 6,2:

НС

Н(

,н

НС

НС.

О"

л.

НС

О"

(12.31)

не

Любой предлагаемый механизм действия пепсина должен

объяснять тот факт, что во время реакции образуется как ами-

«офермент, так и

ацилфермент.

Впервые предположение об об-

разовании

аминофермента было высказано около 20 лет назад,

когда выяснилось, что пепсин катализирует не только гидролиз,

но

и транспептидацию [148]. При гидролизе Cbz-Glu-Tyr

образуются такие соединения, как Cbz-Glu-Tyr-Tyr и

Туг-Туг.

Проще

всего объяснить этот факт, предположив, что происходит

образование аминофермента

Е—NHR

и что это приводит к пе-

реносу аминогруппы на свободную карбоксильную группу при

синтезе нового пептида. Данная гипотеза подтверждается ре-

зультатами недавно проведенных экспериментов по определе-

нию

соотношения

между

продуктами, в которых один амино-

фермент мог образоваться из нескольких субстратов [схема

(12.32)]

[149—150]. (Далее мы

всюду

через NH-Tyr

будем

обозначать тирозин, связанный с другим остатком через

NH-rpynny,

а через Leu-CO — лейцин, связанный через карбок-

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

386

сильную группу.

Е—ОН + RCO—(NH-Tyr) —>

R'CO

Е—ОН + R'CO— (NH-Tyr)

Е—(NH-Tyr) — н

(12.32)

Е—ОН + NH

-Tyr

R'CO

Предположение об образовании ацилфермента как проме-

жуточного соединения было высказано в 1962 г., когда выясни-

лось, что пепсин катализирует обмен

О между Нг

О и карбок-

сильными группами Cbz-L-Phe и Cbz-L-Tyr. Эта гипотеза, как

правило, не рассматривалась всерьез до тех пор, пока не было

показано,

что при гидролизе Leu-Tyr-Leu образуется Leu-Leu,

что может быть обусловлено следующим переносом ацильной

группы [152, 153]:

, »

Leu-Tyr-Leu

Е—ОН +

Leu-Tyr-Leu

—> (Leu-CO)—О—Е »-

—у

Leu-Leu-Tyr-Leu

+ Е—ОН

(12.33)

Leu-Leu

Tyr-Leu

Этот эксперимент был повторен с использованием субстрата с

двойной меткой [

С] Leu-Туг- [

Н] Leu, чтобы показать, что в

ходе

реакции происходит одновременный перенос амино- и

ацильной групп. Было установлено, что образуется как

Н] Leu-[

H] Leu, так и [

C]Leu-[

C]Leu [154]. Продукт, ме-

ченный

С (его в три-четыре раза больше), образуется в ре-

зультате

переноса ацильной группы, а продукт, меченный

Н, —

из

[

С] Leu-Туг- [

Н] Leu- [

H] Leu, который образуется из ами-

нофермента согласно схеме (12.32).

Следует иметь в виду, что прямых данных в пользу суще-

ствования промежуточных соединений с ковалентными связями

нет. Возможно, аминогруппа в аминоферменте связана не кова-

лентно,

а просто «активирована». Перенос ацильной группы в

ходе

реакции

(12.33)

может происходить и путем прямой атаки

Leu-Tyr-Leu связанного с ферментом Leu-Tyr-Leu. Кроме того,

исследования ферментативной реакции в предстационарных ус-

ловиях не выявили ни одного промежуточного соединения.

Если они и образуются, то не накапливаются.

Прежде чем попытаться делать какие-то предположения о

механизме реакции, обсудим следующий момент. Если бы обра-

зовался аминофермент, в котором аминогруппа связана в фер-

менте амидной связью с одной из карбоксильных групп, то при

гидролизе в воде, обогащенной Н

О, изотоп

О должен был

бы включаться в фермент:

"О

Е—(Asp-СО)—NHR >

Е—(Asp-CO

OH).

(12.34)

386

ГЛАВА

Однако по данным, полученным в лаборатории В. К. Антонова,

при

гидролизе в воде, на 40% обогащенной Н

О, включения

фермент не происходит. По окончании катализируемого гид-

ролиза AcPhe-TyrOEt фермент выделяли с помощью гель-фильт-

рации

и две его каталитические карбоксильные группы по от-

дельности блокировали с помощью реакций

(12.29)

и (12.30).

При

гидролизе

двух

образующихся эфиров в конечных продук-

тах—

HO-CH

CONHCH(Ph)CO2H

и НО—CH

CH(OH)R—

О не обнаружено. Либо эта аминокислота связана с

аминоферментом

нековалентно, либо, возможно, справедлив

следующий предложенный В. К. Антоновым механизм [155]:

О—С—О"

О"

R' Ч

O-/

(12.35)

он i

он Ъ

ОН

NHR' i

IV III

—c

+RCO

*=± -£.'

1 I

ОН

/О

+NH

—С

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 387

Согласно этому механизму, транспептидация путем переноса

аминогруппы осуществляется просто обращением стадии,

веду-

щей

от IV к V. Однако для переноса ацильной группы необхо-

димо,

чтобы соединение III могло распадаться с отщеплением

R'NH

и образованием ацилфермента

[(Asp-32)

—

—CO

COR

:(Asp-215)—СО

Н]. Не исключено, что возможность

распада соединения III с высвобождением либо

R'NH

либо

RCO

объясняет те необычные результаты, которые были по-

лучены в экспериментах по определению соотношения

между

продуктами, в

ходе

которых изучали превращения серии суб-

стратов, протекающие с образованием общего аминофермента,

Е-Тгр, в присутствии акцептора — AcPhe [156]. Соотношение

между

AcPheTrp и Тгр, образующимися при гидролизе серии

пептидов XPheTrp в присутствии AcPhe, изменяется в зависимо-

сти от природы X (X = AcGly и т. д.). Обычно этот факт

рассматривается как довод против образования общего проме-

жуточного соединения (гл. 7, разд. Б.2.6). Однако относитель-

ные

скорости отщепления

R'NH

(например, Тгр) и RCO2H (на-

пример,

XPhe) должны зависеть от природы фрагмента RCO

и,

следовательно, доля образующегося аминофермента

будет

изменяться.

Таким образом, соотношение

между

продуктами

реакции

случае

механизма

(12.35)

не должно быть постоян-

ным.

Рассмотренный

механизм значительно сложнее, чем в

случае

других

протеаз. Тем не менее все его стадии вполне приемлемы с

точки зрения химии, хотя подобных аналогий в простых хими-

ческих системах не обнаружено.

Зимоген.

Пепсин образуется из пепсиногена при отщеп-

лении

от N-конца 44 аминокислотных остатков. При нейтральном

рН

зимоген устойчив, а при рН < 5 быстро и самопроизвольно

активируется. Активация осуществляется либо в процессе, ката-

лизируемом пепсином, либо с помощью внутримолекулярного

катализа. Имеется много данных, свидетельствующих о том, что

пепсиноген

самоактивируется в

ходе

мономолекулярного про-

цесса, при котором активный центр расщепляет свою собствен-

ную полипептидную цепь с N-конца [157—163]. Пожалуй, на-

иболее изящным образом это было продемонстрировано при

автоактивации пепсиногена, ковалентно присоединенного к се-

фарозе [159]. Молекулы зимогена иммобилизованы и не

могут

контактировать

друг

с другом. Тем не менее при рН 2 пепсиноген

самопроизвольно активируется. Между двумя путями активации

существует

конкуренция: бимолекулярная активация преобла-

дает

при более высоких концентрациях зимогена и при рН выше

2,5, а внутримолекулярная — при низком рН. Результатом са-

мопроизвольной

активации чистого зимогена является то, что

388

ГЛАВА

большинство молекул пепсиногена становится активным уже

через 10 с после смешивания с соляной кислотой в

желудке.

В.

Рибонуклеаза

[164, 165]

Панкреатическая рибонуклеаза

гидролизует

РНК в

ходе

двухстадийного

процесса, при котором в качестве промежуточ-

ного соединения образуется циклический фосфат:

НО О

он оГ% °\?

„ ) ( Jh^ /~\

(12.36)

АН ^

ROH

Циклизация

обычно протекает значительно быстрее, чем после-

дующий гидролиз, поэтому промежуточное соединение можно

легко выделить. Молекула ДНК рибонуклеазой не гидролизует-

ся,

поскольку у нее

отсутствует

2'-гидроксильная группа. Фер-

мент высокоспецифичен по отношению к основанию, находяще-

муся на З'-конце: это основание должно быть пиримидином —

урацилом или цитозином.

Рибонуклеаза имеет мол. вес 13 680 и образована единствен-

ной

полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных

остатка [166, 167]. Связь

между

А1а-20

Ser-21

может расщеп-

ляться субтилизином. Интересно отметить, что при этом пептид

остается связанным с остальной

частью

мочекулы с помощью

нековалентных связей. Модифицированный белок, названный

рибонуклеазой S, и нативный белок, называемый сейчас рибо-

нуклеазой А,

обладают

одинаковой каталитической активно-

стью. Благодаря своим небольшим размерам, простоте выделе-

ния

и стабильности рибонуклеаза очень

удобна

для физических

химических исследований. Она была первым ферментом, для

которого

удалось

определить аминокислотную последователь-

ность [166]. Кристаллическая

структура

обеих форм фермента

была установлена с разрешением 2,0 А [168, 169]. Поскольку

каталитическая активность рибонуклеазы зависит от состояния

ионизации

двух

остатков гистидина, фермент всесторонне ис-

следовался с помощью ЯМР — очень ценного

метода

для ана-

лиза свойств имидазольного кольца гистидина (гл. 5,

разд. Ж-2.а).

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 389

Химический механизм действия рибонуклеазы в том виде, в

каком

его себе сейчас представляют, был построен из общих

соображений еще до установления кристаллической структуры

фермента [170]. Известно, что график зависимости активности

фермента от рН представляет собой колоколообразную кривую с

максимумом при рН ~ 7. рН-зависимость kat/Kn показывает, что

скорость гидролиза зависит от состояния ионизации в свободном

ферменте основания с р/Са = 5,22 и кислоты с рКа = 6,78, в то

время как из рН-зависимости ftcat

следует,

что в фермент-

субстратном комплексе эти значения рКл изменяются до 6,3 и

8,1. Было высказано предположение, что реакция катализирует-

ся

по механизму общего кислотно-оснбвного катализа с участи-

ем

двух

остатков гистидина, как выяснилось позднее,— His-12 и

His-119:

(His-119)

(12.37)

(12

38)

На

стадии циклизации His-12 выступает в роли общего основ-

ного катализатора, a

His-119

— в роли общей кислоты, которая

протонирует

уходящую

группу.

На стадии гидролиза His-12 и

His-119

меняются ролями;

His-119

активирует атаку воды по

механизму общего основного катализа, a His-12 является кис-

лотным катализатором, протонирующим

уходящую

группу.

Та-

кая

обратимость вполне логична. Реакция

(12.38)

по

существу

является реакцией, обратной (12.37), за исключением того, что

ROH

заменено на НОН. Исходя из принципа детального равно-

390

ГЛАВА

весия,

можно ожидать, что группа, выступающая в прямой

реакции

в роли общей кислоты, в обратной реакции

будет

играть

роль общего основания.

1. Структура фермента и фермент-субстратного

комплекса

[164, 171]

В рибонуклеазе имеется четко выраженная расщелина для

связывания

субстрата. В этой расщелине располагаются His-12,

His-119

и боковые цепи остатков

Lys-7,

Lys-41

Lys-66.

Струк-

тура

фермент-субстратного комплекса на стадии циклизации

была построена исходя из данных кристаллографических иссле-

дований структуры комплекса фермента с аналогом субстрата

UpcA (12.39), представляющим собой фосфонатный аналог

UpA.

нгосн

(12.39)

NH,

НО

ОН

Это очень близкий аналог, отличающийся от субстрата только

тем, что атом кислорода замещен в нем —СН

-группой, так что

структура

его комплекса с рибонуклеазой близка к

структуре

продуктивного фермент-субстратного комплекса. Установлено,

что

His-119

располагается на расстоянии длины водородной

связи

от уходящей группы, a His-12— на расстоянии длины

водородной связи от 2'-ОН-группы рибозы пиримидина. Ни одна

из

боковых цепей лизина не вступает в прямой контакт с суб-

стратом, однако они, по-видимому, имеют важное значение для