Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
Розділ 6.
ДНК&ТЕХНОЛОГІЇ
ДНКтехнології — це один з розділів молекулярної генетики,
методи якого базуються на здатності специфічних ферментівре
стриктаз розщеплювати молекули ДНК на окремі фрагменти, які
використовуються для упроваджування у геноми плазмід бакте
рій, фагів з метою одержання гібридних форм, які складаються з
власної ДНК і вбудованих фрагментів чужорідної ДНК. Основні
методи ДНКтехнологій: клонування ДНК, ідентифікація генів,
секвенування та синтез олігонуклеотидів, спрямований мутаге
нез ДНК, експресія синтезованих фрагментів ДНК, технологія
одержання рекомбінантної ДНК та введення її у клітини.
ДНКтехнології дозволяють розробляти науково обгрунтовані
програми селекції, виявляти та оцінювати поліморфізм молекул
ДНК, досліджувати структуру геному, генофондів, забезпечити
створення банків генів. ДНКтехнології використовуються для:
контролю за якістю сільськогосподарської сировини і продуктів
харчування, діагностики інфекційних хвороб, виявлення гене
тичних (спадкових) захворювань на ранніх стадіях розвитку,
дослідження геному на виявлення продуктивних якостей і вико
ристання у селекції, створення генетичних паспортів видів
сільськогосподарських тварин, порід, таксономічних груп тощо.
Сучасні ДНКтехнології застосовують для керування потоком
генетичної інформації, збереження біорізноманіття, створення
нових форм тварин для одержання «біореакторів» (продуцентів,
необхідних для людини білків), спрямованого отримання бажа
них генотипів (використання стовбурових ембріональних клі
тинних ліній, трансплантації ядер бластомерів та соматичних
клітин у яйцеклітини) та ін. Розвитку ДНКтехнологій сприяла
їх здатність вирішувати різні проблеми біології, медицини,
сільського господарства, екології тощо.
У сучасний період бурхливий розвиток ДНКтехнологій
відбувається завдяки розробці нових молекулярногенетичних
методів досліджень. Методи аналізу ДНК засновані на рестрик
ції, гібридизації та ампліфікації. Рестрикція (restriction — роз
щеплення) — це процес розщеплення чужорідної молекули
ДНК під дією специфічних бактеріальних ферментіврестри
ктаз у певних специфічних ділянках, що мають назву сайти
(site — ділянка) рестрикції, довжиною від 4–7 до 8–12 пар
нуклеотидів. За допомогою рестриктаз макромолекули ДНК
розщеплюються на фрагменти від декількох сотень до декількох
тисяч пар нуклеотидів. Гібридизація (hybridization) — це здат
ність комплементарних ланцюгів нуклеїнових кислот утворю
вати комплекси. Принцип комплементарності використовують
для ідентифікації окремих фрагментів ДНК і цілих організмів.
Ампліфікація (amplification) — це процес утворення додаткових
копій ділянок хромосомної ДНК, які містять певні гени.
Молекулярна біологія базується на принципі генетичного
детермінізму. Дослідження на молекулярному рівні структур
ної організації як генів, так і в цілому геному дозволяє вивчати
механізми функціонування генів. Використання молекулярно
генетичних методів дозволило дослідити в першу чергу геном
прокаріот. Для молекулярногенетичного аналізу складного ге
ному еукаріот були необхідні інформативні маркери. Спочатку
використовувалися тестсистеми для виявлення продуктів ге
нів (білковий поліморфізм), потім на рівні генетичного матері
алу клітин (поліморфізм ДНК). Більш інформативним вияви
лося використання як маркерів поліморфних послідовностей
нуклеотидів ДНК за поліморфізмом довжини рестриктних
фрагментів (ПДРФ). Проблема пошуку маркерів на рівні моле
кул ДНК була практично вирішена, коли відкрили метод амплі
фікації фрагментів ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової
реакції (ПЛР).
Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яку називають
«золотою кулею» діагностики, — один із сучасних високочутли
вих методів молекулярної біології, який базується на принципі
виявлення і багаторазового копіювання (ампліфікації) індиві
дуальних фрагментів ДНК. Принцип методу ПЛР (Polymerase
Розділ6.ДНК-технолоії
171
chain reaction (PCR)) розроблений Кері Мюллісом зі співробіт
никами (фірма «Cetus», США) у 1983 р., який за ці роботи у
1993 році одержав Нобелівську премію. Зараз ПЛР широко ви
користовується як для наукових досліджень, так і для діагно
стики в закладах охорони здоров’я, структурах держсанепідна
гляду (генотипування, діагностика генетичних та інфекційних
захворювань), ветеринарносанітарної експертизи (визначення
видової належності м’ясних інгредієнтів у складі кормів) та ін.
В основі методу ПЛР лежить природний процес — компле
ментарна добудова ДНК матриці, яке здійснюється за допомо
гою ферменту ДНКполімерази. Ця реакція має назву репліка
ції ДНК. Природна реплікація ДНК має декілька стадій:
1. Денатурація ДНК (розплетення подвійної спіралі, роз
ходження ниток ДНК).
2. Утворення коротких дволанцюгових ділянок ДНК (зат
равок, необхідних для ініціації синтезу ДНК).
3. Синтез нового ланцюга ДНК (комплементарна добудо
ва обох ниток).
Цей процес можна використовувати для одержання копій
коротких ділянок ДНК, специфічних, наприклад, для конкрет
них мікроорганізмів, тобто здійснювати цілеспрямований по
шук таких специфічних ділянок, що і є метою генодіагностики
для виявлення у даному випадку збудників інфекційних захво
рювань.
Полімеразна ланцюгова реакція, або специфічна ампліфіка
ція ДНК, дає змогу вибірково синтезувати in vitro невеликі ді
лянки ДНК, які мають розмір від декількох десятків до сотень
пар олігонуклеотидів (від грец. Оligos — малий). Тобто ампліфі
кація — це процес утворення додаткових копій певної нуклеоти
дної послідовності ділянок хромосомної ДНК. Як матриця мо
жуть використовуватися різні зразки ДНК, що містять
послідовність, яку треба ампліфікувати (тиражувати). Таким
чином, ПЛР — це багаторазове збільшення кількості копій (ам
пліфікація) специфічної ділянки ДНК, яке каталізується фер
ментом — ДНКполімеразою.
Для проведення ампліфікації необхідні наступні компоненти:
ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія
172
Розділ6.ДНК-технолоії
173
ДНК&матриця (ДНК або її частина, яка містить досліджу
ваний специфічний фрагмент);
Праймери (від англ. Primer — початковий, основний) —
синтетичні олігонуклеотиди (20–30 нуклеотидних пар), які
комплементарні послідовностям ДНК у межах специфічного
фрагмента. Вибір специфічного фрагмента та підбір праймерів
відіграє важливу роль у специфічності проведення ампліфіка
ції, що позначається на якості аналізу.
Суміш дезоксинуклеотидтрифосфатів (ДНТФ) (суміш чо
тирьох ДНТФ, які є матеріалом для синтезу нових комплемен
тарних ланцюгів ДНК).
ДНК&полімераза. При проведенні ПЛРаналізу використо
вують різні ферменти:
Тaqполімераза — термостабільна ДНКполімераза, яка ка
талізує подовження ланцюгів праймерів шляхом послідовного
приєднання нуклеотидних основ до зростаючого ланцюга ДНК,
що синтезується.
Тaqполімераза виділена з термофільної бактерії Thermus
aquaticus, яка живе в гарячих джерелах. Фермент стабільний
при високих температурах і зберігає високу активність у проце
сі ампліфікації.
Tthполімераза, яка виділена з термофільної бактерії Ther
mus thermophilis. Температурний і рН оптимуми відповідно
дорівнюють 75
о
С і 9,0. Фермент має ревертазну активність і ви
користовується з РНКматрицею у реакції синтезу комплемен
тарної молекули ДНК. Для одержання специфічних ділянок ге
ному РНКвмісних вірусів спочатку отримують ДНКкопію з
РНКматриці шляхом використання реакції зворотної тран
скрипції (RT), яка каталізується ферментом — ревертазою (зво
ротною транскриптазою).
Pwoполімераза, яку отримують з термофільної бактерії Py
rococcus woesei. Фермент більш термостабільний, ніж Тaq і
Tthполімерази.
Буферний розчин (реакційне середовище, яке містить іони
Мg
2+
, необхідні для підтримки активності ферменту).
Необхідною умовою при ампліфікації є наявність «прайме
рів» — синтетичних невеличких фрагментів ДНК, які складають
ся з 20–30 пар нуклеотидних основ. Праймери комплементарні
ділянкам (сайтам) відпалу на ідентифікованій матричній ДНК.
ПЛРаналіз відбувається циклами, кожний з яких склада
ється з трьох послідовних стадій, які відбуваються при різних
температурах:
1. Денатурація або процес плавлення молекул ДНК
(t
o
=93–95
o
C). При цьому дволанцюгова форма перетворю
ється на одноланцюгову, яка стає доступною для праймерів.
2. Відпал — приєднання праймерів, один з яких комплементар
ний початку одного ланцюга ДНК, а другий — кінцю іншого.
3. Подовження (елонгація) ланцюга ДНК за рахунок приєд
нання дезоксинуклеотидтрифосфатів за принципом компле
ментарності. Відбувається за участю ДНКполімерази тер
мофільної бактерії Thermus aquaticus (Тaqполімерази) при
температурі 60–70
о
С. Утворюються дволанцюгові молекули
ДНК — точні копії необхідного фрагмента.
Цей триступеневий цикл, у процесі якого утворюються син
тезовані фрагменти ДНКамплікони, повторюється 30–40 разів.
З кожним циклом кількість сегментів ДНК, обмежених з обох
кінців, що використовуються праймерами, збільшується експо
ненціально (C=2
n
, де n — кількість циклів). Вихід інших про
дуктів збільшується лінійно.
Полімеразна ланцюгова реакція проводиться в термоцикле
рі (ампліфікаторі) — термостаті, в якому автоматично зміню
ється температурний режим. Наступний етап ПЛР — детекція
або виявлення ампліфікованої ДНК. Ампліфіковані специфічні
фрагменти ДНК виявляють методом горизонтального електро
форезу в агарозному гелі з барвником (бромистий етидій). Бар
вник утворює з фрагментами ДНК стійку сполуку, яка про
являється у вигляді смуг, що світяться при опроміненні гелю
УФвипромінюванням при довжині хвилі 290–330 нм. Продукт
електрофорезу розглядають в УФсвітлі за допомогою спе
ціального приладу — трансілюмінатора і фотографують.
ПЛР може бути доповнена рестрикційним аналізом
ампліфікованої ДНК, що потрібно для визначення поліморфіз
му ДНК.
Для лабораторії ПЛР необхідні три ізольовані кімнати з на
явністю води і вентиляції. Для попередження контамінації або
ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія
174
потрапляння будьяким шляхом із зовнішнього середовища в
реакційну суміш продуктів ампліфікації, що викликає хибнопо
зитивні результати, основними видами робіт є підготовка дослі
джуваних зразків, ампліфікація та детекція продуктів ПЛР,
які потрібно ізолювати один від одного і проводити в різних
приміщеннях. Робота організовується в одному напрямі: від
ПЛРприміщення до кімнати, де відбувається детекція продук
тів полімеразної реакції.
При проведенні ПЛР необхідно одночасно проводити по
становки контрольних проб — позитивної і негативної. В про
бірку з позитивним контролем вносять препарат, в якому мі
ститься визначена послідовність ДНК. У пробірці з негативним
контролем замість досліджуваного зразка ДНК вносять анало
гічний об’єм води. Використовують також так званий «внутріш
ній контроль», при якому в реакційну суміш додають зразок
ДНК, який має специфічні сайти приєднання праймерів, але
відрізняється за довжиною від очікуваного цільового фрагмен
та. Виявлення специфічних продуктів ампліфікації внут
рішнього контролю — сигнал успішного проходження ПЛР. Як
що продукти ампліфікації внутрішнього контролю не виявля
ються — реакція за будьяких причин не відбулася.
Сьогодні велика увага приділяється розробці ПЛРтест
систем (діагностикумів), які необхідні для виявлення ДНК
збудника різних інфекційних хвороб.
Одним з надто складних завдань ветеринарних лабораторій
є визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі
комбікормів. В останні роки ця проблема набула великого зна
чення у зв’язку з відкриттям пріонних захворювань сільськогос
подарських тварин, які належать до групи губчастоподібних ен
цефалопатій (ГЕ). З 1996 р. у всіх країнах Євросоюзу введена
заборона на згодовування жуйним тваринам м’ясокісткового
борошна, яке виготовлене з органів ссавців. Це пояснює важли
вість визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у
складі комбікормів.
Значно складніше провести цю ідентифікацію у кормах,
які піддавалися термічній обробці (м’ясокістковому та рибному
борошні, сухих та консервованих кормах для домашніх тварин).
При термічній обробці відбувається денатурація білків і втрата
Розділ6.ДНК-технолоії
175
ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія
176
видової специфічності, у зв’язку з чим імунодифузія в гелі, ізо
електричне фокусування, імуноферментний аналіз, які викори
стовуються для ідентифікації сирого м’яса, в такому випадку
непридатні. Є підстави сподіватися, що використання ПЛР
тестсистем, які мають високу чутливість і специфічність, дасть
можливість вирішити цю проблему. Прикладом такої тест
системи є розроблена методика для визначення видової належ
ності м’ясних інгредієнтів у складі сумішей.
При розробці тестсистеми для визначення видової належ
ності м’ясних інгредієнтів у складі продуктів харчування та
кормів використовували наступну схему. Шляхом аналізу нук
леотидних послідовностей були вибрані специфічні олігону
клеотидні праймери, які специфічні до ДНК мітохондріального
геному жуйних. Для диференціювання виду жуйних праймери
відібрані з урахуванням мультиплексної ПЛР, у якій утворю
ється два специфічних ПЛРпродукти різної довжини: перший
для ДНК великої рогатої худоби — (680 п.н.), а другий — для
ДНК дрібної рогатої худоби (350 п.н.). Після цього у препаратах
ДНК, які виділені з крові ВРХ, овець, свиней, птиці та м’яса ри
би, визначається чутливість та специфічність вибраних прайме
рів. Проведені дослідження дозволили встановити, що коли
ІФА дозволяє виявляти домішку м’ясокісткового борошна в
рибному борошні тільки в концентрації не менше 50 %, то при
проведенні ПЛРаналізу чутливість зростає і дає можливість
визначати вже 1 % домішку. Тобто при виявленні домішок тка
нин жуйних тварин у складі кормів чутливість ПЛР тестсисте
ми була у 50 разів вищою, ніж при проведенні імуноферментно
го аналізу.
Використання тестсистем дозволяє запобігти фальсифікації
рибного борошна тканинами ссавців, проводити диференціацію
видової належності протеїнів у складі кормів для тварин і м’ясо
продуктах. Це також має важливе епідеміологічне значення.
Зараз ПЛР — один з основних молекулярногенетичних
методів, які застосовуються в різних галузях:
тваринництві — це дослідження геному сільськогосподарсь
ких тварин на наявність продуктивних якостей для вирішен
ня проблем селекції; діагностика спадкових хвороб тварин;
створення генетичних паспортів порід, видів; діагностика
інфекційних захворювань та проведення епізоотологічного
моніторингу;
у ветеринарній медицині — це діагностика таких хвороб, як
сальмонельоз, бруцельоз, лістеріоз, туберкульоз, чума ВРХ,
класична чума свиней, хвороба Ауески, лейкоз, стафілоко
коз, мікоплазмоз, хвороба Марека, хвороба Гамборо, хвороба
Ньюкасла, чума м’ясоїдних, вірусний ентерит, реовірусна ін
фекція, генетичні захворювання та ін;
у харчовій промисловості — для визначення наявності різних
патогенів у продуктах харчування.
Контрольні питання
1. Назвіть основні етапи ДНКтехнологій.
2. Де застосовують сучасні ДНКтехнології?
3. Які існують методи аналізу ДНК?
4. Дати визначення процесам рестрикції, гібридизації та ам
пліфікації.
5. На якому принципі базується полімеразна ланцюгова реак
ція (ПЛР)?
6. Який процес покладено в основу методу ПЛР?
7. Назвіть стадії реплікації ДНК.
8. Які компоненти необхідні для проведення ампліфікації?
9. З яких циклів складається ПЛРаналіз?
10. За допомогою якого методу відбувається детекція або вия
влення ампліфікованої ДНК?
11. Вимоги до лабораторій ПЛР.
12. Яка мета проведення постановки контрольних проб при
проведенні ПЛР?
13. Як за допомогою методу ПЛР визначають видову належ
ність м’ясних інгредієнтів у складі комбікормів?
14. Використання ПЛР у тваринництві.
15. Використання ПЛР у харчовій промисловості.
16. Використання ПЛР у ветеринарній медицині.
Розділ6.ДНК-технолоії
177
Розділ 7.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА
І ЗАСТОСУВАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ
ПРЕПАРАТІВ
7.1. ІНЖЕНЕРНА ЕНЗИМОЛОГІЯ.
ЗАВДАННЯ ІНЖЕНЕРНОЇ ЕНЗИМОЛОГІЇ
Інженерна ензимологія поряд з генетичною і клітинною ін
женерією складає фундамент нової біотехнології.
Інженерна ензимологія — це галузь біотехнології, яка
базується на використанні каталітичних функцій ферментів
(або ферментних систем) у ізольованому стані або в складі пев
них клітин для одержання відповідних цільових продуктів.
Слово «інженерна» свідчить про створення конструкції (від
франц. engin — машина), в даному випадку — конструювання
біокаталізаторів з заданими властивостями з подальшим вико
ристанням у біотехнологічному процесі.
Це новий науковотехнічний напрям, який базується на
хімічній ензимології, біохімії, хімічній технології та інженерно
економічних дисциплінах. Основне завдання інженерної ензи
Частина
I I
мології — розробка біотехнологічних процесів, у яких викори
стовується каталітична дія ферментів, виділених зі складу біоло
гічних систем або ферментів, які знаходяться в клітинах, штучно
позбавлених здатності до росту. Існує й і інше визначення зав
дання інженерної ензимології: це конструювання біоорганічних
каталізаторів з передбаченими властивостями на основі фермен
тів або поліферментних комплексів, виділених з біологічних си
стем, які розвиваються. З огляду на практичні потреби одержан
ня певних продуктів передбачені властивості — це визначений
термін служби каталізатора за певних умов (температури, рН,
іонної сили розчину), його селективність (специфічність) дії,
продуктивність (активність), імуногенність, токсичність і т.д.
Однак завдання інженерної ензимології набагато ширші,
ніж створення каталізаторів нового типу. Найголовніша мета
цієї дисципліни — розробити наукові основи використання
ферментних каталізаторів для створення нових біотехнологіч
них процесів у промисловості, нових методів у терапії і діагно
стиці, аналізі, органічному синтезі й інших галузях практичної
діяльності.
Завдяки високій активності і специфічності деякі ферменти
і ферментні системи знайшли застосування як біокаталізатори в
різних галузях практичної діяльності: в харчовій, фармацевтич
ній, текстильній, шкіряній та інших галузях промисловості, в гу
манній і ветеринарній медицині, в сільському господарстві, орга
нічному синтезі, хімічному аналізі тощо. У промисловості,
наприклад, використовуються в основному препарати для гідро
лізу природних полімерів білків, крохмалю, пектинів (табл. 7.1).
Але більш широке технологічне використання розчинних
або нативних ферментів затримувалось через низку причин, які
залежать від природи самих ферментів. Перш за все ферменти
можуть функціонувати лише при незначних коливаннях рН се
редовища, температури, іонної сили розчину і відсутності інгібі
торів; вони нестійкі при зберіганні і впливові різних факторів,
особливо теплових; багаторазове використання ферментів
утруднене через складність їх відокремлення від продуктів реак
ції, в результаті чого вони використовуються, як правило, один
раз; трудомісткість очищення ферментів і одержання їх у достат
ньо активному стані і, як наслідок, висока вартість нативних
179
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів