Отчет по практическим занятиям-Липолитическая микрофлора сточных вод

Подождите немного. Документ загружается.

Содержание

1. Введение………………………………………………………………………………..стр.1

2. Липолитические микроорганизмы…………………………………………………....стр.2

2.1 Очистка сточных вод от жира……………………………………………………..стр.3

2.2 Современные исследования липолитический активности микроорганизмов….стр.5

3. Материалы и методы исследования……………………………………………..……стр.7

4. Результаты………………………………………………………………………………стр.8

5. Вывод…………………………………………………………………………………....стр.11

6. Список литературы…………………………………………………………………… стр.12

1. Введение

Серьезной экологической проблемой является очистка сточных вод предприятий

пищевой промышленности и канализационных систем от жиров. Сточные воды пищевых

производств (кондитерских, мясоперерабатывающих, рыбобрабатывающих,

масложировых, молочных) а также перерабатывающих содержат высокие концентрации

жира и твердый жир. Недостаточная очистка стоков от жира приводит к зажириванию

канализационных труб и коммуникаций, нарушению повышенных требований к очистке

сточных вод от жиров перед сбросом на городские очистные сооружения. При

механической очистке стока с помощью проточных жироуловителей в зависимости от

масштаба производства суточный объем удаляемой из жироуловителей в отходы жировой

массы может составлять от нескольких килограммов до нескольких тонн. Жиры

представляют собой сложную органику, которая недоступна для усвоения даже активным

илом очистных сооружений. Жиры не усваиваются бактериями прямой адсорбцией

поэтому прежде необходим гидролиз жира. Необходимы эффективные методы не только

очистки сточной воды от жиров, но и утилизации и обезвреживания отделяемой от воды

жировой массы. Механическое отделение твердого жира от стока не приводит к решению

проблемы утилизации жировой массы - забитые жиром колодцы, жироуловители, кнс

требуют периодической откачки собранного жира.

Одним из перспективных способов решения этой проблемы является

биоферментная технология их разложения на локальных очистных сооружениях

конкретного предприятия. Биоферментные технологии по разложению и утилизации

жиров основаны на использовании микробных липаз и микроорганизмов, способных к их

продуцированию (Силищев, 2009).

Целью данного исследования является выделение и изучение липолитических

микроорганизмов.

Задачи:

1. постановка накопительной культуры

2. выделение чистых культур липолитических микроорганизмов.

2. Липолитические микроорганизмы сточных вод

Жиры очень распространены в природе. Они представляют собой смесь разных по

составу триглицеридов жирных кислот. Из всех известных липидов жиры являются самой

большой группой (Тютюнников, 1992).

Липиды плохо растворяются в воде, но хорошо растворяются в большинстве

гидрофобных органических растворителей. Исключение составляют фосфолипиды,

которые в отличие от глицеридов плохо растворимы в ацетоне. Липиды взаимно

растворяются и при извлечении из тканей растений и животных организмов они вместе

составляют продукт, называемый сырым жиром (Березов, 1998).

Жиры являются одним из основных продуктов питания. Они служат также

основным сырьем для жироперерабатывающей промышленности в производстве мыла,

олифы, глицерина, используются в качестве добавок к лекарственным средствам, для

строительных растворов, бетона, а так же широко используются в кожевенно-меховой

промышленности.

Жиры входят в состав животных и растительных организмов. У растений жир

содержится главным образом в семенах, причем у злаковых - в зародыше. Содержание

жира в семенах различных растений колеблется в широких пределах.

Микробная липаза способна гидролизовать животные жиры, растительные масла, а

также синтетические моно-, ди- и триглицериды. Синтетические триглицериды являются

лучшими субстратами для многих микробных липаз.

При микробной деструкции жировые вещества распадаются до глицерина и

высших жирных кислот, включаясь в дальнейшем в цикл трикарбоновых кислот и образуя

конечные продукты распада: углекислый газ и воду.

2.1 Очистка сточных вод от жира

В настоящее время возросла проблема загрязнения водного бассейна

производственными сточными водами, содержащими различные компоненты, в том

числе, жировые вещества. Органические компоненты, поступая в водоем, создают

благоприятную среду для жизнедеятельности гнилостных патогенных бактерий, грибков,

простейших, подвергаются сложным биохимическим превращениям, вызывая тем самым

вторичное загрязнение водоемов и оказывают прямое отрицательное влияние на водные

организмы.

На практике используются физические, электрические, биологические, химические

методы очистки сточных вод, в том числе озонирование, мембранный метод, обратный

осмос и др.

Распад биополимеров (углеводов, белков и жиров) начинается с гидролиза,

который осуществляют микроорганизмы, имеющие специальные ферменты - гидролазы.

Их размножению и распространению по поверхности твердого субстрата способствует

вода. Продукты этой реакции потребляются гидролитиками и другими кислотогенными

микроорганизмам, в результате чего образуются летучие жирные кислоты (уксусная,

пропионовая, масляная), а также водород. Фаза, условно объединяющая гидролиз и

кислотогенез, называется кислотогенной. При накоплении жирных кислот понижается pH

среды, а при pH < 6.0 конечная метаногенная фаза подавляется (Фогорти,1986).

Чрезмерное содержание аллохтонного органического вещества в нативных водных

объектах приводит к ухудшению гидрохимических показателей объекта.

Жиры в сточных водах могут находиться в четырех агрегатных состояниях:

грубодисперсном, тонкодисперсном, эмульгированном (при этом сохраняется устойчивая

кинетическая оболочка) и растворенном в зависимости от рН потока.

Следует отметить, что загрязненность сточных вод растворенными и

эмульгированными жирами является доминирующей и изменяется в зависимости от

характера технологического процесса и наличие в залповых сбросах.

Не зависимо от того, сбрасываются производственные сточные воды в городскую

канализацию или обрабатываются на территории самого предприятия, должны быть

предусмотрены следующие очистные сооружения; решетка, песколовка, жироловка и

отстойник.

Из опыта эксплуатации действующих заводских очистных сооружений следует, что

жироловки необходимо оборудовать рассредоточенным выпуском и обеспечить время

пребывания в ней сточной воды 15 мин при максимальном притоке.

Установлено, что физико-химические методы, в особенности флотация под

давлением, являются оптимальным решением, как в техническом, так и в экономическом

отношении. Флотация под давлением, без применения реактивов, позволяет уменьшить

концентрацию нерастворимых веществ и жира до пределов, предусмотренных Комитетом

по охране окружающей среды. Быстрое экстрагирование загрязняющих веществ дает

возможность получить продукты, которые можно использовать на кормовые цели

(Эндо,1985).

В настоящее время помимо физических и физико-химических методов очистки

широко применяется биологический метод, основанный на жизнедеятельности

микроорганизмов – деструкторов жировых веществ.

Биологическая очистка сточных вод основана на способности микроорганизмов

использовать растворенные и коллоидные органические загрязнения в качестве источника

питания в процессах своей жизнедеятельности. И она имеет ряд важных преимуществ

перед другими методами. Микроорганизмы осуществляют полную деструкцию

загрязнения до газообразных продуктов и воды, обеспечивая тем самым круговорот

элементов в природе. Таким образом, при биологической очистке в отличие от других

способов не происходит концентрации загрязнении или перевода их в другую форму. В то

же время биологические методы наиболее экономичны, так как за исключением основных

капиталовложений почти не требуют расходов во время эксплуатации сооружений, а

главный действующий компонент биологической очистки – активный ил

самовоспроизводится.

2.2 Современные исследования липолитической активности микроорганизмов

Микроорганизмы являются биоиндикаторами наличия различных видов

загрязняющих веществ в морской воде. Гетеротрофные бактерии в своем питании

используют легкодоступные органические вещества. Наличие нефтеокисляющих,

фенолокисляющих, липолитических, амилолитических микроорганизмов свидетельствует

о присутствии в воде загрязнений органического происхождения.[Рубцова С.И.].

Одну из наиболее мощных антропогенных нагрузок в Приморье

испытывает бухта Золотой Рог, расположенная в заливе Петра

Великого. Существенное воздействие на состояние вод здесь

оказывают крупнейшие городские порты и судоремонтные заводы.

Загрязнения поступают сюда также с водами р. Объяснения.

Значительную часть загрязнителей составляют органические вещества

различного происхождения.

Количество липолитической микрофлоры варьировало в б.

Золотой Рог в диапазоне от 0 в декабре до 3,9·10

на станции в районе

предустья р. Обьяснения в августе. Таким образом, максимальная

численость этих микроорганизмов была на порядок выше, чем

соответствующее число амилолитиков, отмеченное за весь период

наблюдения. (Калитина, 2005).

Развитие пищевых предприятий и расширение сети быстрого питания за последние

годы сделало особенно актуальным решение проблемы очистки сточных вод предприятий

пищевой промышленности от жиров, масел, белков и других органических соединений.

Способность разлагать растительные и животные жиры обнаружена у

бактерий(Pseudomonas,Bacillus,Closiridium,Serratia,Micrococcusи др.) и плесневых

грибовN(Penicillium,Cladosporium,Aspergillus).Механизм биодеструкции заключается в

усвоении жира микроорганизмами в качестве источника энергии, синтезирующими

липолитические ферменты, под воздействием которых жиры разлагаются на воду,

углекислоту, нитриты, сульфаты и легкий осадок. На основе липолитических ферментов

создают бактериальные препараты, применяемые для очистки сточных вод, в том числе,

продуцируемых бациллами. Проведена работа по изучению качественного определения

липолитической активности на средах содержащих твины лауриловой, стеариновой и

олеиновой кислот, а также по отношению к органическим жирам (бараний, говяжий,

свиной, масло растительное), биодеградация животного и растительного жиров.

Проведенное исследование показало, что 28 изолятов культур бацилл обладают высокой

липолитической активностью и могут быть использованы как продуценты фермента

липазы для очистки сточных вод от жировых отложений (Сармурзина ).

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот

и глицерина. Пищевые предприятия загрязняют окружающую среду стоками,

содержащими высокие концентрации растительных и животных жиров. Поиск новых

штаммов микроорганизмов - продуцентов липазы, проявляющих активность по

деструкции жиров растительного и животного происхождения, является актуальной

задачей.

Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Rhizopus, Fusarium, некоторые

дрожжи (Jarrowia). Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент

липазы. Использование бактерий-продуцентов липаз обладает по сравнению с грибами

преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может

сделать более выгодным технологический процесс получения липазы. Известен,

например, штамм Serratia marcescens 345, обладающим высокой биодиструкционной

активностью твердым жироа животного и растительного происхождения под действием

липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens (Описание

изобретения к патенту,2006).

В настоящее время одной из наиболее важной проблемой является утилизация

масложировых отходов. Рациональная переработка растительного сырья предполагает

наиболее полное использование его исходных компонентов для перехода на

малоотходную и безотходную технологию производства.

В качестве продуцента липазы используется культура дрожжей Yarrowia lipolytica

W 29. исследуемая липаза Yarrowia lipolytica W 29 может быть успешно использована для

гидролиза соапстока с целью выделения свободных жирных кислот (Корнеева, 2006).

3. Материалы и методы исследования

Материал исследования

Материалом исследования являются бытовые сточные воды (хозяйственно-

фекальные). К бытовымNсточным водамNотносят воды, удаляемые из туалетных комнат,

ванн, душевых, кухонь, бань, прачечных, столовых, больниц. Они загрязнены в основном

физиологическими отбросами и хозяйственно-бытовыми отходами.

В качестве источника углерода для липолитических микроорганизмов исследуемых

сточных вод был выбран свиной жир.

Методы исследования

1) Получение накопительной культуры.

Для создания элективных условий для развития липолитических микроорганизмов

используется минеральная среза Раймонда, состав из расчета г/л : Na

– 0.1 г, CaCl

–

0.01 г, MnSO

• 7H2O – 0.2 г, FeSO

• 7H

O – 0.02 г, NaH

– 1.5 г, K

HPO

– 1 г, MgSO

•

O – 0.2 г, NH

– 2 г. К 50 мл среды Раймонда добавляют 20 мл сточной воды и 1 г

свиного жира в качестве единственного источника углерода. Культивирование проводится

при комнатной температуре.

2) Получение чистой культуры микроорганизмов

Вначале накопительная культура высевается глубинным посевом на

мясопептонный агар (МПА) с добавлением свиного жира. Высевалось 4ое и 5ое

разведения. Затем наиболее типичные изолированные колонии высеваются на

поверхность твердой среды Селибера с добавлением свиного жира в качестве

единственного источника углерода методом истончающегося штриха. Состав среды

Селибера: K

HPO

-1 г, MgSO

-0.3 г, CaCl-0.1 г, (NH

)

HPO

-2 г, NaCl-0.1 г, агар-30 г.

3) Определение липолитической активности.

Для определения липолитической активности выделенных штаммов используются

чашки с твердой средой МПА, сплошь покрытой свиным жиром, окрашенным Суданом 3.

О липолитической активности судят по наличию светлых зон на окрашенном жире.

4) Для определения морфологии микроорганизмов использовалась светлопольная

микроскопия.

4. Результаты

Накопительная культура липолитических микроорганизмов культивировалась в

течение 32 суток. Результаты наблюдений представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Описание накопительной культуры.

Сутки Описание культуры Микроскопия

0 Среда мутная,

черно-коричневого

цвета; жир двумя

цельными кусками

диаметром по 10мм.

Г + споровые палочки и незначительные Г– бесспоровые

4 Среда по-прежнему

мутная, посветлела

до коричневого,

жир распался на

более мелкие

фрагменты и

распределился по

поверхности

Мазки воды и с поверхности жира не различаются.

Обнаружены короткие маленькие Г+ споровые палочки с

округлыми концами, расположенные одиночно. Окрашены

интенсивно в темно-фиолетовый. Споры расположены по

бациллярному типу. Единичные Г– бесспоровые палочки.

15-18 Среда светло

коричневая, мутная,

жир распался на

еще меньшие

фрагменты (диаметр

4 мм) и стал

тусклым.

Обнаружены короткие маленькие с округлыми концами Г+

споровые палочки, расположенные одиночно некоторые

попарно. Окрашены интенсивно. Споры расположены по

бациллярному типу.

29-32 Среда песочного

цвета, муть слабая,

есть белесый

осадок, размер

жировых

фрагментов не

изменился, они

стали похожи на

мыльные хлопья.

Обнаружены короткие маленькие Г+ споровые палочки с

округлыми концами, расположенные одиночно и некоторые

попарно. Окрашены интенсивно в темно-фиолетовый. Споры

расположены по бациллярному типу.

Получение чистой культуры.

При высеве накопительной культуры на МПА с добавлением свиного жира ОМЧ

составило 71*10

-5

КОЕ/г. Культуральные и морфологические свойства представлены в

Таблице 2.

Таблица 2. Исследование свойств чистых культур.

№ штамма Количество

колоний

Культуральные свойства Морфологические

свойства

1 24 Колонии небольшого

диаметра 3 – 8 мм, светло-

бежевые, глянцевые, круглые,

край ровный, выпуклые.

Мелкие бесспоровые Г–

палочки, одиночные

тонкие, прокрашены

хорошо.

2 9 Маленькие, круглые d=2 мм,

желтые, плоские, глянцевые,

край ровный.

Маленькие одиночные Г+

кокки

3 11 Маленькие, бледно розовые,

круглые, d=5 мм, глянцевые,

край ровный, выпуклые.

Очень маленькие

плотноокрашенные Г+

одиночные палочки без

спор.

4 15 D=10-15 мм, округлые, светло-

бежевые, край неровный,

складчатая поверхность.

Мелкие Г+ споровые

короткие толстые

палочки, собранные в

цепочки по 6-8 штук.

Для получения чистых культур липолитических микроорганизмов на среду

Селибера методом истощающегося штриха были высеяны штаммы № 1, 3, 4.

В процессе роста среда сменила зеленую окраску на желтую. Мофологические и

культуральные свойства выросших колоний аналогичны исходным колониям, выросшим

на МПА.