Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Попов С.С. Медицинская энзимология

Подождите немного. Документ загружается.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Учебное пособие

Составители:

Т.Н. Попова

Т.И. Рахманова

С.С. Попов

Издательско-полиграфический центр

Воронежского государственного университета

2008

Утверждено научно-методическим советом биологического факультета,

03 сентября 2008 г., протокол № 1

Научный редактор: проф., д-р биол. наук М.А. Наквасина

Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и

микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государ-

ственного университета.

Рекомендуется для студентов III курса дневного отделения и V курса ве-

чернего отделения биолого-почвенного факультета в качестве основной

литературы по дисциплине «Медицинская энзимология», а также для

студентов IV курса дневного отделения физического и химического фа-

культетов в качестве дополнительной литературы по дисциплине «Био-

химия».

Для специальности: (020201) – Биология

СОДЕРЖАНИЕ

Введение. Задачи и направления медицинской энзимологии ..............4

Ферментативная активность сыворотки крови ......................................8

Значение исследования ферментных констелляций.

Учет особенностей биосистем при энзимодиагностике ..........................9

Общие правила работы с ферментами и некоторые

практические рекомендации .......................................................................12

Способы выражения активности ферментов ..........................................16

Клинико-диагностическое значение определения

отдельных ферментов....................................................................................17

Алкогольдегидрогеназа ......................................................................17

Альдолаза .............................................................................................18

Альфа-амилаза .....................................................................................18

Аминотрансферазы .............................................................................23

Гамма-глутамилтрансфераза ..............................................................27

Глутаматдегидрогеназа .......................................................................32

Глутатионредуктаза ............................................................................33

Глутатионпероксидаза ........................................................................33

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа .......................................................34

Изоцитратдегидрогеназа .....................................................................35

Каталаза ................................................................................................36

Креатинкиназа .....................................................................................37

Лактатдегидрогеназа ...........................................................................39

Лейцинаминопептидаза ......................................................................42

Липаза ...................................................................................................42

5-Нуклеотидаза ....................................................................................44

Сорбитолдегидрогеназа ......................................................................44

Супероксиддисмутаза .........................................................................44

Фосфатазы. Щелочная фосфатаза ......................................................45

Кислая фосфатаза ................................................................................48

Тартрат-резистентная кислая фосфатаза (TRACP 5B) .....................49

Холинэстераза ......................................................................................50

Эластаза ................................................................................................52

Ферменты как аналитические реагенты в клинической химии ..........54

Некоторые аспекты энзимотерапии ..........................................................59

Список сокращений ......................................................................................62

Список литературы .......................................................................................63

ВВЕДЕНИЕ. ЗАДАЧИ И НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ

ЭНЗИМОЛОГИИ

К настоящему времени получены убедительные доказательства, что

современная биология и медицина говорят на языке энзимологии и что

возможности применения ферментов в медицине теоретически безгранич-

ны. Появилась новая дисциплина – медицинская биохимия, развивающаяся

в соответствии с практическими запросами медицины. Медицинской био-

химии принадлежит существенная роль в процессе познания патогенети-

ческих механизмов. Еще два века назад М.В. Ломоносов писал, что «медик

без довольного знания химии совершенно быть не может».

Основная задача медицинской биохимии заключается в выяснении

компенсаторных механизмов нарушенных этапов метаболических процес-

сов в клетке и способов управления этой компенсацией. Успешно развива-

ется новое направление энзимологии – медицинская энзимология, которая

имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и

методы исследования. Медицинская энзимология развивается по трем

главным направлениям: энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимо-

терапии.

Область исследований энзимопатологии является теоретической,

фундаментальной частью патологии. Она призвана изучать молекулярные

основы развития патологического процесса, исходя из данных о наруше-

ниях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального

фермента или группы ферментов. По мере углубления наших представле-

ний о механизмах различных ферментативных реакций все более стано-

вится ясно, что энзиматические нарушения в той или иной степени сопро-

вождают любой патологический процесс в организме. Наиболее ярким

примером этого могут быть молекулярные болезни, называемые также на-

следственные энзимопатии. Это генетически обусловленные нарушения

биосинтеза какого-либо фермента, когда в тканях не продуцируется один

из жизненно важных энзимов, и организм утрачивает «ключи» от опреде-

ленного звена метаболизма, что становится несовместимым с нормальной

жизнедеятельностью. В основе таких нарушений (большинство из них

встречаются редко) лежит мутация какого-нибудь гена, кодирующего оп-

ределенный фермент. Под контролем мутантного гена синтезируется де-

фектный фермент, у которого в том или ином ключевом участке полипеп-

тидной цепи может стоять «неправильная» аминокислота; кроме того, ка-

кой-нибудь аминокислотный остаток может быть утрачен или, наоборот,

включен в полипептидную цепь. В одних случаях такой наследственно из-

мененный фермент неактивен вообще, а в других проявляет лишь часть

присущей ему активности, поскольку характерное для него значение

(или V

max

) не соответствует норме. Большинство наследственных энзи-

мопатий сопровождается накоплением промежуточных продуктов обмена.

При некоторых заболеваниях такого рода нарушается нормальное развитие

нервной ткани, что приводит к умственной отсталости. Примером может

являться фенилпировиноградная олигофрения (фенилкетонурия). Этот

аферментоз по фенилаланингидролазе (называемой также фенилаланин-4-

монооксигеназой), катализирующей первый этап фенилаланин-

тирозинового метаболического пути, а именно гидроксилирование фени-

лаланина до тирозина, встречается у одного ребенка на каждые 15 000–

20 000 обследованных. Нормальное умственное развитие такого ребенка

зависит от ранней диагностики и своевременного назначения специальной

диеты.

По классификации А.А. Покровского к ферментопатиям относятся:

1) наследственные энзимопатии; 2) токсические энзимопатии; 3) алимен-

тарные энзимопатии, вызванные нарушениями нейрогуморальных регуля-

ций; и 4) группа различных патологических процессов, сопровождающих-

ся нарушением и/или изменением ферментативных реакций.

Энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматиче-

ских болезней. Созданы крупные научные центры и научно-

исследовательские институты, в которых ведутся работы по выяснению

молекулярных основ атеросклероза, злокачественного роста, ревматоид-

ных артритов и др. Нетрудно представить огромную роль ферментных

систем или даже отдельных ферментов, нарушение регуляции активности

и синтеза которых приводит к формированию или развитию патологиче-

ского процесса.

Второе направление медицинской энзимологии – энзимодиагности-

ка – развивается по двум путям. Один путь – использование ферментов в

качестве избирательных реагентов для открытия и количественного опре-

деления нормальных или аномальных химических веществ в сыворотке

крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление при помощи

ферментов глюкозы, белка или других веществ в моче, в норме не обнару-

живаемых). Другой путь – открытие и количественное определение самих

ферментов в биологических жидкостях при патологии. Оказалось, что ряд

ферментов появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их

название «некротические ферменты»).

Для диагностики органических и функциональных поражений орга-

нов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно

отличающиеся от других химических диагностических тестов, используе-

мых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно

около 20 тестов, основанных на количественном определении активности

ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а

также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). В практиче-

ском плане энзимологические тесты должны помогать в ранней постановке

и дифференциации диагноза, информировать о возможном исходе болезни

и эффективности применяемой терапии. Теоретические аспекты медицин-

ской энзимологии сводятся, в основном, к выяснению наиболее полной и

достоверной картины патогенеза и этиологии заболевания, т.е. в конечном

итоге к познанию молекулярных механизмов нарушений метаболических

процессов.

Успехи клинической энзимологии позволяют в настоящее время по-

лучить ценные и многосторонние показатели для диагностики заболева-

ния. Однако для правильной интерпретации результатов проведенных ис-

следований обязательным является сопоставление энзимопоказателей с

клинической картиной болезни в целом. В большинстве случаев биохими-

ческие тесты не определяют, а только подкрепляют и обосновывают по-

ставленный диагноз. При оценке выявленных нарушений необходима оп-

ределенная осторожность, так как один и тот же энзиматический сдвиг

может являться звеном патогенетической причинной цепи или характери-

зовать вторичные механизмы, сопутствующие данной форме патологии,

или, наконец, быть связанным со стереотипной, неспецифической реакци-

ей организма на заболевание, такой, как реакция стресса.

В связи с этим весьма ответственным моментом в энзимодиагности-

ке является правильный выбор ферментативного теста или комплекса того,

что и как определять. В большинстве случаев клиницисты используют в

энзимодиагностике комплекс прямых и косвенных методов исследования

ферментов. Иногда появление в крови фермента, в норме в ней отсутст-

вующего, позволяет сразу обнаружить поврежденный орган. Это возможно

в том случае, когда фермент присутствует только в одном органе. Напри-

мер, орнитинкарбомоилтрансфераза найдена только в печени. Однако та-

ких высокоорганоспецифичных ферментов очень мало. Несколько больше

ферментов, обнаруженных в двух органах или тканях. Большинство же

ферментов широко распространены в организме, что затрудняет выяснение

источника их происхождения.

Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500),

открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической

энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для

весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органи-

ческие поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.). Так, уро-

вень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен

при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной желе-

зы, болезнях печени и др. Резко повышается в сыворотке крови уровень

двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и ее изоферментов) и лактатдегид-

рогеназы (и ее изоферментов) при инфаркте миокарда; умеренно повыше-

но их содержание при поражениях тканей мозга и печени. Определяют,

кроме того, активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карци-

номе предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэстеразы и дру-

гих органоспецифических ферментов (например, гистидазы, глицинамиди-

нотрансферазы, уроканиназы) в сыворотке крови при патологии костной

ткани, печени, метастатических карциномах и т. д. Доказано, что органы и

ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изофер-

ментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и су-

точным колебаниям. Существует большой градиент концентрации фер-

ментов между внутриклеточными и внеклеточными компартментами. По-

этому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функ-

циональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внекле-

точное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперфер-

ментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца не рас-

шифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме кро-

ви прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени дей-

ствия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур

органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое

значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови

каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного

времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является

также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в ин-

дивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

В последнее время стали применять ферменты рестрикции – специ-

фические эндонуклеазы, катализирующие разрывы межнуклеотидных свя-

зей ДНК, для диагностики фенилкетонурии, α- и β-талассемии и других

наследственных болезней человека. Метод основан на полиморфизме ре-

стрикционных фрагментов ДНК.

Из представленных данных следует, что диагностическая энзимоло-

гия может служить основой не только для постановки правильного и свое-

временного диагноза болезни, но и для проверки эффективности приме-

няемого метода лечения.

Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущест-

венно идет по двум перспективным направлениям медицинской энзимоло-

гии: по пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных

методов и по пути поиска новых органоспецифических (тканеспецифиче-

ских) ферментов и изоферментов.

Третье направление медицинской энзимологии – энзимотерапия,

т.е. использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов)

действия ферментов в качестве лекарственных средств, имеет пока не-

большую историю. До сих пор работы в этом направлении почти не выхо-

дят за рамки эксперимента за некоторым исключением.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Энзимы сыворотки принято делить на 3 группы:

1. Клеточные ферменты поступают в кровь из органов и тканей.

Уровень их сывороточной активности зависит от содержания энзимов в

тканях, молекулярной массы, внутриклеточной локализации, прочности

связи фермента со своей органеллой, а также от скорости гидролитическо-

го расщепления и элиминации. Клеточные ферменты принято делить на

неспецифические и органоспецифические. Активность первых обнаружива-

ется во всех органах и тканях, поэтому по увеличению их сывороточной

активности трудно судить о локализации первичных патологических изме-

нений; вторые находятся в одном-двух органах – это наиболее информа-

тивные энзимы, т.к. увеличение их активности свидетельствует о пораже-

нии этих органов.

2. Секреторные ферменты синтезируются клетками, поступают в

кровь и выполняют специфические функции в кровяном русле, поэтому их

называют собственно ферментами крови. Это ферменты свертывающей сис-

темы и фибринолиза, каллекриин-кининовой системы, холинэстераза и др.

3. Экскреторные ферменты образуются пищеварительными желе-

зами и из их секретов поступают в кровь (амилаза, липаза и др.).

Процессы синтеза, функционирования и распада ферментов идут не-

прерывно и одновременно и обеспечивают определенный уровень их ак-

тивности в тканях. Большинство ферментов сыворотки крови первично

синтезируются в клетках, где их концентрация существенно выше, чем в

сыворотке. В кровоток ферменты попадают в результате повреждений кле-

ток или их мембран, естественной гибели клеток, часть ферментов активно

секретируются в систему циркуляции. При повышенной гибели клеток

увеличивается содержание и соответственно активность ферментов в сис-

теме циркуляции. Помимо усиленной гибели клеток повышение активно-

сти ферментов в сыворотке крови может быть обусловлено:

– повышенной пролиферацией клеток с ускорением клеточного цик-

ла (опухолевый рост);

– повышенным синтезом ферментов;

– обструкцией путей секреции ферментов в полости;

– снижением клиренса

Поскольку ферменты локализуются в различных клеточных компар-

тментах, таких как цитозоль, лизосомы, клеточная мембрана или митохон-

дрии, то появление определенной группы ферментов может свидетельст-

вовать о степени и тяжести повреждения клеток.

Клиренс – скорость очищения плазмы крови, других сред или тканей организма

от какого-либо вещества в процессе его биотрансформации, перераспределения в орга-

низме и/или выделения из организма.

Например, такие ферменты, как кислая фосфатаза, 5’-нуклеотидаза,

гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ), локализованы в клеточной мембране.

Аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ),

лактатдегидрогеназа (ЛДГ), креатинкиназа (КК) находятся в цитоплазме.

АсАТ и КК обнаружены также и в митохондриях. Здесь же находятся та-

кие ферменты, как уроканиназа, глутаматдегидрогеназа (ГДГ). Щелочная

фосфатаза (ЩФ) локализована в лизосомах.

Снижение активности ферментов по сравнению с нормальными зна-

чениями может быть при сниженном синтезе, врожденных дефицитах, в

присутствии ингибиторов активности фермента, при агрегации молекул

ферментов.

О механизмах удаления ферментов из системы циркуляции или ин-

гибирования их активности известно мало. Большинство ферментов, по-

видимому, катаболизируется плазменными протеазами и удаляется рети-

кулоэндотелиальной системой. Часть ферментов выделяется со слюной,

желчью и другими секреторными жидкостями. Через почечный фильтр не-

большие молекулы с молекулярной массой не более 60–70 кДа, поэтому в

норме количество экскретируемых ферментов невелико. К ним относятся

амилаза, которая фильтруется в клубочках почек. Активность амилазы в

сыворотке повышается при острой почечной недостаточности, для других

ферментов практически неизвестны ситуации, при которых менялся бы их

клиренс, т.е. скорость удаления из крови.

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ

КОНСТЕЛЛЯЦИЙ. УЧЕТ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИСТЕМ

ПРИ ЭНЗИМОДИАГНОСТИКЕ

В последнее время особое внимание уделяется исследованию не

отдельных ферментативных реакций, а их сочетаний в комплексах (так

называемых констелляционных типов), которые наиболее информативно

отражают существо тех или иных патобиохимических нарушений. В на-

стоящее время такие ферментативные констелляции систематизированы

для различных видов патологии печени, мышечной ткани, воспалитель-

ных процессов, злокачественных новообразований и т. д. В результате

комплексных исследований можно говорить об определенных биохими-

ческих синдромах, характеризующих отдельные заболевания, и о надеж-

ности лабораторных методов, помогающих врачу в объективной оценке

патологии.

Для уточнения диагноза желательно определение изоферментного

спектра того или иного фермента, выявление изменения функционирова-

ния пато- и органоспецифичных изоферментов, а также сопоставление ак-

тивности обнаруженных в крови ферментов с их активностью в органах и

тканях в норме.

При оценке функции печени все ферменты сыворотки можно разделить

на универсально распространенные энзимы, органоспецифичные ферменты и

экскреторные ферменты. К 1-й группе ферментов относятся трансаминазы и

фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза. Во 2-ю органоспецифических ферментов

может быть отнесен комплекс энзимов: фруктозо-1-фосфатальдолаза, орни-

тинкарбомоилтрансфераза, сорбитдегидрогеназа, уроканиназа. К 3-й группе

экскреторных ферментов можно отнести щелочную фосфатазу, b-

глюкуронидазу и некоторые др. При различных формах поражения печени

могут быть выделены характерные изменения ферментного профиля сыво-

ротки; сочетание различных проб может помочь дифференцировать вирус-

ный гепатит от токсического, разграничить различные виды желтух, уточ-

нить причину, остроту, тяжесть и прогноз болезни. Следует подчеркнуть, что

особое значение в трактовке биохимических тестов приобретают сопоставле-

ния их с особенностями клиники.

В некоторых случаях при энзимодиагностике для суждения об ак-

тивности фермента не обязательно непосредственное его исследование, а

можно ограничиться определением легко доступных метаболитов в крови

и моче, изменение которых может отражать функцию той или иной фер-

ментной системы. При этом необходимо знание механизма действия фер-

ментов, его регуляции и взаимосвязи ферментативных процессов.

Необходимо помнить, что при трактовке данных энзимодиагностики

рекомендуется учитывать особенности функционирования биокаталитиче-

ских систем, среди которых особое значение имеет биологическая индиви-

дуальность. В настоящее время четко показано, что здоровым людям при-

сущ генетически обусловленный полиморфизм белкового спектра, не свя-

занный с развитием каких-либо патологических состояний. Такой поли-

морфизм обнаружен и в отношении ферментов. Вероятно, в будущем ста-

нет возможным объединение людей в группы в зависимости от особенно-

стей генетического полиморфизма, характеризующегося различными фер-

ментными профилями. При оценке результатов энзимодиагностики необ-

ходимо учитывать также суточные колебания ферментативной активности

и другие биоритмы. Наличие таких колебаний с большим размахом от

среднего значения доказано экспериментально. Наконец, следует помнить

о важнейшей особенности живого организма – адаптации. Изменение ак-

тивности фермента может быть вызвано качеством и количеством питания

или приемом определенных фармакологических средств, которые могут

выступать в качестве индуктора ферментсинтезирующей системы (или,

наоборот, ингибировать ее отдельные звенья). Хорошо известно, что почти

любое лекарство оказывает влияние на состояние ферментных систем, и

это часто является решающим фактором в клиническом эффекте действия

лекарственных веществ.

В клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) измерения актив-

ности ферментов обычно проводят в сыворотке крови, но ферменты можно