Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

Подождите немного. Документ загружается.

Федеральное агентство по образованию

ГОУ ВПО «Уральский государственный технический университет − УПИ»

Г.С. Сакович, М.А. Безматерных

ФИЗИОЛОГИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ

Учебное электронное текстовое издание

Подготовлено кафедрой «Технология органического синтеза»

Научный редактор: доц., канд. хим. наук И.С. Селезнева

Методическая разработка к лабораторным занятиям по курсам "Общая био-

логия и микробиология" и "Основы микробиологии" для студентов дневной

формы обучения специальностей 070100 – Биотехнология и 320700 – Охра-

на окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов.

Разработка является продолжением пособия «Морфология микроорга-

низмов». В ней описаны методы и условия культивирования микроорга-

низмов. Особое внимание уделено принципам подбора питательных сред,

их классификации и влияния на физиологию и метаболизм микроорга-

низмов. Подробно описаны способы учета микроорганизмов и сущность

метода счета колоний при оценке микробной обсемененности объекта.

Екатеринбург

2005

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 2 из 40

ВВЕДЕНИЕ

Организация любого микробиологического синтеза практически важ-

ных веществ начинается с изучения физиологии продуцента. Необходимо

изучить характер питания продуцента, а также влияние внешних факторов на

состояние клеток и популяций. Вопросы эти выясняются путем оптимизации

исследуемого процесса. Основой для этого является культивирование микро-

организмов в контролируемых и управляемых условиях. В конечном итоге

устанавливают состав сред и режим культивирования, наиболее приемлемые

экономически и, которые в дальнейшем эмпирически возможно совершенст-

вовать при введении процесса в промышленном масштабе.

Чем глубже познается физиологическая и биохимическая изменчивость

микробной клетки, тем больше возможностей открывается для управления

микробным биосинтезом, изменения метаболизма в желаемую сторону. Из-

меняя условия культивирования, можно

изменить состав биомассы и продук-

тов метаболизма. Лимитирование и ингибирование роста приводят к замед-

лению одних процессов биосинтеза, но могут вызвать даже ускорение дру-

гих. На этом основан сверхсинтез тех или иных продуктов.

Данная методическая разработка является продолжением лабораторно-

го практикума, изложенного в пособии «Морфология микроорганизмов».

Занятие 5

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель

занятия – ознакомление с основными питательными средами,

принципами их приготовления, способами стерилизации и методами выра-

щивания микроорганизмов в лабораторных условиях.

Вопросы для обсуждения:

1. Определение понятий «культивирование микробов», «культура», «клон»,

«колония», «штамм».

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 3 из 40

2. Условия, необходимые для выращивания микроорганизмов: температура,

аэрация, кислотность среды.

3. Общие требования, которым должны удовлетворять питательные среды.

4. Классификация сред по составу компонентов и назначению.

5. Способы уплотнения сред; вещества, применяемые для уплотнения сред,

их характеристика и области применения.

6. Общеупотребительные (стандартные) среды для выращивания бактерий,

дрожжей, плесеней.

7. Среды

, позволяющие получить преимущественный рост одних микробов

при одновременном подавлении роста других видов.

8. Среды, служащие для изучения ферментативных свойств микробов.

9. Способы стерилизации питательных сред.

10. Способы стерилизации посуды и инструментов.

План занятия:

1. Ознакомиться с условиями выращивания микроорганизмов, свойствами,

классификацией питательных сред, способами их приготовления и стерили-

зации.

.Самостоятельная работа.

Физиология микроорганизмов

Физиология микроорганизмов - это раздел микробиологии, изучающий

процессы жизнедеятельности микробов.

Особенности жизнедеятельности микроорганизмов, т.е. потребности в

питательных веществах (тип питания), способ биологического окисления

(тип дыхания), реакция клетки на воздействие различных факторов среды

обитания, называются физиологическими свойствами.

Знание физиологических свойств микробов необходимо для понимания

их расселения

и поведения в природе, использования в народном хозяйстве.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 4 из 40

В лабораторной практике исследование физиологических свойств микробов

проводится наряду с морфологическими для идентификации микроорганиз-

мов, т.е. определения их названия.

Для исследования физиологических свойств микроорганизмы выращи-

вают в лабораторных условиях.

Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях называется

культивированием, а выращенные на питательной среде микробы – культу-

рой.

Культуры, состоящие из различных видов

микроорганизмов, называют

смешанными; культуры, состоящие из одного вида микробов – чистыми.

При специальных способах посева, когда в питательную среду вносит-

ся одна клетка, в результате ее размножения образуется совокупность особей,

которая называется клон. Если клон развивается на поверхности плотной пи-

тательной среды, по мере роста числа особей он образует видимое

невооруженным

глазом скопление микробов, которое называется колонией.

Микроорганизмы одного вида, выделенные из определенного источни-

ка внешней среды (из почвы, организма человека, животного, пищевого про-

дукта и т. д.), называются штаммом. Например, если стафилококк одного

вида выделен из пяти источников (пяти разных порций продукта, от пяти

разных человек и т. д.), считают

, что получено, пять штаммов данного вида

стафилококка.

На занятиях по данной теме рассматриваются условия выращивания

микроорганизмов и методы количественного учета микроорганизмов.

Условия выращивания микроорганизмов

Температура. Для оптимального развития микроорганизмов необхо-

дима температура, соответствующая видовым потребностям культуры.

Большинство видов бактерий активно размножается при температуре 36–37°

С, мицелиальные грибы - при 25–З0° С. Это

мезофильные микроорганизмы.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 5 из 40

Холодолюбивые (психрофильные) микроорганизмы развиваются при темпе-

ратуре в пределах от 0 до 20° С. Для теплолюбивых (термофильных) микро-

организмов оптимальная температура роста 45–65° С. При отклонении тем-

пературы от оптимальной развитие микроорганизмов задерживается. Поэто-

му их выращивают в специальных термостатах - шкафах с термоизоляцией, в

которых поддерживается постоянная температура, соответствующая потреб-

ностям культур.

Свет.

Большинство микроорганизмов не нуждается в свете, а прямые

солнечные лучи подавляют их развитие.

Аэрация. Потребности в свободном кислороде у микроорганизмов не-

одинаковы. Микроорганизмы аэробы и факультативные анаэробы выращи-

вают при доступе кислорода в обычных условиях воздушной среды.

Культивирование анаэробов производится в бескислородных условиях,

которые создаются различными приемами. Наиболее простой способ -

меха-

ническая защита микроорганизмов от воздуха путем выращивания их в вы-

соком слое жидкой среды (в пробирке до 10-15 мл). Для этого поверхность

среды заливается тонким слоем стерильного вазелинового масла или пара-

фина. Диффузия кислорода из воздуха в жидкие среды уменьшается при за-

гущении среды агар-агаром (0,2–0,3 %). При использовании плотных сред

посев

осуществляется в чашках Петри под слоем агара.

Строгие анаэробные микроорганизмы выращивают в специальных ап-

паратах - стеклянных вакуумных эксикаторах или анаэростатах.

Сроки культивирования. В соответствии с закономерностью роста

большинство культур бактерий выращивают в течение 24–48 ч. Микроскопи-

ческие грибы культивируют в течение недели.

Питательные среды

Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения

микроор-

ганизмов, а также для выращивания культур с целью исследования их обмена

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 6 из 40

веществ или получения ценных продуктов метаболизма. В лабораторных ус-

ловиях микроорганизмы выращивают также при качественном анализе мик-

рофлоры различных объектов, при количественном анализе - для подсчета

жизнеспособных клеток.

Среда должна включать все компоненты, необходимые для конструк-

тивных и энергетических процессов клетки, – источники элементов-

органогенов – С, Н, О, N; зольные элементы – Р, S, К, Mg, Fe, Ca; микроэле

менты – Ni, Cu, Co, Zn и др.; для некоторых микробов необходимо присутст-

вие в питательной среде витаминов. Питательная среда должна содержать

определенное количество воды, так как питательные вещества поступают в

клетку только лишь в растворенном виде на основе физических законов ос-

моса.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения

ими энергии разнообразны, следовательно, и очень

различны их потребности

в источниках питания. Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково

пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Разнообразие обмена веществ микроорганизмов проявляется прежде всего в

их отношении к источникам углерода и азота; вот почему эти элементы пред-

ставлены в средах различными веществами и именно они определяют специ

фичность сред.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве

единственного источника углерода углекислоту воздуха или карбонатов. Для

развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более

восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолого-

биохимических особенностей организма могут быть представлены различ-

ными органическими соединениями, например, спиртами, углеводами, угле-

водородами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и

к источнику азота. Для

культивирования микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот, ис-

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 7 из 40

пользуют среды, не содержащие соединений азота. В состав всех других сред

входят различные азотсодержащие соединения. Это могут быть нитраты или

соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны микро-

организмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных эле-

ментах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет

одних и тех же

минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для

многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Кроме элементов, необходимых для конструктивных процессов, среда

должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования

гетеротрофных организмов соединения углерода в большинстве случаев яв-

ляются и энергетическим материалом. В

средах для хемоавтотрофных орга-

низмов эту роль выполняют минеральные соли.

Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязатель-

но учитывать особенности обмена веществ микроорганизмов. Кроме того,

среды для одного и того же микроорганизма могут быть разными в зависи-

мости от задач исследования. Например, среда для длительного сохранения

микроорганизма в лабораторных

условиях заметно отличается от сред, пред-

назначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ.

К питательных средам для выращивания микроорганизмов предъявля-

ют определенные требования: они должны содержать необходимые пита-

тельные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, мине-

ральные вещества, витамины); должны быть изотоничны по отношению к

микробной клетке; обладать

буферными свойствами; иметь оптимальную

вязкость и определенный окислительно-восстановительный потенциал. Обя-

зательное условие - стерильность питательных сред, поскольку посторонние

микроорганизмы изменяют свойства среды и затрудняют культивирование и

изучение определенных микробов.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 8 из 40

Питательные среды различаются по составу, назначению и консистен-

ции.

По составу среды для культивирования делят на три группы: естест-

венные, или натуральные, искусственные, или полусинтетические, и синте-

тические среды.

Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов живот-

ного и растительного происхождения. К таким средам относятся овощные

или фруктовые соки, животные ткани

, разведенная кровь, молоко, вода мо-

рей, озер и минеральных источников, а также отвары или экстракты, полу-

ченные из природных субстратов, как, например, мясо, навоз, почва, различ-

ные части растений. На натуральных средах хорошо развиваются многие

микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компо-

ненты, необходимые для их

роста и развития. Однако эти среды имеют

сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения

физиологии обмена веществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть

потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по

ходу развития. Натуральные среды используются главным образом для по-

держания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагности

ческих целей.

Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые ши-

роко применяются в лабораторной практике, служат мясопептонный бульон,

неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенная

вытяжка.

К искусственным, или полусинтетическим, средам относят среды, в

состав которых наряду с соединениями известной химической природы вхо-

дят вещества неопределенного состава - природные продукты. Такие

среды

находят широкое применение в технической микробиологии для получения

аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизне-

деятельности микроорганизмов.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 9 из 40

К полусинтетическим средам относятся, например, мясопептонный

бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельная среда с глюко-

зой и пептоном. Основой в указанных средах является компонент неопреде-

ленного состава.

К полусинтетическим средам следует отнести также среды, главными

частями которых являются соединения известного состава - углеводы, нитра-

ты или соли аммония, фосфаты и другие

, а соединения неопределенного со-

става - гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт - до-

бавляются в качестве факторов роста и витаминов.

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только оп-

ределенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных кон-

центрациях. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обме-

на веществ микроорганизмов. Зная

точный состав и количество входящих в

среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соот-

ветствующие продукты обмена.

Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности

микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена

веществ. В зависимости от потребностей микроорганизмов синтетические

среды могут иметь относительно большой набор компонентов, как, напри

мер, среды для ряда молочнокислых бактерий, но могут быть и довольно

простыми по составу, как среды для автотрофных микроорганизмов.

В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопровод-

ной воде и микроэлементы не добавляют, так как они в небольших количест-

вах всегда содержатся в водопроводной воде и могут поступать в среду

из

стекла посуды. Как правило, ограничиваются внесением только тех микро-

элементов, к которым изучаемый микроорганизм проявляет повышенную

требовательность.

В специальных целях, например, при изучении потребностей микроор-

ганизмов в отдельных компонентах минеральных солей, для приготовления

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 10 из 40

синтетических сред используют дистиллированную воду. В этом случае мик-

роэлементы вносят в среду обязательно.

По назначению различают общеупотребительные (стандартные), элек-

тивные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.

Обычные, или общеупотребительные (стандартные), среды пригодны

для выращивания большинства микробов: мясопептонный бульон (МПБ),

мясопептонный агар (МПА), мясопептоновый желатин (МПЖ) и др.

Элективные среды обеспечивают

преимущественное развитие одного

вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или даже совсем не-

пригодны для развития других. Элективные среды применяют главным обра-

зом для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообита-

ния или для получения накопительных культур определенного вида из мате-

риала, содержащего смешанную культуру (сахарный бульон, желчный буль-

он

, агар с кровью и т. д.).

Дифференциально-диагностические среды служат для дифференциа-

ции различных видов микроорганизмов на основании различий в обменных

процессах. В состав этих сред обычно вводят вещества, позволяющие изу-

чить особенности ферментов исследуемых культур. Дифференциально-

диагностическими средами пользуются в основном для идентификации неиз-

вестных видов микроорганизмов. К ним

относятся среды для определения

способности микробов к расщеплению белков (мясопептонный желатин),

ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо и др.), гемолитической способ-

ности (кровяной агар), восстановительной способности (среды, содержащие

красители, обесцвечивающиеся при восстановлении и др.) и т.д.

В настоящее время многие питательные среды для лабораторных ис-

следований изготовляют фабричным способом и выпускают

в виде порошка.

Для хранения питательных сред и выращивания микроорганизмов

обычно используют стеклянную посуду различной вместимости.

По консистенции различают жидкие, плотные и сыпучие среды.