Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №1

Подождите немного. Документ загружается.

Тестостерон относится к гормонам липофильной

группы, рецепторы для которого расположены на

внутренней поверхности мембраны [18, 21, 22].

Вероятно, проникающий в клетки ДМ может

изменять состояние компонентов и, в частности,

участков мембраны, среди которых участки,

включающие рецепторы для тестостерона. В связи

с этим мы считали целесообразным исследовать

поведение клеток тестикулярной ткани при дейст-

вии на них специфических модификаторов стерои-

догенеза гликопротеиновых гормонов гипофиза:

гонадотропинов, фолликулостимулирующего

гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ).

Известно, что ЛГ, связываясь со специфическими

рецепторами клеток, стимулирует образование

тестостерона в клетках Лейдига [17, 18]. Подоб-

ным эффектом обладает хориальный гонадотропин

[23]. По мнению большинства исследователей,

ФСГ участвует в транспорте тестостерона и усили-

вает функцию ЛГ. В качестве стимуляторов сте-

роидогенеза мы использовали 10%-й ЭГ, конечная

концентрация которого в инкубационной среде

составляла 10 мкл/мл. В работе [1] показано, что

применение более высоких концентраций сопро-

вождается меньшим стимулирующим эффектом

(рис. 3). Клетки тестикулярной ткани без криопро-

тектора реагировали на введение ЭГ повышением

уровня тестостерона в среде инкубации.

При введении в среду инкубации 5% ДМ уро-

вень секреции тестостерона по сравнению с конт-

рольными образцами повышался. Возможно, при-

сутствие ДМ способствовало усилению стимули-

рующего эффекта ЭГ, такая же картина наблюда-

лась и в присутствии 7%-й концентрации данного

криопротектора. Дальнейшее повышение концен-

трации ДМ в среде инкубации приводило к сниже-

нию стимулирующего влияния ЭГ, т.е. ингибирова-

нию стимулируемой секреции.

Âûâîäû

Установлено, что ДМ существенно не влияет

на жизнеспособность клеток тестикулярной ткани,

однако его присутствие в среде изменяет функцио-

нальные характеристики ткани, а именно: малые

концентрации ДМ (5–7%) усиливают действие

стимуляторов стероидогенеза, более высокие (12–

15%) – ингибируют, 10%-я концентрация занимает

промежуточное место.

Поэтому в дальнейшем при разработке способа

криоконсервирования тестикулярной ткани кролика

мы использовали концентрации ДМ 7,5–10%.

Автор выражает благодарность зав. отделом

криобиохимии и фармакологии нейрогуморальных систем

ИПКиК НАН Украины д.б.н., профессору Т.П. Бондаренко

за консультативную помощь в написании статьи.

obtained data about the decrease of redistributed con-

tent between cell and hormone medium in the presence

of 7.5–15% DM concentrations one may explain with

impaired secretion processes.

Testosterone is a hormone of lipophilic group, for

which the receptors are placed on inner surface of

membrane [18, 21, 22]. It is possible that penetrating

DM into cells may change its state and particularly,

membrane areas, among which there are those,

comprising the receptors for testosterone. Therefore,

we considered as expedient to study the behavior of

testicular tissue cells during the effect on them of spe-

cific steroidogenesis modifiers of glycoprotein hormo-

nes of hypophysis, such as gonadotropins, follicle

stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH).

It is known that LG, binding with specific receptors of

cells stimulates the testosterone formation in the Ley-

dig’s cells [17, 18]. Same effect has a choriogonado-

tropin [23]. According to the majority of researches

FSH takes a part in testosterone transport and stimu-

lates LH. As the stimulators of steroidogenesis we

used 10% HE, which final concentration was 10 ml/ml.

It has been shown in the work that using higher con-

centrations is accompanied with less stimulating effect

(Fig. 3). Cells of testicular tissue without cryoprotectant

respond to introduction of HE by the increase of testo-

sterone level in incubation medium.

100

120

140

160

180

200

Уровень тестостерона, нг/г

Testosterone level, ng/g

Контроль

Control

7,5 10 12,5 15

Концентрация ДМ, %

DM concentration, %

Рис. 3. Уровень тестостерона в среде инкубации при раз-

личных концентрациях криопротектора ДМ и после

введения ЭГ (n = 6): – без ЭГ; – в присутствии ЭГ,

30 мин; * – различия достоверны относительно конт-

роля, P < 0,05; ** – различия достоверны относительно

данных для образцов без введения ЭГ, P<0,05.

Fig. 3. Testosterone level in incubation medium under dif-

ferent concentrations of DM cryoprotectant and after HE

introduction (n = 6): – without HE; ; – 30 min after

introduction of HE; * – differences are statistically

significant comparing to the control, P < 0.05; ** – differences

are statistically significant comparing to the data of samples

without HE introduction, P < 0.05.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

When adding into incubation medium 5% of DM

the testosterone secretion level was increased in com-

parison with control samples. Probably, the DM pre-

sence stimulated the effect of HE, the same process

was observed in the presence of 7% concentration of

this cryoprotectant. Further increasing of DM con-

centration in incubation medium results in reducing of

stimulating effect of HE, i.e. inhibition of stimulated

secretion.

Conclusions

It has been established, that DM does not signifi-

cantly affect the viability of testicular tissue cells,

however its presence in medium changes functional

characteristics of tissue, namely, low concentrations

of DM (5–7%) strengthen the stimulators of steroido-

genesis, higher ones (12–15%) inhibit and 10% con-

centration has a transitional location.

Therefore, during development of rabbit’s testicular

tissue cryopreservation method we used 7.5-10% DM

concentrations.

The author aknowledges the Head of Department of

Cryobiochemistry and Pharmacology of Neurohumoral

Systems of IPC&C, Doctor of Biological Sciences, Professor

Bondarenko T.P. for consultative assistance in manuscript

preparation.

Литература

Адамс Р. Методы культур клеток для биохимиков.–М.:

Мир, 1983.– 263 с.

Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения

биологических мембран при охлаждении.– Киев: Наук.

думка, 1985.– 257 с.

Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., Луговой С.В. Уровень

тиреоидных гормонов в плазме кроликов при ксено-

трансплантации криоконсервированной органной куль-

туры щитовидной железы неонатальных поросят //

Пробл. криобиологии.– 2001.– №3.– С. 41–42.

Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., Самченко И.И. и др.

Коориметрическое определение жизнеспособности

органной культуры клеток надпочечников и щитовидной

железы // Лабораторная диагностика.– 2001.– №4.–

С. 43–48.

Бондаренко Т.П., Кадникова Н.Г., Алабедалькарим Н.М. и др.

Сравнительное изучение жизнеспособности криоконсер-

вированных культур эндокринных тканей новорожденных

поросят // Пробл. криобиологии.– 2000.– №4.– С. 59–61.

Гальченко С.Е. Особенности криоконсервирования био-

логических объектов с применением больших скоростей

охлаждения: Автореф. дис. … канд. биол. наук.– Харьков,

1990.– 16 с.

Геращенко Г.В. Функціональні характеристики органної

культури надниркових залоз при кріоконсервуванні та

ксенотрансплантації: Автореф. … дис. канд. біол. наук. –

Харків, 2002.– 18 с.

Грищенко В.И., Чуйко В.А., Пушкарь Н.С. Криоконсерва-

ция тканей и клеток эндокринных органов.– Киев: Наук.

думка, 1993.– 174 с.

Карпенко Н.Г., Новиков А.Н., Олейник С.Т. и др. Актив-

ность аденилатциклазы в адренокортикальной ткани при

различных режимах охлаждения с димексидом и

пропандиолом // Пробл. криобиологии.– 1994.– №2.–

С. 41–44.

Керос В.А. Криоконсервирование фетотестикулярной

ткани человека: Дис. ... канд. мед. наук.– Харьков, 2001.–

132 с.

Легач Е.И. Влияние криоконсервирования на адрено-

кортикальную ткань: Дис. … канд. мед. наук.– Харьков,

1998.– 128 с.

Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.Б., Терещенко А.В.

Влияние длительного низкотемпературного хранения

спермы петухов на ее оплодотворяющую способность //

Пробл. криобиологии.– 2000.– №3.– С. 64–71.

Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белоч-

кина И.В. Влияние режимов криоконсервирования на

сохранность микрофрагментов поджелудочной железы

поросят // Пробл. криобиологии.– 2000.– №2.– С.76–80.

Чуйко В.А. Механизм криозащитной эффективности и

фармакологические свойства ДМСО // Криобиология.–

1989.– №1.– С.3–10.

Юрченко Г.Г., Чадаев В.Е., Чуб Н.Н., Лобынцева Г.С.

Использование амниотической оболочки для снижения

иммунного ответа на аллотрансплантацию криоконсер-

вированной ткани яичника // Тези I з’їзду Укр. т-ва

кріобіології i кріомедицини.– Харків, 1995.– С. 283.

Karpenko L.G., Gubina N.F., Schirova V.A., Kaprelyants A.S.

The effects of freezing and cryoprotectant exposure on

adenylate cyclase activity in cell membranes of bovine thyroid

gland and adrenal cortex // Cryo Letters.– 2001.– Vol. 22,

N4.– P. 229–234.

Malis C.D., Bonventre J. Susceptibility of mitochondrial

membranes to calcium and reactive oxygen species:

implication for ishemic and toxic tissue damage // Prog. Clin.

Biol. Res.– 1988.– Vol. 282.– P. 235–259.

Manna P.R., Tena-Sempere M., Huhtaniemi I.T. Molecular

mechanisms of thyroid hormone-stimulated steroidogenesis

in mouse Leydig tumor cells. Involvement of the steroidogeneic

References

Adams R. Methods of cell cultures for biochemists.– Moscow:

Mir, 1983.– 263 p.

Belous A.M., Bondarenko V.A. Structural changes of biological

membranes during cooling.– Kiev: Naukova Dumka, 1985.–

257 p.

Bondarenko T.P., Volkova N.A., Lugovoy S.V. Thyroid hormone

level in rabbits’ blood plasma at xenotransplantation of cryo-

preserved organ culture of neonatal piglets’ thyroid gland //

Problems of Cryobiology.– 2001.– N3.– P. 41–42.

Bondarenko T.P., Volkova N.A., Samchenko I.I. et al. Calo-

rimetric determination of organ culture viability of adrenal and

thyroid glands cells// Laboratornaya Diagnostika.– 2001.– N4.–

P. 43–48.

Bondarenko T.P., Kadnikova N.G., Alabedalkarim N.M. et al.

Comparative study of cryopreserved cultures viability of

newborn piglets’ endocrine tissues// Problems of Cryobio-

logy.– 2000.– N4.– P. 59–61.

Galchenko S.E. Characteristics of biological objects’

cryopreservation with application of higher cooling rates:

Abstract of authors thesis of Candidate of Biological

Sciences.– Kharkov, 1990.– 16 p.

Geraschenko G.V. Functional characteristics of organ culture

of adrenal glands at cryopreservation and xenotransplan-

tation: Abstract of authors thesis of Candidate of Biological

Sciences.– Kharkov, 2002.– 18 p.

Grischenko V.I., Chuyko V.A.,. Pushkar N.S. Cryopreservation

of tissues and cells of endocrine organs.– Kiev: Naukova

Dumka, 1993.– 174 p.

Karpenko N.G., Novikov A.N., Oleynik S.T. et. al. Activity of

adenylate cyclase in adrenocortical tissue at different

regimens of cooling with dimexide and propanediol // Problems

of Cryobiology.– 1994.– №2.– P. 41–44.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

acute regulatory (StAR) protein // J. Biol. Chem.– 1999.–

Vol. 274, N9.– P. 5909–5918.

McGann L.E., Walterson M.L. Cryoprotection by dimethyl

sulfoxide and dimethyl sulfone // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24,

N1.– P. 11–16.

Pascual G., Garcia-Honduvilla N., Rodriguez M. et al. Effect

of the thawing process on cryopreserved arteries // Ann.

Vasc. Surg.– 2001.– Vol. 15, N6.– P. 619–627.

Saez J.M. Leydig cells: endocrine, paracrine and autocrine

regulation // Endocr. Rev.– 1994.– Vol. 15, N5.– P. 574–626.

Weber C, Pi-Sunyer F.X., Nilaver G., Reemtsma K. Murine

islet cryohreservation and corticosteroids: functional studies //

Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N2.– P. 219–225.

Wilson J.D., Griffin J.E., George F.W., Leshin M. The

endocrine control of male phenotypic development // Aust. J.

Biol. Sci.– 1983.– Vol. 36, N2.– P. 101–107.

US Patent N6361934 Method and apparatus for cryopre-

servation / E. Acton, G.J. Morris.– Filed 23.06.2000, Published

26.03.2002.

Поступила 26.02.2008

Рецензент А.В. Пахомов

19.

20.

21.

22.

23.

24.

Keros V.A. Cryopreservation of human fetotesticular tissue:

Authors thesis of Candidate of Medical Sciences.– Kharkov,

2001.– 132 p.

Legach E.I. Cryopreservation effect on adrenocortical tissue:

Authors thesis of Candidate of Medical Sciences.– Kharkov,

1998.– 128 p.

Linnik T.P., Grischenko V.I., Artemenko A.B., Tereschenko A.V.

Effect of long-term low temperature storage of fowl sperma-

tozoa on its fertilizing ability// Problems of Cryobiology.– 2000.–

N3.– P. 64–71.

Sandomirsky B.P., Volkova N.A., Galchenko S.E., Belochkina I.V.

Effect of cryopreservation regimens on microfragments integ-

rity of piglets’ pancreas // Problems of Cryobiology.– 2000.–

N3.– P. 64–71.

Chuyko V.A. Mechanism of cryoprotective efficiency and

pharmacological properties of DMSO // Kriobiologiya.– 1989.–

№1.– P. 3–10.

Yurchenko G.G., Chadaev V.E., Chub N.N., Lobyntseva G.S.

Application of amnion for decreasing of immune reaction on

allotransplantation of cryopreserved tissue of ovary //

Proceedings of the 1st Meeting of Ukrainian Society of Cryobiolo-

gy and Cryomedicine.– Kharkov, 1995.– P. 283.

Karpenko L.G., Gubina N.F., Schirova V.A., Kaprelyants A.S.

The effects of freezing and cryoprotectant exposure on

adenylate cyclase activity in cell membranes of bovine thyroid

gland and adrenal cortex // Cryo Letters.– 2001.– Vol. 22,

N4.– P. 229–234.

Malis C.D., Bonventre J. Susceptibility of mitochondrial

membranes to calcium and reactive oxygen species:

implication for ishemic and toxic tissue damage // Prog. Clin.

Biol. Res.– 1988.– Vol. 282.– P. 235–259.

Manna P.R., Tena-Sempere M., Huhtaniemi I.T. Molecular

mechanisms of thyroid hormone-stimulated steroidogenesis

in mouse Leydig tumor cells. Involvement of the steroidogeneic

acute regulatory (StAR) protein // J. Biol. Chem.– 1999.–

Vol. 274, N9.– P. 5909–5918.

McGann L.E., Walterson M.L. Cryoprotection by dimethyl

sulfoxide and dimethyl sulfone // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24,

N1.– P. 11–16.

Pascual G., Garcia-Honduvilla N., Rodriguez M. et al. Effect

of the thawing process on cryopreserved arteries // Ann.

Vasc. Surg.– 2001.– Vol. 15, N6.– P. 619–627.

Saez J.M. Leydig cells: endocrine, paracrine and autocrine

regulation // Endocr. Rev.– 1994.– Vol. 15, N5.– P. 574–626.

Weber C., Pi-Sunyer F.X., Nilaver G., Reemtsma K. Murine

islet cryohreservation and corticosteroids: functional studies //

Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N2.– P. 219–225.

Wilson J.D., Griffin J.E., George F.W., Leshin M. The

endocrine control of male phenotypic development // Aust. J.

Biol. Sci.– 1983.– Vol. 36, N2.– P. 101–107.

US Patent N6361934. Method and apparatus for cryopre-

servation / E. Acton, G.J. Morris.– Filed 23.06.2000, Published

26.03.2002.

Accepted in 26.02.2008

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

УДК 57.043:591.463.2.085

À.Â. ÏÀÕÎÌÎÂ*, Ã.À. ÁÎÆÎÊ, Ò.Ì. ÃÓÐÈÍÀ

Èññëåäîâàíèå ñòåðîèäîãåííîãî ïîòåíöèàëà

áèîëîãè÷åñêîãî ìàòåðèàëà òåñòèñîâ ïîëîâîçðåëûõ

êðûñ ïîñëå êðèîêîíñåðâèðîâàíèÿ

UDC 57.043:591.463.2.085

A.V. PAKHOMOV*, G.A. BOZHOK, T.M. GURINA

Study of Steroidogenic Potential of Post-Thaw

Biological Material of Mature Rats’ Testes

Проведено сравнительное исследование стероидогенных потенциалов биологического материала тестисов половозрелых

крыс после криоконсервирования. Биологический материал тестисов в виде криоконсервированной суспензии клеток

интерстиция (СКИ) обладает большей способностью к синтезу и секреции половых стероидов по сравнению с фрагментами

тестисов. Использование разработанного нами способа криоконсервирования для СКИ приводит к лучшей сохранности

стероидогенных клеток по сравнению с существующими аналогичными режимами.

Ключевые слова: тестостерон, клетки Лейдига, скорость охлаждения, 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, переохлаждение.

Проведено порівняльне дослідження стероїдогенних потенціалів біологічного матеріалу тестисів статевозрілих щурів

після кріоконсервування. Біологічний матеріал тестисів у вигляді кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію (СКІ) має

більшу здатність до синтезу і секреції статевих стероїдів у порівнянні з фрагментами тестисів. Використання розробленого

нами способу кріоконсерування для СКІ дозволяє краще зберігати стероїдогенні клітини у порівнянні з існуючими аналогічними

режимами.

Ключові слова: тестостерон, клітини Лейдига, швидкість охолодження, 3β-гідроксистероїддегідрогеназа, переохолодження.

Comparative study of steroidogenic potentials of biological material of testes of mature rats after cryopreservation was performed.

Biological materials of tsetse as cryopreserved suspension of interstitial cells has higher ability to synthesize and secret sexual steroids

if compared with testes fragments. Use of designed by us cryopreservation method for interstitial cell suspension (ICS) results in

higher integrity of steroidogenic cells if compared with existing analogous regimens.

Keywords: testosterone, Leydig cells, cooling rate, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, overcooling.

* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:

óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38

(057) 373-30-07, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya

str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57

373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

Трансплантация ткани и клеток мужских гонад –

один из способов решения проблем андрогенной

недостаточности, которая развивается как следст-

вие различных патологических состояний организ-

ма или длительной гормональной терапии. Однако

для эффективного использования данного метода

необходимо создать банк полноценного донорского

материала, обеспечивающего его долгосрочное

хранение.

Криоконсервирование мужских гонад позволяет

сохранить значительный стероидогенный потен-

циал биологического материала. В [1, 7–9] опи-

саны программы для замораживания фрагментов

фетальной тестикулярной ткани человека, фраг-

ментов и клеток тестисов взрослых крыс. В качест-

ве криопротектора использовали ДМСО. Образцы

охлаждали со скоростью 1–2°С/мин до темпе-

ратур –40...–70°С с последующим их погружением

в жидкий азот. Медленное охлаждение в этих

режимах позволяет сохранить морфологическую

структуру тканей тестисов.

Transplantation of tissue and cells of male gonads

is one of the ways to solve the problem of androgenic

insufficiency, developing as the result of different

pathological states of an organism or lasting hormonal

therapy. However for efficient use of this method it is

necessary to establish bank of valuable donor’s ma-

terial, providing its long-term storage.

Cryopreservation of male gonads enables to pre-

serve significant steroidogenic potential of biological

material. The reports [1, 7–9] describe the freezing

protocols for the fragments of fetal human testicular

tissue, fragments and cells of adult rats’ testes. DMSO

was used as cryoprotectant. The samples were cooled

with the rate of 1–2°C/min down to the temperatures

of –40...–70°C with following their plunging into liquid

nitrogen. Slow cooling with these regimens allows the

preservation of morphological structure of testes tis-

sue.

However the same cooling rates used for testes

cryopreservation as a cell suspension from our point

of view do not provide the same good outcome on bio-

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Однако аналогичные скорости охлаждения, ис-

пользуемые для криоконсервирования тестисов в

виде клеточной суспензии, по нашему мнению, не

обеспечивают таких же высоких результатов по

сохранности биоматериала, которые получены для

фрагментов. При криоконсервировании клеточ-

ного материала необходимо учесть физические

процессы, происходящие в охлаждаемой системе

при различных скоростях охлаждения в разных

температурных диапазонах для создания наиболее

оптимального режима, позволяющего сохранить

стероидогенные клетки.

На основе данных о сохранности стероидпро-

дуцирующих клеток в зависимости от скорости их

охлаждения в разных температурных интервалах

нами была разработана программа замораживания

биологического материала тестисов взрослых

крыс в виде суспензии клеток интерстиция (СКИ)

[1]. Программа замораживания включала началь-

ную скорость охлаждения 1–2°С/мин, процедуру

программного снятия переохлаждения, последу-

ющее использование более высоких скоростей

(15–20°С/мин) при охлаждении до –40°С и в ин-

тервале температур от –40 до –70°С (20–25°С/мин)

с дальнейшим погружением образцов в жидкий

азот.

Цель работы – исследовать влияние различных

режимов замораживания на сохранность стероидо-

генных свойств СКИ и фрагментов тестисов (ФТ).

В соответствии с поставленной целью предпо-

лагалось решить следующие задачи. Исследовать

сохранность стероидогенных свойств (продукция

тестостерона, 3β-гидроксистероиддегидрогеназ-

ная активность, наличие липидных включений)

СКИ и ФТ, которые были криоконсервированы со

скоростью 1–2°С/мин до –40 и –70°С с последу-

ющим погружением в жидкий азот. На основании

этих данных сделать вывод о влиянии на сохран-

ность материала медленного охлаждения и разной

конечной температуры охлаждения образца перед

погружением в жидкий азот. Дать сравнительную

оценку стероидогенных свойств биологического

материала тестисов в виде СКИ и ФТ.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Эксперименты проведены в соответствии с

“Общими принципами экспериментов на живот-

ных”, одобренными II Национальным конгрессом

по биоэтике (20.09.04 г., Киев) и согласованными с

положениями “Европейской конвенции о защите

позвоночных животных, используемых для экспе-

риментальных и других научных целей” (Страс-

бург, 1985).

Материал тестисов получали от половозрелых

животных в возрасте 4–5 месяцев. После экстирпа-

ции семенники освобождали от оболочки, измель-

material preservation, if compared with those obtained

for the fragments. During cryopreservation of cells it

is necessary to take into account physical processes

occurring in the system under cooling at different

cooling rates within various temperature ranges for

the creation of the most optimal regimens enabling to

preserve steroidogenic cells.

Based on the data about the integrity of steroid-

producing cells depending on their cooling rates within

various temperature intervals we have designed the

freezing protocol for testes biological material of mature

rats as interstitial cell suspension (ICS) [1]. Freezing

program comprised initial cooling rate of 1–2°C, the

procedure of programmable overcooling dismissal,

following use of higher rates (15–20°C) during cooling

down to –40°C and within the temperature interval

from –40 down to –70°C (20–25°C/min) with following

immersion of samples in liquid nitrogen.

The research aim is to study the effect of different

freezing regimens on integrity of steroidogenic pro-

perties of ICS and testes fragments (TFs).

In accordance with the set goal there was proposed

to solve the following tasks: to study the integrity of

steroidogenic properties (production of testosterone,

3β-hydroxysteroiddehydrogenase activity, presence of

lipid inclusions) of ICS and TFs, cryopreserved with

the rate of 1–2°C/min down to –40 and –70°C with

following plunging into liquid nitrogen; based on these

data to conclude on the effect of slow cooling and dif-

ferent final temperature of sample cooling on material

integrity prior to submerging into liquid nitrogen; to

comparatively estimate the steroidogenic properties of

biological material of testes as ICS and FTs.

Materials and methods

The experiments were performed in accordance

with “General principles of experiments in animals”,

approved by the 2

National Congress on bioethics

(20.09.04, Kiev) and coordinated with the statements

of European convention for the “Protection of verteb-

rate animals used for experimental and other scientific

purposes” (Strasbourg, 1985).

The material of testes was obtained from mature

animals aged from 4 to 5 months. After extirpation the

coating was removed from testes, afterwards they

were disintegrated into fragments by 0.5–1 mm

washed-out from blood with medium 199 and used as

the TFs.

For ICS obtaining the testes after extirpation were

subjected to mild treatment with collagenase (4 mg/

ml) in medium 199 with 20 mM Hepes (pH 7.4) at 32–

34°C and constant mixing for 15 min. Prior to

separation of the resulted suspension of cells in sucrose

gradient density the primary sedimentation of tubular

structures was performed, afterwards the fraction of

cells with the density of 1.127–1.176 g/cm

was

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

чали на фрагменты 0,5–1 мм

, промывали от крови

средой 199 и использовали как ФТ.

Для получения СКИ тестисы после экстирпации

подвергали мягкой обработке коллагеназой (4 мг/мл)

на среде 199 с 20 мМ HEPES (рН 7,4) при 32–34°C

и непрерывном встряхивании на протяжении 15 мин.

Перед разделением полученной суспензии клеток

в градиенте плотности сахарозы осуществляли пер-

вичное осаждение тубулярных структур, после

чего была получена фракция клеток плотностью

1,127–1,176 г/см

. Клетки отмывали средой 199 с

20 мМ HEPES (рН 7,4) для дальнейшего использо-

вания в экспериментах.

Показатели ФТ и СКИ на данном этапе иссле-

дований принимали за контрольные (интактный

контроль).

При криоконсервировании ФТ и СКИ использо-

вали раствор криопротектора ДМСО, который

готовили на среде 199 с 20 мМ HEPES и в соот-

ношении 1:1 добавляли к клеткам для достижения

конечной концентрации 10%. Объем замораживае-

мого образца составлял 1 мл.

После добавления раствора криопротектора

образцы охлаждали на программном заморажи-

вателе “Cryoson” (Германия) в криоампулах

(“Nunс”, США). Регистрацию программы замора-

живания проводили при помощи установленной в

криоампулы медь-константановой термопары и

самописца типа “Endim” 622.01.

При криоконсервировании образцов использо-

вали следующие программы:

– программа 1 (для ФТ и СКИ): от 22–24 до –

40°С образцы охлаждали со скоростью 1–2°С/мин.

После достижения температуры –40°С образцы

погружали в жидкий азот;

– программа 2 (для СКИ): от 22–24 до –70°С

образцы охлаждали со скоростью 1–2°С/мин. Пос-

ле достижения температуры –70°С образцы погру-

жали в жидкий азот;

– программа 3 (для СКИ): образцы охлаждали

от 22–24°С со скоростью 1–2°С/мин. После прог-

раммного снятия переохлаждения, предусмотрен-

ного возможностями замораживателя “Cryoson”,

скорость охлаждения до –40°С была 15–20°С/мин, а

в интервале температур от –40 до –70°С – 20–

25°С/мин.

Отогревали образцы на водяной бане при темпе-

ратуре 32–34°С. ДМСО удаляли при постепенном

снижении его концентрации в среде.

Гистохимическое окрашивание на выявление

активности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы

(3β-ГСД) проводили методом, описанным в [6].

Для этого 2–4×10

клеток инкубировались в 2,5 мл

забуференного физиологического раствора (рН 7,4),

содержащего 0,2 мг/мл нитросинего тетразолия,

obtained. The cells were washed out with medium 199

with 20 mM HEPES (pH 7.4) for further use in expe-

riments.

Characteristics of TFs and ICS on this stage of

investigations were considered as control values (intact

control).

During cryopreservation of TFs and ICS there was

used the solution of DMSO cryoprotectant, prepared

with medium 199 with 20 mM HEPES and in 1:1 ratio

was added to cells for achieving the final concentration

of 10%. The volume of the samples under freezing

was 1ml.

After adding the cryoprotective solution the samples

were cooled with programmable freezer “Cryoson”

(Germany) in cryovials (“Nunc”, USA). The recording

of freezing program was performed using the copper-

constantan thermocouple adjusted in cryovials and with

recording device of the “Endim” 622.01 type.

During cryopreservation of the samples the follo-

wing protocols were used:

– program 1 (for TFs and ICS): from 22–24 down

to –40°C the samples were cooled with the rate of 1–

2°C/min. When achieving –40°C the samples were

plunged into liquid nitrogen;

– program 2 (for ICS): from 22–24 down to –70°C

the samples were cooled with the rate of 1–2°C/min.

When achieving –70°C the samples were plunged into

liquid nitrogen;

– program 3 (for ICS): the samples were cooled

from 22–24°C with the rate of 1–2°C/min. After

programmable dismissal of overcooling foreseen with

the capacities of “Cryoson” freezer, the cooling arte

down to –40°C was 15–20°C/min and 20–25°C/min

within temperature interval from –40 down to –70°C.

The samples were thawed on water bath at 32–

34°C. DMSO was removed by stepwise reduction of

its concentration in the medium.

Histochemical staining on revealing the activity of

3b-hydroxysteroiddehydrogenase (3β-HSD) was per-

formed with the method described [6]. For this aim 2–

4×10

cells were incubated in 2.5 ml buffered physio-

logical solution (pH 7.4), containing 0.2 mg/ml nitro-

blue tetrasoliuim, 1 mg/ml NAD and 0.12 mg/ml dehyd-

roepiandrosterone for 90 min at 32–34°C. Positively

stained cells (HSD(+)-cells) had violet staining on

recovered tetrasolium.

Staining with nile red (NR) was performed on the

method reported [10]. The dye (1 g) was diluted in

1 ml DMSO. Prior to staining the solution of dye was

diluted by 1:100 with physiological solution with

phosphate buffer (pH 7.4) and 15ml of this solution

was added to 1 ml of physiological solution with

phosphate buffer. The recording of fluorescence was

done at excitation wavelength 455–500 nm with

fluorescent microscope “Olympus IX 71”.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

1 мг/мл НАД и 0,12 мг/мл дегидроэпиандростерона

в течение 90 мин при 32–34°C. Позитивно окра-

шенные клетки (ГСД(+)-клетки) имели фиолетовую

окраску восстановленного тетразолия.

Окрашивание нильским красным (НК) прово-

дили по методу, описанному в [10]. В 1 мл ДМСО

растворяли 1 мг красителя. Перед окрашиванием

раствор красителя разводили 1:100 физиологичес-

ким раствором на фосфатном буфере (рН 7,4) и

добавляли 15 мкл данного раствора к 1 мл клеточной

суспензии (1–2×10

кл/мл). Окрашивали 10 мин при

32–34°C. После окрашивания клетки однократно

отмывали от избытка красителя 1 мл физиологи-

ческого раствора на фосфатном буфере. Регистра-

цию флюоресценции проводили при длине волны

возбуждения 455–500 нм при помощи флюорес-

центного микроскопа “Olympus IX 71”.

Для определения общей сохранности клеток,

сохранности ГСД(+)-клеток и клеток, включающих

НК (НК(+)-клетки) во ФТ, их дополнительно обра-

батывали коллагеназой и разделяли полученную

суспензию клеток в градиенте плотности сахарозы

аналогично методу получения СКИ.

Сохранность клеток контролировали методом

суправитального окрашивания трипановым синим.

Общую сохранность клеток после замораживания

по различным программам, а также сохранность

ГСД(+)- и НК(+)-клеток выражали в процентах по

отношению к количеству этих клеток в образцах

до замораживания.

Базальную и стимулированную секрецию тесто-

стерона исследовали путем инкубации СКИ и ФТ

в среде 199 с 20 мМ HEPES в течение часа при

32–34°C. Как стимулятор стероидогенеза использо-

вали хорионический гонадотропин (ХГ) в концент-

рации 1 МЕ/мл. Содержание тестостерона измеря-

ли в инкубационной среде радиоиммунологическим

методом при помощи наборов “РИА СТ-тесто-

стерон” и рассчитывали на количество клеток в об-

разцах до замораживания.

Статистическую обработку результатов прово-

дили с использованием однофакторного диспер-

сионного анализа и t-критерия Стьюдента с по-

мощью пакета программ Excel.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

Фрагменты тестисов состоят из двух основных

компонентов: семенных канальцев и расположен-

ного между ними комплекса интерстициальных

клеток, включающих клетки Лейдига, ответствен-

ные за синтез мужских половых стероидных гормо-

нов.

3β-ГСД представляет собой один из ключевых

ферментов в реакциях превращения эфиров холес-

терина, находящихся в клетке в виде липидных ка-

пель, в тестостерон. Таким образом, 3β-ГСД и нали-

For determining the total integrity of cells, integrity

of HSD(+)-cells and those including NR (NR(+)-cells)

into TFs, they were additionally treated with colla-

genase and the resulted suspension of cells was centri-

fuged in sucrose density gradient similar to the method

of ICS obtaining.

Cell integrity was controlled with the method of

supravital staining with trypane blue. Total integrity of

cells after freezing on various programs in respect to

the number of these cells in the samples prior to freezing

was expressed in percentage.

Basal and stimulated secretions of testosterone

were studied by means of incubation of ICS and TFs

in the medium 199 with 20 mM HEPES for an hour at

32–34°C. Chorionic gonadotropin (CG) under 1 IU/ml

concentration was used as steroidogenesis stimulator.

Testosterone content was measured in incubation

medium with radio immunological method using the

kits “RIA ST-testosterone” (Russia) and counted per

the number of cells in samples prior to freezing.

Statistical processing of the results was performed

using single factor dispersion analysis and Student’s t-

criterion with Excel software.

Results and discussion

Testes fragments consist of two main components:

seminiferous tubules and located between them

complex of interstitial cells, including Leydig cells

responsible for the synthesis of male sexual steroid

hormones. 3β-HSD represents one of key enzymes in

the reactions of transformation of the cholesterol ethers,

being in a cell as lipid drops, into testosterone. Thus

3β-HSD and presence of significant amount of lipid

inclusions are the characteristics of steroid-production

of cells in testes. To reveal the activity of 3β-HSD the

histochemical reaction with nitroblue tetrasolium [6] is

used and for the visualization of lipid inclusions the

NR staining is used [10].

Fig. 1, a shows that total inetgrity of cells, the one

of HSD(+)- and NR(+)-cells sharply decreased after

cryopreservation of ICS and TFs using program 1. In

these samples the number of HSD(+)-cells reduced

almost down to 30% and the integrity of NR(+)-cells

did not exceed 10%.

The ability to basal and stimulated steroidogenesis

of ICS and TFs, cryopreserved with program 1, was

also reduced if compared with non-frozen samples

(Fig. 1, b). testosterone content in incubation medium

of TFs after CG secretion stimulation made about 23 ±

0.33 nmol/10

cells, that was more than twice lower

than prior to freezing (49 ± 1.0 nmol/10

cells) and

48 ± 5 nmol/10

cells in incubation medium of ICS,

that was also twice lower the level found prior to freezing

(976 nmol/10

cells). This testified to a significant cryo-

damage of steroidogenic cells, developing during

cryopreservation with program 1.

100

120

Рис. 1. Сохранность клеток ФТ и СКИ после криоконсервирования с использованием программы 1 (а): – общая

сохранность; – сохранность ГСД(+)-клеток; – сохранность НК(+)-клеток. Cпособность к базальному и

стимулированному стероидогенезу (б): – базальная секреция; – стимулированная секреция. 1 – нативных ФТ;

2 – нативной СКИ; 3 – криоконсервированных ФТ; 4 – криоконсервированной СКИ; * – различия достоверны

относительно нативных ФТ (р<0,05); # – различия достоверны относительно нативной СКИ (р < 0,05).

Fig. 1. Integrity of TFs and ICS cells after cryopreservation using program 1 (a): – total integrity; – integrity of

HSD(+)-cells; – integrity of NR(+)-cells. Ability to basal and stimulated steroidogenesis (b): – basal secretion; –

stimulated secretion. 1 – native TF; 2 – native ICS; 3 – cryopreserved TFs; 4 – cryopreserved ICS; * – differences are

statistically significant versus native TFs (p< 0.05); # – differences are statistically significant versus native ICS (p < 0.05).

Сохранность, %

Integrity, %

ФТ

TFs

СКИ

ICS

1 2 3 4

Тестостерон, нмоль/10

кл

Testosterone, nmol/10

cells

чие значительного количества липидных вклю-

чений являются характеристикой стероидпроду-

цирующих клеток в тестисах. Для выявления ак-

тивности 3β-ГСД используют гистохимическую

реакцию с нитросиним тетразолием [6], а для ви-

зуализации липидных включений – краситель НК

[10].

Как видно из рис. 1, общая сохранность клеток,

сохранность ГСД(+)- и НК(+)-клеток резко снижа-

лись после криоконсервирования СКИ и ФТ с ис-

пользованием программы 1. В этих образцах

уменьшалось количество ГСД(+)-клеток практи-

чески до 30%, а сохранность НК(+)-клеток не превы-

шала 10%.

Способность к базальному и стимулированному

стероидогенезу СКИ и ФТ, криоконсервированных

по программе 1, также снижалась по сравнению с

незамороженными образцами (рис. 1, б). Содер-

жание тестостерона в среде инкубации ФТ после

стимуляции секреции ХГ составляло около 23 ±

0,3 нмоль/10

клеток, что более чем в 2 раза ниже

до замораживания (49 ± 1,0 нмоль/10

клеток), а в

среде инкубации СКИ – 48 ± 5,0 нмоль/10

клеток,

что было также в 2 раза ниже уровня, установлен-

ного до замораживания (97 ± 6,0 нмоль/10

клеток).

Это свидетельствовало о значительном криопов-

реждении стероидогенных клеток, которые разви-

ваются при криоконсервировании по программе 1.

Использование относительно медленных режи-

мов охлаждения (1–2°С/мин) до –40°С для фраг-

ментов тестисов было отмечено в [2, 5]. Это оправ-

дано в связи с возможностью негативного влияния

температурных градиентов и напряжений, вызван-

Use of relatively slow cooling regimens (1–2°C/min)

down to –40°C for testes fragments was reported else-

where [2, 5]. This is feasible due to possible negative

effect of temperature gradients and tensions caused

with irregular ice propagation in a sample during

freezing that impairs the structure of fragment tissue

and reduces the cell integrity in them.

In [7, 9] there was shown the use of slow cooling

at cryopreservation of Leydig cells, herewith their

viability made 75%. The samples were cooled with

constant rate of 1°C/min down to –70°C, afterwards

they were plunged into liquid nitrogen. In our expe-

riments the application of program 2 for ICS did not

result in the increase of total cell integrity, the one of

HSD(+)- and NR(+)-cells if compared to the prog-

ram 1 (Fig. 2, a). Basal and stimulated steroidogenesis

as well statistically and significantly did not differ from

the indices of testosterone level, found at program 1

realization (Fig. 2, b).

Use of programs 1 and 2 during ICS cryopreser-

vation did not result in satisfactory integrity and func-

tional activity of steroidogenic Leydig cells in ICS.

When investigating the effect of overcooling and

cooling rate within different temperature intervals on

3β-HSD activity and integrity of cells having lipid

inclusions as well as their hormone production we have

proposed the cooling protocols on program 3[1], com-

prising programmable dismissal of overcooling, fore-

seen with the capacities of “Cryoson” freezer and

higher if compared with programs 1 and 2 cooling rates

down to –70°C.

The result of using program 3 (Fig. 3, a) was an

increased integrity of cells with 3β-HSD activity by

a a б b

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

100

120

Рис. 2. Сохранность клеток СКИ (а): – общая сохран-

ность; – сохранность ГСД (+)-клеток; – сохранность

НК (+)-клеток. Базальная и стимулированная секреция

тестостерона СКИ (б) после криоконсервирования с

использованием различных программ охлаждения: –

базальная секреция; – стимулированная секреция; * –

различия достоверны относительно данных для програм-

мы 1 (р<0,05).

Fig. 2. Integrity of ICS cells (a): – total integrity; –

integrity of HSD(+)-cells; – integrity of NR(+)-cells.

Ability to basal and stimulated secretion of testosterone

by ICS (b) after cryopreservation using different cooling

protocols. – basal secretion; – stimulated secretion;

* – differences are statistically significant comparing to the

data for progam 1 (p< 0.05).

1 2 3

Программы охлаждения

Cooling program

Программы охлаждения

Cooling program

Контроль 1 2 3

Control

Сохранность, %

Integrity, %

Тестостерон, нмоль/10

кл

Testosterone, nmol/10

cells

ных неравномерным расширением льда в образце

в процессе замораживания, что нарушает струк-

туру тканей фрагмента и снижает сохранность

клеток в них.

В [7, 9] было показано использование медлен-

ного охлаждения и при криоконсервировании клеток

Лейдига, при этом их жизнеспособность составля-

ла 75%. Образцы охлаждали с постоянной скорос-

тью 1°С/мин до температуры –70°С, затем погру-

жали в жидкий азот. В наших экспериментах

использование программы 2 для СКИ не приводило

к увеличению общей сохранности клеток, сохран-

ности ГСД(+)- и НК(+)-клеток по сравнению с

программой 1 (рис. 2, а). Базальный и стимулиро-

ванный стероидогенез также достоверно не отли-

чался от показателей уровня тестостерона, установ-

ленных при реализации программы 1 (рис. 2, б).

Использование при криоконсервировании СКИ

программ 1 и 2 не приводит к удовлетворительной

сохранности и функциональной активности сте-

роидогенных клеток Лейдига в СКИ.

При исследовании влияния переохлаждения и

скорости охлаждения в различных температурных

интервалах на 3β-ГСД активность и сохранность

клеток, имеющих липидные включения, а также

их гормонопродукцию нами был предложен режим

охлаждения по программе 3 [1], включающий

программное снятие переохлаждения, предусмот-

ренное возможностями замораживателя “Cryoson”,

и более высокие по сравнению с программами 1 и

2 скорости охлаждения до температуры –70°С.

Результатом использования программы 3

(рис. 2, а) было увеличение сохранности клеток,

обладающих 3β-ГСД активностью, на 50% (с 33

до 83%) и клеток, имеющих липидные включения

(до 32%), по сравнению с программами 1 и 2. Также

значительно была сохранена способность к базаль-

ному и стимулированному стероидогенезу (рис.

2, б). Содержание тестостерона в среде инкубации

СКИ, криоконсервированной по программе 3, при

стимуляции ХГ составляло 75 ± 6 нмоль/10

клеток

(77% от нативного контроля).

Таким образом, использование криоконсерви-

рованного клеточного материала тестисов в виде

СКИ, криоконсервированной по программе 3, как

источника стероидогенных гормонов более пред-

почтительно, чем фрагментов ткани.

Сравнивая стероидогенные свойства биоло-

гического материала тестисов в виде криоконсер-

вированной по программе 3 СКИ с результатами

использования аналогичных режимов охлаждения

[7, 9], нами была показана лучшая сохранность

клеток, ответственных за синтез тестостерона.

В результате снятия переохлаждения и повы-

шения скорости охлаждения удалось получить

50% (from 33 to 83%) and the cells having lipid inclu-

sions (up to 32%) if compared with programs 1 and 2.

As well there was significantly preserved the ability to

basal and stimulated steroidogenesis (Fig 2, b). Content

of testosterone in incubation medium of ICS cryopre-

served on program 3 with the CG stimulation made

75 ± 6 nmol/10

cells (77% versus native control).

Thus, use of cryopreserved cell material of testes

as ICS (program 3) as the source of steroidogenic hor-

a a

б b

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

криоконсервированный материал СКИ с 83% сох-

ранностью клеток, обладающих активностью

3β-ГСД, которая является одним из маркеров кле-

ток Лейдига. Этот показатель значительно превы-

шает результат, полученный при использовании

скорости охлаждения 1–2°С/мин (75%) [9].

Нами была получена 77%-я сохранность способ-

ности клеток к стимулированной секреции тесто-

стерона в ответ на тропную стимуляцию, что не

уступает аналогичным показателям, приведенным

в [7, 9].

Использование в программе 3 более низких

концентраций ДМСО (10%) по сравнению с 15%

ДМСО в [7, 9] является преимуществом, так как

ДМСО в более высоких концентрациях может

проявлять токсические эффекты [3, 4].

Âûâîäû

Использование скорости охлаждения 1–2°С/мин,

неконтролируемой скорости охлаждения в темпера-

турном диапазоне от –40 до –70°С при криоконсер-

вировании биологического материала тестисов в

виде СКИ и ФТ приводит к гибели значительного

количества стероидогенных клеток и снижению

способности материала к продукции тестостерона.

Программное снятие переохлаждения и увели-

чение скорости охлаждения до 15–20°С/мин при

охлаждении до –40°С, а в диапазоне температур

–40...–70°С до 20–25°С/мин (программа 3) при-

водит к увеличению сохранности криоконсервиро-

ванных стероидогенных клеток на 50% и их способ-

ности к базальному и стимулированному синтезу

и секреции тестостерона на 26%.

Биологический материал тестисов в виде СКИ,

криоконсервированный с использованием програм-

мы 3, обладает большей способностью к синтезу

и секреции половых стероидов по сравнению с

нативными и криоконсервированными ФТ (75 ± 6,0

против 49 ± 0,5 и 23 ± 0,3 нмоль/10

клеток

mones was more preferable if compared to the tissue

fragments.

When comparing the steroidogenic properties of

biological material of testes as the cryopreserved on

program 3 ICS with the results we have shown higher

cell integrity responsible for testosterone synthesis.

As a result of dismissal of overcooling and increase

of cooling rate it was managed to obtain cryopreserved

material of ICS with 83% integrity of cells having 3β-

HSD activity, which is one of the markers of Leydig

cells. This index significantly exceeds the result

reported [9] when using cooling rate of 1–2°C/min

(75%).

We have obtained 77% integrity of cell capability

to testosterone stimulated secretion in response to

tropic stimulation, and this fact is in coordination with

the same parameters reported [7, 9].

Use of lower DMSO concentrations (10%) if com-

pared with 15% DMSO in program 3 is the advantage,

since DMSO under higher concentrations may manifest

toxic effects [3, 4].

Conclusions

Use of cooling rate of 1–2°C/min, non-controlled

cooling rate within temperature range from –40 down

to –70°C during cryopreservation of biological material

of testes as ICS and TFs results in the death of

significant number of steroidogenic cells and reduced

ability of the material to produce testosterone.

Programmable removal of overcooling and rise in

cooling rate up to 15–20°C/min during cooking down

to –40°C and within the temperature range from –

40... –70°C up to 20–25°C/min (program 3) leads to

the increase of the survival of cryopreserved

steroidogenic cells by 50% and their ability to basal

and stimulated synthesis and secretion of testosterone

by 26%.

Biological materials of testes as ICS cryopreserved

using the program 3 possesses higher ability to syn-

thesize and secret sexual steroids if compared with

native and cryopreserved TFs (75.0 ± 5.0 vs. 49 ± 0.5

and 23 ± 0.33 nmol/10

cells).

Литература

Гурина Т.М., Пахомов А.В., Божок Г.А. Влияние скорости

охлаждения в различных температурных интервалах на

сохранность стероидогенного потенциала суспензии

интерстициальных клеток семенников взрослых крыс //

Пробл. криобиологии.– 2007.– Т. 17, №4.– С. 394–402.

Керос В.А. Кріоконсервування фетотестикулярної

тканини людини: Автореф. дис. ... канд. мед. наук.– Харків,

2001.– 19 с.

Пахомов А.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние

диметилсульфоксида на базальную и стимулированную

секрецию тестостерона клетками интерстиция семен-

ника новорожденных поросят: Матеріали ІХ з’їзду укр.

біохім. товариства // Укр. біохім. журнал.– 2006.– Т. 2.–

С. 18.

Пушкарь Н.С. Криопротекторы.– Киев: Наук. думка.–

1978.– 201 с.

References

Gurina T.M., Pakhomov A.V., Bozhok G.A. Effect of cooling

rate under various temperature intervals on survival of

steroidogenic potential of suspension of interstitial cells of

adult rat’s testes// Problems of Сryobiology.– 2007.– Vol.17,

N4.– P. 394–402.

Keros V.A. Cryopreservation of human fetotesticular tissue:

Author’s abstract of the thesis of Candidate of Medical

Sciences.– Kharkiv, 2001.– 19 p.

Pakhomov A.V., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Effect of

dimethyl sulfoxide on basal and stimulated secretion of

testosterone with interstitial cells of newborn piglets // Ukr.

Biokhem. Zhurn.– 2006.– Vol. 2.– P. 18.