Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук: 03.00.02 – биофизика, 03.00.23 – биотехнология.
— Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. —
Москва, 2009. — 53 с.
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Варфоломеев
С.Д.
Целью данной работы было решение комплекса
научно-практических задач, связанных с разработкой подходов к
получению высокоэффективных ГБК на основе ИмК микроорганизмов,
способных обеспечить реализацию различных биотехнологических
процессах, а также исследование их биохимических свойств и основных
кинетических закономерностей функционирования.
Научная новизна работы состоит в том, что:
широко апробирован биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ для осуществления направленного получения высокоактивных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, являющихся продуцентами различных целевых продуктов. Многочисленные экспериментальные данные в совокупности формируют научно-методологический подход к исследованию ГБК, базирующийся на выборе наиболее благоприятных условий подготовки клеток к иммобилизации и получения ГБК с использованием концентрации внутриклеточного АТФ в качестве критерия такого выбора. Данный биофизический подход позволяет выявить и обосновать основные закономерности изменения характеристик ИмК и может быть рекомендован для широкого применения в исследованиях ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов в качестве эффективного аналитического инструмента;
впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок (КОБ) в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности
ингибиторов коррозии по отношению к различным КОБ на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ; установлено, что эффективность применения биоцидов с целью подавления развития КОБ зависит от их стадии роста;
Практическая значимость результатов работы:
установлены удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для большого числа клеток микроорганизмов, а также пределы варьирования этого параметра среди различных культур. Разработан ряд методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу ИмК разных микроорганизмов, показана адекватность оценки каталитических характеристик ГБК на основе результатов, получаемых при использовании этого биофизического метода, представлена корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в ИмК с другими их биохимическими характеристиками. Разработан дифференцированный метод анализа концентрации ИмК в составе ГБК, полученных на основе смешанных культур;
разработан общий подход к получению ГБК на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта; показана возможность получения различных гидролитических ферментов с использованием разработанных ГБК в течение длительного времени, а также продемонстрирована эффективность применения таких ГБК для снижения уровня ХПК сточных вод предприятий пищевой промышленности при использовании их в качестве сред для культивирования ИмК;
показано, что разработанный ГБК на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces перспективен как объективная альтернатива свободным клеткам, традиционно используемым в промышленных условиях, и может служить основой для разработки новых биотехнологий, способных заменить существующие в области этанольного конверсии сахаров;
показана возможность получения иммобилизованных компетентных клеток с пролонгированным сроком хранения и создания на их основе ГБК с новыми свойствами, в частности, с ОРН-активностью. На основе полученных результатов обоснованы рекомендации о проведении процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов-продуцентов;
впервые определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для широкого ряда ингибиторов коррозии (ИК), обладающих биоцидным действием в отношении биопленок разного микробного состава. Полученные данные могут быть рекомендованы к использованию в антикоррозионных программах, составляющих основу мониторинга и применения ИК и биоцидов на практике;
созданы генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез ОРН и ее генетически модифицированных аналогов, оптимизированы условия их получения в растворимой и каталитически активной форме. Показана целесообразность их использования в иммобилизованном виде для биосенсорного определения фосфорорганических нейротоксинов или для разложения фосфорорганических пестицидов.
Научная новизна работы состоит в том, что:
широко апробирован биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ для осуществления направленного получения высокоактивных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, являющихся продуцентами различных целевых продуктов. Многочисленные экспериментальные данные в совокупности формируют научно-методологический подход к исследованию ГБК, базирующийся на выборе наиболее благоприятных условий подготовки клеток к иммобилизации и получения ГБК с использованием концентрации внутриклеточного АТФ в качестве критерия такого выбора. Данный биофизический подход позволяет выявить и обосновать основные закономерности изменения характеристик ИмК и может быть рекомендован для широкого применения в исследованиях ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов в качестве эффективного аналитического инструмента;
впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок (КОБ) в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности
ингибиторов коррозии по отношению к различным КОБ на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ; установлено, что эффективность применения биоцидов с целью подавления развития КОБ зависит от их стадии роста;
Практическая значимость результатов работы:
установлены удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для большого числа клеток микроорганизмов, а также пределы варьирования этого параметра среди различных культур. Разработан ряд методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу ИмК разных микроорганизмов, показана адекватность оценки каталитических характеристик ГБК на основе результатов, получаемых при использовании этого биофизического метода, представлена корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в ИмК с другими их биохимическими характеристиками. Разработан дифференцированный метод анализа концентрации ИмК в составе ГБК, полученных на основе смешанных культур;
разработан общий подход к получению ГБК на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта; показана возможность получения различных гидролитических ферментов с использованием разработанных ГБК в течение длительного времени, а также продемонстрирована эффективность применения таких ГБК для снижения уровня ХПК сточных вод предприятий пищевой промышленности при использовании их в качестве сред для культивирования ИмК;
показано, что разработанный ГБК на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces перспективен как объективная альтернатива свободным клеткам, традиционно используемым в промышленных условиях, и может служить основой для разработки новых биотехнологий, способных заменить существующие в области этанольного конверсии сахаров;
показана возможность получения иммобилизованных компетентных клеток с пролонгированным сроком хранения и создания на их основе ГБК с новыми свойствами, в частности, с ОРН-активностью. На основе полученных результатов обоснованы рекомендации о проведении процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов-продуцентов;
впервые определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для широкого ряда ингибиторов коррозии (ИК), обладающих биоцидным действием в отношении биопленок разного микробного состава. Полученные данные могут быть рекомендованы к использованию в антикоррозионных программах, составляющих основу мониторинга и применения ИК и биоцидов на практике;
созданы генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез ОРН и ее генетически модифицированных аналогов, оптимизированы условия их получения в растворимой и каталитически активной форме. Показана целесообразность их использования в иммобилизованном виде для биосенсорного определения фосфорорганических нейротоксинов или для разложения фосфорорганических пестицидов.