Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

1 аолица w.i

Предварительная схема последовательности аминокислот карбоангидразы В и С

человека [58, 59, 63, 154] (подчеркнуты участки наибольшей гемологичности)

Фрагмент В IV

Фермент

В•

Дцещил-Ala-Ser-Pro-Asp-Trp-Cly-Tyr-Asp-Asp-Iys-Asn Gly-CUi-Pro-Clu-Trp-Ser-Lys-

Фермент С: Acetyl-Ser-His-His (Gly ,Trp ,Tyr)Cly-I.ys (Rly ,Pro

Glx ,Asx ,Trp ,His ,His ,Lys )Asp-Phe-Pro-1 le-Ala-l.ys (Gln-Cly-Arg)

I Фрагмент C 1 |

Uu-T>T--Pro- Ue-Ala-Asp-Gly-Asn-Asn-Gln-Ser-Pro-Val-Asp- Ile-Lys-Thr-Ser-Glu-Thr-Lys-Ilis-Asp-Thr-Ser-Leu-Lys-Pro- Ile-Ser-Val-Ser-

(Leu,Tyr,Pro.IIe,Ala,Asx,Gly,Asx,Asx,Glx,Ser,Pro

Val,Asx lie,Lys)Thr-Ser-Glu-Thr-LysQlis-Asp-Thr-Ser-Leu) (Lys

Pro,IIe.Ser,Val ,Ser,

I Фрагмент

Фрагмент BIII

- Tyr-Asn-Pro-Ala-Thr-Ala-Lys-Glu-Ile-Ile-Asn-Val -GIy-His -Ser-PhejlUs}- Val -Asn-Phe-Glu-Asp-Asn-Asn-Asp-Arg--Ser-Val-Leu-Lys-Gly-Gly-

Tyr|Asx,Pro,Ala,Thr)Ala-l.ys( неизолированные пептиды ) (Ser

Val ,Glx.Phe,Glx

Asx,Asx,Asx,Asx,Lys) (Ala,Val ,Leu,Lys) ( неизо-

I Фрагмент B I

-Pro-Phe-Ser-Asp-Ser-Tyr-Arg-Leu-Phe ( 79 остатков

) I

Ie-Lys-Thr-Lys-Gly-Lys-Arg-Ala-Pro-Phe-Thr-Asn-Phc-Asp-Pro-Ser-Thr-Leu-Leu-

лированные пептиды )Arg( 87 остатков )( неизолированные пептиды )(Glx,Ser,Phe-GlyJIle-Val-Leu-Lys-

Фрагмент С 3 | Фрагменте 4

•Pro- Ser-Ser- Leu-Asp-Phe-Trp-Thr-TyT

Pro--Gly

Ser-

Leu- Thr

v^iy

Pro -

Pro-Leu-TyT-Glu-Ser-Val -Thr-Trp-

-1 Ie -1

Ie-Cys-Lys

(Pro,GLx

Ser, Leu, Asx

Leu,

Tyr, Tip) (Gly

Thr ,Leu.Thr

,Гёи, Pro

,Pro, Leu,Tyr, Glx ,Ser ,Val ,Thr ,Trp) (lie ,Ile ,Cys ,l.ys)

• Фрагмент В V

-Glu-Ser-Ile-Ser-Val-Ser-Gln-Ser-Glu-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg Ser-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Clu-Asp-Asn-Gly--Ala-Val-Pro-Mct-Clx--

(Glx-Pro- Ile-Ile (Val,Ser,GLx,Ser,Glx)Leu-Val -LysjPhe-Arg(l.ys

,Leu,Asn

Phe

,Glx

Gly) (GIx,Glx,Glx

Gly,Pro

Glx) (Asp,Leu,Trp)Met_^/a_b

Ф/загмент C 5

-His-Asn-Asn-Arg-Pro-Thr-Gln-Pro-Leu-Lys-Gly-Arg-Thr-Val-Arg-Ala-Ser-Pheai

'Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gln-Ile-Lvs-Ala-Ser-Phe -LysOH

(^) модифицируемый бром-или иойацетатом

остаток фермента

В.

J модифицируемый

Ч-хпорацетилхлортиазидом остаток фермента

В.

574

Г лава

фермента [37]. Интересно, что при подкислении растворов белкг

до рН 1,67 эта гипохромия возрастает. Независимыми измерениям!:

дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма

(КД) при низких значениях рН выявлены резкие изменения кон-

формации глобулы, сопровождаемые потерей цинка [72—74]. Как

следует из результатов определения ДОВ и КД, при рН 1,5—1,6

белок содержит довольно много а-спиральных участков, отсутству-

ющих в нативной структуре при нейтральных рН [72—74]. Однакс

спектры ДОВ и КД нативного фермента сложны для интерпрета-

ции (см. ниже).

2.6.1. Оптическое вращение

Рис. 16.2 иллюстрирует необычные особенности оптического

вращения карбоангидразы [30]. Хорошо заметны сложные эффек-

ты Коттона, связанные с полосами поглощения в ближней ультра-

фиолетовой области. В расчете на 1 моль эти эффекты по меньшей

мере на порядок превосходят величины эффектов Коттона, наблю-

давшиеся для большинства модельных соединений ароматических

хромофоров в асимметричном окружении. Большая эллиптичность

этих хромофоров при их введении в структуру белка должна инду-

цироваться окружающими группами.

Ароматические эффекты Коттона исчезают при кислотной дена-

турации и в растворах гидрохлорида гуанидина [72, 76, 77]. По

данным работы [73], после удаления денатурированного агента

(или после возвращения к нейтральному рН) наблюдавшиеся ра-

нее хорошо выраженные полосы эллиптичности в ближней ультра-

фиолетовой области полностью уже не восстанавливаются. Однако

в одном из последующих сообщений говорится о возможности вос-

становления исходной конформации при правильном выборе усло-

вий и при использовании гидрохлорида гуанидина [77]. Причины

возникновения этих полос эллиптичности подробно обсуждаются в

работах [72—76].

Анализ данных ДОВ для определения конформации полипеп-

тидной цепи карбоангидразы обычно проводится по классическому

методу (построение графиков Янга—Доти, определение Ь

) [37].

Карбоангидраза В человека имеет значение Ь

~0, что говорит о

низком содержании или отсутствии а-спиралей в нативном белке

[37]. При кислотной денатурации Ь

становится более отрицатель-

ным (—97°). Следовательно, в денатурированном белке увеличи-

вается количество спиральных участков [37] (см. выше обсужде-

ние спектров поглощения). Однако слишком большие эффекты

Коттона в ближней ультрафиолетовой области и необычное поло-

жение эффектов Коттона в дальней ультрафиолетовой области вы-

зывают сомнение в применимости классических методов обработки

данных ДОВ.

Карбоангидраза

575

Спектры КД и ДОВ в дальней ультрафиолетовой области так-

же имеют характер, необычный для белков. Значительную полосу

эллиптичности, наблюдаемую для обоих рассмотренных изофер-

ментов при 222 нм (рис. 16.2), можно с некоторой вероятностью

200 220 2U0 250 300

Я, нм

Рис. 16.2. Спектры КД («верху) и ДОВ (внизу) карбоангидразы В человека

( ) и карбоангидразы С обезьяны ( ) (0,025 M трис, рН 7,5,

25 °С) [30].

соотнести с а-спиралью. Большие отрицательные полосы находят-

ся около 211 нм (форма В человека) и 217 нм (форма С обезь-

яны). В спектре ДОВ это проявляется в необычном положении

первой отрицательной впадины — при 222 и 225 нм соответственно.

Поскольку для карбоангидразы характерны оптически активные

ароматические полосы поглощения в ближней ультрафиолетовой

области, необходимо учитывать возможность того, что некоторые

ароматические полосы поглощения тирозина или триптофана в

дальней ультрафиолетовой области также могут проявлять опти-

ческую активность и вносить свой вклад в спектры КД и ДОВ в

коротковолновой области. Этот вклад существенно осложняет ана-

лиз конформации по спектральным данным. Неблагоприятным об-

стоятельством является также необычно высокая оптическая плот-

ность карбоангидразы млекопитающих (около 200 нм), затрудняю-

щая определение спектров КД в этой области.

576

Г лава

Исключительную сложность интерпретации спектров КД и

ДОВ в ультрафиолетовой области можно проиллюстрировать сле-

дующим примером. При рентгеноструктурном анализе с разреше-

нием 2 А оказалось, что молекула карбоангидразы С человека со-

держит только несколько спиральных витков, причем лишь неболь-

шая часть этих витков соответствует параметрам истинной

Л., нм

д.,

Рис. 16.3. Спектры КД карбоангидразы тигровой акулы в ближней (а) и дальней

(б) ультрафиолетовой области (0,025 M трис, рН 7,5, 25°С) [42J.

а-спирали [23]. Преобладающую роль в структуре молекулы иг-

рает p-конфигурация, которая образует центральную часть глобу-

лы (разд. 6). Похоже, что большая отрицательная полоса эллип-

тичности в спектрах КД (около 211—217 нм) определяется именно

Р-структурой. Последнее согласуется и с исследованиями модель-

ных систем, демонстрирующих аналогичные полосы при 215—-

218 нм [79]. Сильное отрицательное вращение при А,<200 нм, на-

блюдаемое для спектров ДОВ, пока не нашло объяснения.

На рис. 16.3 показаны спектры КД в дальней ультрафиолето-

вой области, полученные для образцов чистой карбоангидразы из

эритроцитов тигровой акулы [42]. Они интересны в двух отноше-

Карбоангидраза 577

ниях. Во-первых, большая эллиптичность в ближней ультрафиоле-

товой области фермента эритроцитов является структурной особен-

ностью, характерной на ранней стадии эволюции. Во-вторых,

спектры КД в дальней ультрафиолетовой области имеют вид, бо-

лее типичный для белка. Малая оптическая плотность около

200 нм позволяет работать с ферментом вплоть до 190 нм. Значи-

тельная полоса при 222 нм свидетельствует о наличии в нативном

белке а-спиральных участков. Однако наблюдается сдвиг другой

а-спиральной полосы (обычно расположенной около 190 нм) к

196 нм, а глубина впадины при 222 нм почти равна высоте пика

при 195 нм. Обе последние особенности, по-видимому, объясняются

наличием больших областей с ^-конфигурацией [79, 80].

3. МЕТАЛЛОКАРБОАНГИДРАЗЫ: АПОФЕРМЕНТЫ,

СВЯЗЫВАНИЕ МЕТАЛЛА, СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ

И СВЯЗЫВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ

При нейтральных значениях рН не наблюдается обмена иона-

ми цинка между металлокарбоангидразой и окружающим раство-

ром [73, 81, 82]. Однако при подкислении до рН<5 этот обмен

происходит, хотя и в небольшой степени [82]. По-видимому, он со-

провождается изменениями геометрии координационного центра,

как следует из спектра поглощения в видимой области Со(II)-кар-

боангидразы (см. ниже).

3.1. Апофермент

Обработка фермента 1,10-фенантролином или 8-оксихинолин-

сульфонатом [20, 83, 84] в течение 15 дней при рН 5,5 привела к

удалению цинка(II). Полученный апофермент совершенно неакти-

вен, хотя и довольно стабилен, так как после прибавления цинка

он полностью восстанавливает свою активность [20, 73, 83]. Уда-

ление металла приводит к небольшому изменению спектров ДОВ,

но основные физико-химические свойства апо- и металлофермента

одинаковы. Существенны в этом отношении данные о том, что

единственной особенностью разностных карт электронной плотно-

сти между кристаллами апо- и Zn-карбоангидразы является мак-

симум плотности, отвечающий ионам цинка (рис. 16.4) [85]. Кри-

сталлы металло- и апофермента изоморфны. Последние могут быть

получены при длительной (16 суток) обработке кристаллов натив-

ной карбоангидразы 0,01 M раствором 2,3-димеркаптопропанола-1,

содержащим 2,45 M (NH

)

, в атмосфере водорода [85].

Кроме Zn(II)-карбоангидразы, приготовлены металлоферменты,

содержащие Mn(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Cd(II) и Hg(II).

39—2451

578

Г лава

Имеется много данных о том, что все эти ионы занимают в фер-

менте одно и то же место [20, 23, 84, 86]. Ниже излагаются ре-

зультаты исследований этих препаратов.

Рис. 16.4. Разностная карта электронной плотности. Карбоангидраза С—апокар-

боангидраза С человека [45].

3.2. Ферментативная активность и устойчивость

комплексов металл — белок

Несмотря на то что все указанные выше ионы входят в актив-

ный центр фермента, только Zn(II)- и Со(Il)-карбоангидразы об-

ладают свойствами, необходимыми как для катализа гидратации

, так и для проявления эстеразной активности (табл. 16.8)

[20, 21]. Отсутствие каталитических свойств у остальных металло-

ферментов может объясняться небольшими изменениями геомет-

рии координационной сферы или неспособностью к присоединению

или быстрому замещению лигандов [21]. Связывание сульфамидов

также зависит от природы металла [20, 21], и неактивные метал-

локарбоангидразы не взаимодействуют с этими ингибиторами

(табл. 16.8; подробнее см. разд. 4 и 7).

Линдског и Наймен [84] определили константы устойчивости

(К) различных комплексов фермента с металлами, используя ме-

тод конкурентного комплексообразования с ЭДТА, 1,10-фенантро-

лином и 8-оксихинолин-5-сульфонатом. В табл. 16.9 приведены

значения К, измеренные при рН 5,5, где ионы металлов удаляются

Карбоангидраза

579

Таблица 16Л

Ферментативная активность и связывание ацетазоламида

металлокарбоангидразами человека [21]

Металл

Гидратация CO® , ед.

Гидролиз

п -нитрофен ил ацетата®

Число молей

ацетазоламида,

связанного с 1 молем

фермента

Апофермент

400 0,09 0,04

Mn(II) В

400 0,38

0,40

Co(II) В

5 700

8,70 1,00

Ni(II) В

500

0,32

0,02

Cu(II) В

127

0,50

0,14

Zn(II) В

10 200

2,70

1,00

Zn(II) С

30 000 7,30

1,00

Cd(II) В

430 0,20 0,06

Hg(II) В

0,09

0,05

В и С обозначают соответствующие изоферменты карбоангидразы эритроцитов чело-

века.

Определено по методу Уилбура и Андерсона.

Условия: 0,025 M трис, 5%-ный ацетонитрил, рН 7,5, 23 "С.

Определено в присутствии Ы0-

M свободного ацетазоламида.

легче всего. Для цинка получена зависимость этой константы от

рН. Величина IgК линейно возрастает с увеличением рН от 5 до

10 и в более щелочной области выходит на плато, которому соот-

ветствует /C=IO

. Это означает, что ионы водорода взаимодейст-

вуют с активным центром при рН<10. Не исключена также воз-

можность небольших изменений структуры белка, обусловленных

изменением рН и влияющих на стабильность комплекса.

Хенкенс и Стюртевант [87] детально изучили кинетику взаимо-

действия цинка с апоферментом. Реактивация белка цинком сопро-

вождается небольшими изменениями ультрафиолетовых спектров

[87]. Измерения скорости комплексообразования проводились ме-

тодом остановленной струи. Степень взаимодействия определялась

по изменению оптической плотности и по увеличению ферментатив-

ной активности. Реакция имеет первый порядок как по апофермен-

ту, так и по цинку. Значение константы скорости — около IO

л-

•моль

-1

-с

-1

. Эта величина примерно на два порядка меньше, чем

при взаимодействии цинка с небольшими хелатирующими агента-

ми, для которых получены значения IO

—IO

л-моль

-1

-с

-1

[87—

89]. В последнем случае считают, что скорость процесса лимитиру-

ется вытеснением воды из координационной сферы [87]. Скорость

37*

580

Г лава

Таблица 16.9

Устойчивость металлокарбоангидраз [84]

Металл

IgA: (рН 5,5)

Независящая от

рН величина IgK

Mn(II)

3,8

—

Co(II) 7,2

—

Cu(II) 11,6

—

Ni(II)

9,5 —

Zn(II)

10,5

15,0

Cd(II)

9,2

—

Hg(II)

21,5

—

взаимодействия цинка с апокарбоангидразой возрастает при изме-

нении рН от 5,5 до 7,5 (табл. 16.10), но все же не достигает того

же уровня, как для модельных систем. Температурная зависимость

этого процесса удовлетворительно выражается кривой Аррениуса.

Рассчитанные значения энергии и энтропии активации приведены

в табл. 16.10. Наблюдаемые величины энергии активации выше

энергий активации модельных систем, но частично компенсируют-

ся большим выигрышем в энтропии активации. Значение послед-

ней при взаимодействии цинка с малыми комплексонами состав-

ляет 7—8 кал-моль

-1

-град

-1

[88, 89].

Константа скорости второго порядка, полученная для модель-

ных систем, представляет собой произведение константы присоеди-

нения к внешней сфере (Ко) и константы скорости первого поряд-

ка (k\) для замещения воды. Возможны различные предположе-

ния о причинах низкой скорости взаимодействия цинка с

апоферментом. По-видимому, взаимодействие с металлом не сопро-

вождается значительной перестройкой конформации белка. Необ-

ходимо учитывать, что в металлоферменте ион цинка находится на

дне глубокой полости с несколько необычной геометрией (рис.

16.19). Вероятно, свой вклад вносят и процессы вытеснения воды

из координационной сферы.

Используя определенное ранее значение константы равновесия,

Хенкенс и Стюртевант [87] рассчитали константу скорости диссо-

циации комплекса Zn(II) с апоферментом (1,5-10

-9

-1

). Интерес-

ные результаты получены при сравнении с аналогичными данными

для карбоксипептидазы А, которая легче обменивает свой ион цин-

ка на ионы из раствора [90]. Время, необходимое для замещения

половины цинка на кадмий для этого фермента при рН 8,0 и 4 °С,

составляет около 20 ч [90]. Отсюда следует, что константа скоро-

сти диссоциации равна Ю

-6

-1

[87]. При обмене с изотопом

Карбоангидраза 581

Таблица 16.10

Скорость рекомбинации Zn(II) с апокарбоангидразой при 25

C. Теплота и

энтропия активации [87]

Ионы H

Эффективная константа скорости

второго порядка, 10-4 л-моль—1-е—1

AS.

кал-моль—1-

•град—1

Ионная

сила. M

выделяю-

щиеся

при

реакции

по диффе-

ренциаль-

ным

УФ-спект-

рам

восстано-

вление

активности

в реакции

гидратации

восста-

новление

эстеразной

активности

Е.

ккал/моль

AS.

кал-моль—1-

•град—1

5,5

5,90

0,051

0,001

0,18

0,27

—

21,2

27,2

5,90

0,021

0,42 0,54 —

6,27

0,056

0,85

—

0.81

7,0

0,056

1,5

—

,36

—

7,40 0,020

1,6

1,33

— —

7,56 0,056

2,2

— — 2,0

7,5

0,051

— — —

20,8

30,0

эта величина имеет значение около 2,5-10

-5

-1

Г91], т. е. на 4—

5 порядков больше, чем для карбоангидразы. По-видимому, раз-

личие в скоростях ассоциации для обоих ферментов не превышает

одного порядка. Поэтому неудачи при попытках обнаружить обмен

ионами цинка между металлокарбоангидразой и раствором при

рН 8,0 можно объяснить исключительно медленной диссоциацией

металлофермента. Расчеты показывают, что период полураспада

этого комплекса при рН 8,0, ионной силе 0,1 M и 25

C составляет

5—6 лет [87].

3.3. Спектры поглощения и оптическая активность

Наиболее существенным изменением физико-химических

свойств карбоангидразы при замене цинка ионами переходных ме-

таллов З^-ряда является возникновение полос поглощения в види-

мой области спектра. Незаполненные Зй-орбитали этих ионов де-

лают возможным d—d-переходы, которые и проявляются в спект-

рах поглощения. Как и следует из теоретических соображений, эти

полосы лучше всего выражены у комплексов фермента с Co(II) и

Cu(II) [92] (рис. 16.5). Co(II)-Карбоангидраза отличается наи-

большим поглощением, е~300. По интенсивности эта полоса ско-

рее соответствует тетраэдрическим, чем октаэдрическим, комплек-

сам Co(II), так как последним отвечает е~10 [92]. Но по струк-

туре (расщепление на четыре побочных максимума при 520, 555.

582

Г лава

615 и 645 нм) она не похожа ни на один из известных тетра- или

октаэдрических кобальтовых комплексов, для которых наблюда-

ются простые полосы без расщепления. Это указывает на своеб-

разную геометрию координационной сферы металла в активном

центре.

600

300

0) 6

100

* 50

500 600 700 800 900 1000

А. им

Наиболее близким к Со(П)-карбоангидразе по спектральным

свойствам оказался недавно полученный комплекс Co(II) с коор-

динационным числом 5 [93—96]. В результате этого появились

мнения о том, что и в белке для кобальта характерно координа-

ционное число пять. Однако по данным рентгеноструктурного ана-

лиза с разрешением 2 А координационная сфера Co(II) напоми-

нает сильно искаженную тетраэдрическую конфигурацию

(рис. 16.20, Б) [98]. Подобная структура наблюдалась и у недав-

но исследованных методом дифракции рентгеновских лучей кри-

сталлов бмс-ацето-бас-(этилентиокарбамид)кобальта(П) [97]. При

комнатной температуре спектр этого соединения очень похож на

спектры Со(II)-карбоангидразы.

Координационная сфера этого комплекса имеет псевдотетра-

эдрическое строение. Ближайшими соседями атома Со являются

два атома кислорода и два атома серы, удаленные от него на 1,957

и 2,328 А соответственно. Наибольшее искажение в тетраэдриче-

- (г

•

I I I I I I I

\ Со(П) _

+ацетаяоламид

|\ +CN"

- //

МКП)

—/

- .

, LУ

Cu(H)

CN'

\ч

Рис. 16.5. Спектры поглоще-

ния в видимой области

Co(II)-, Ni(II)- и Cu(LI)-

карбоангидраз В человека

и их комплексов с ингиби-

торами [73, 102, 1561.