Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоангидраза

583

скую конфигурацию вносят два других атома кислорода, распо-

ложенные от центра на расстоянии 2,928 А. Имеются данные о том,

что их влияние и является причиной изменения спектров [97].

Спектр поглощения в видимой области Cu (II)-карбоангидра-

зы, на котором можно различить три полосы поглощения, также

\, нм рН

Рис. 16.6. Спектры поглощения в видимой области Со(II)-карбоангидразы В че-

ловека при разных рН (а) и зависимость коэффициента молярного поглощения

при 640 нм от рН (б) [84].

свидетельствует о нарушенной геометрии. Спектр Ni (II)-карбо-

ангидразы имеет вид, более типичный для октаэдрических комп-

лексов Ni(II). По-видимому, различные металлоферменты имеют

неодинаковую геометрию координационных сфер. Результат

этого — отсутствие активности у большинства комплексов карбо-

ангидразы с металлами.

Кроме сведений о геометрии координации с помощью спект-

ров поглощения в видимой области было получено много других

полезных данных об активном центре. Это особенно относится к

Со(II)-карбоангидразе, поскольку она обладает ферментативной

активностью. Добавление сульфамидов или анионов, подобных

цианиду, приводит к резкому увеличению интенсивности и умень-

шению ширины полосы поглощения [20, 39, 73, 84] (рис. 16.5).

Эти результаты были первым серьезным доказательством внед-

рения ингибиторов обоих типов в первую координационную сферу

иона металла.

На рис. 16.6 показано изменение спектра Со(II)-карбоангид-

разы, впервые обнаруженное Линдскогом [20, 84] при изменении

рН. Интенсивность полосы уменьшается, а два длинноволновых

584

Г лава

пика при рН<6 Еообще ие наблюдаются. Величина рK

, отве-

чающая этому сдвигу, в зависимости от условий лежит в интер-

вале рН 7—8 [20, 73, 84, 86] и, по-видимому, идентична той кон-

станте, которая определяет рН-зависимость активности фермен-

та [26, 27, 29, 86, 99—101]. По всей вероятности, геометрия коор-

X, им

Рис. 16.7. Спектры КД в видимой области для трех изоферментов и видовых

вариантов Co(II)-карбоангидразы [102, 119].

1 — карбоангидраза С человека; 2 — карбоангидраза В быка; 3 — карбоангидраза В человека;

4 — карбоангидраза В человека ± 0,2 = Ле.

динационной сферы металла и каталитические свойства фермента

зависят от одного и того же процесса ионизации. Возможно, эти

эффекты связаны с диссоциацией координированной молекулы

воды (разд. 5 и 7).

Еще более чувствительными к изменениям в активном центре

оказались спектры КД [102] (рис. 16.7). Полосы поглощения у

всех трех представленных на этом рисунке разновидностей

Со(П)^карбоангидразы почти одинаковы — как по поглощению,

так и по интенсивности. На основании этого можно было бысчи-

Карбоангидраза

585

тать одинаковой и структуру координационной сферы. Но вели-

чины эллиптичности указывают на существенные различия. Изо-

ферменты С человека и В быка весьма оптически активны

(Ae«3—5), а у формы В человека во всей области Ае<0,2.

При 10-кратном увеличении чувствительности и у этого фер-

мента можно обнаружить небольшие положительные полосы эл-

липтичности, соответствующие всем полосам поглощения

)

X, нм

Рис. 16.8. Спектры КД Co(II)-карбоангидразы В человека в D

O при pD 6,81

( ) и 9,21 ( ).

(рис. 16.8). С понижением рН они одновременно возрастают и су-

жаются, следуя за изменением спектров поглощения (ем. выше).

Результаты измерений КД у различных видовых форм Co(II)-

карбоангидразы говорят о том, что оптическая активность ко-

бальтового хромофора более чувствительна к локальным особен-

ностям структуры изофермента, чем к симметрии самого коорди-

национного комплекса. Решающим фактором здесь может быть

асимметричность потенциального поля, создаваемая окружающи-

ми заряженными и полярными остатками аминокислот. Поэтому

становятся понятными трудности использования данных КД для

получения структурной информации. Очень низкая оптическая

активность Co(II)-карбоангидразы В человека, по-видимому, сви-

детельствует о наличии в строении комплекса металла элементов

симметрии, маскирующих большую оптическую активность, при-

сущую самому кобальтовому хромофору. Такими структурными

факторами могут быть плоские тетраэдрические или пятикоорди-

национные комплексы.

При добавлении комплексообразующих анионов наблюдается

увеличение значения р/(

, определяемого по изменению спектра

586

Г лава 10

при изменении рН. Увеличение этого параметра тем больше, чем

значительнее у добавляемых ионов сродство к металлу [101].

Такой же сдвиг р/С

в присутствии тех же анионов заметен и на

кривых зависимости скорости реакции от рН [101]. Одно из воз-

можных объяснений этого — конкуренция между гидроксилом и

анионами за свободное место в координационной сфере иона ме-

талла. Такое объяснение согласуется с многочисленными данны-

ми о наличии в активном центре связей фермент — Zn—ОН

(см. ниже).

3.4. Связывание ингибиторов

Исследование функциональных и физико-химических аспектов

взаимодействия ингибиторов с активным центром карбоангидразы

способствовало разработке новых методов изучения фермента.

Кинетические, спектральные и рентгеноструктурные данные о

взаимодействии карбоангидразы с ингибиторами двух главных

типов (сульфамидами и небольшими анионами) свидетельствуют

о том, что их ферментативное связывание осуществляется одним

и тем же центром белка [21, 101, 103]. Имеется достаточно осно-

ваний считать, что главную роль в этом взаимодействии играет

обычная координация ионами металлов, хотя реальная картина

явлений ингибирования может включать и другие типы взаимо-

действий [231

•

Изменение спектральных свойств под воздействием сульфами-

дов будет обсуждено в разд. 4. С помощью

Н-ацетазоламида

можно непосредственно показать, что для связывания этого суль-

фамида необходим ион металла (рис. 16.9, а) [21]. При концент-

рациях, меньших Ю

-4

М, ацетазоламид не связывается апофер-

ментом, тогда как Zn (II)-карбоангидраза присоединяет 1 моль

ингибитора уже при концентрации последнего 5-10~

(рис. 16.9, а). Характерно, что подобный тип взаимодействия об-

наружен только с цинковыми и кобальтовыми комплексами кар-

боангидразы — единственными активными разновидностями ме-

таллофермента (табл. 16.8). По-видимому, только реакционноспо-

собная конфигурация активного центра допускает возможность

связывания сульфамидов [21].

Азид-, цианат-, сульфид- и цианид-анионы способны вытеснять

сульфамид из активного центра (рис. 16.9, б). Концентрация

Н-ацетазоламида, необходимая для связывания с ферментом в

присутствии равных и постоянных концентраций этих анионов,

оказывается прямо пропорциональной величинам их сродства к

активному центру, рассчитанным из кинетики ингибирования

(CN-5sSH~>OCN->Ni) [21].

При исследовании инфракрасных спектров поглощения Рипе и

Уонг [105] также смогли показать непосредственное взаимодейст-

Карбоангидраза

587

вие одного из этих анионов (N3) с ионом металла в активном

центре. Азид-анион имеет полосу поглощения при 2049 см^,

обусловленную асимметричными валентными колебаниями этой

линейной молекулы. Эта полоса обычно смещается в сторону

Рис. 16.9. Связывание

Н-ацета-

золамида в зависимости от его

концентрации (а) с металлокар-

боангидразой и (б) с Zn(II)-Kap-

боангидразой В в присутствии

0,2 мМ металлсвязывающих ани-

онов и в их отсутствие (кривая

слева) [21]. Условия: 0,025 M

трис, рН 8,0, 4 °С.

Концентрация ацетазоламида, M

больших частот при связывании азида с металлами [102]. В при-

сутствии фермента максимум поглощения N з находится при

2081 см-

[Co(II)-карбоангидраза] и 2094 см-

[Zn(II)-карбоан-

гидраза] (рис. 16.10). Хотя такое смещение и меньше, чем в мо-

дельных смесях азида с Со

+ и Zn

+, оно свидетельствует о при-

соединении аниона к координационной сфере металла в активном

центре. Один из сульфамидов, этоксзоламид (6-этоксибензотиа-

зол-2-сульфамид), устраняет этот сдвиг полосы в ИК-спектре.

Взаимодействие с субстратом (CO

) происходит иначе. В при-

сутствии металлофермента полоса поглощения свободного раство-

ренного CO

(2343 см

-1

) смещается лишь очень мало (до

2341 см

-1

). Это означает, что в ферменте молекула CO

почти

не деформируется._ Связанная двуокись углерода легко вытесня-

ется анионами N3, NO

и HCO

Поэтому считают, что CO

не входит в координационную сферу металла, а каким-то обра-

588

Г лава 10

зом (возможно, гидрофобно) связывается неподалеку от него

[105]. Это согласуется с современными представлениями о меха-

низме действия карбоангидразы (разд. 7).

Вообще этот фермент ингибируется, хотя бы и в малой степе-

ни, многими анионами. Такое действие оказывает даже ацетат,

продукт эстеразной реакции [86]. Более интересный тип ингиби-

рования был открыт при исследовании влияния иодацетата на

карбоангидразу В человека [65, 66, 68]. Ингибирование этим

Рис. 16.10. Дифференциальные ИК-спектры карбоангидразы быка в присутствии

азида [1051.

1 — фермент (0,01 M) с избытком азида (0.05 M) при рН 5,56; пик при 2094 см-

типичен для

азидного комплекса Zn(II); 2 — фермент (0,01 M) с азидом (0,05 М) и с избытком этоксзол-

амида (0,01 M) [105].

соединением необратимо, но при этом наблюдаются некоторые

особенности. Фермент никогда не теряет свою активность пол-

ностью. Даже при эквимолярном присоединении ингибитора со-

храняется 5—10% активности. Эта остаточная активность харак-

теризуется сигмоидальной рН-зависимостью с точкой перегиба

при рН 8,5 [68]. Следовательно, и после модифицирования в

ферменте присутствует та же ионогенная группа, которая опре-

деляет рН-профиль нативной карбоангидразы [68].

Иодацетат реагирует с гистидином, входящим в пептидный

фрагмент, упоминавшийся в разд. 2. Имеется ряд доказательств

[65, 66] того, что эта реакция происходит в активном центре:

а) параллельно с образованием 3-карбоксиметилгистидина теря-

ется эстеразная активность; б) иодацетат инактивирует карбоан-

гидразу необратимо только тогда, когда присоединяется к ней

как обратимый ингибитор; в) сульфиды предотвращают необра-

тимое ингибирование; г) для быстрой дегидратации необходима

нативная конформация фермента; в присутствии 8 M мочевины

быстрая реакция с гистидином уже не наблюдается.

Карбоангидраза

589

Спектры поглощения и КД Со(II)-карбоангидразы в присут-

ствии ацетата и иодацетата указывают на одинаковый характер

их присоединения к ферменту— координации к иону Co(II) [107]

(рис. 16.11). Затем иодацетат с относительной малой скоростью

необратимо реагирует с ферментом [65, 66, 107]. Для завершения

Рис. 16.11. Влияние иодацетата на спектр Co(II)-карбоангидразы В человека при

рН 9,0 (кривые 1—6). Влияние цианида на спектр карбоксиметилированной

Co(II)-карбоангидразы В человека (кривые 7—9).

Кривые 1—6 соответствуют спектрам, полученным при концентрациях иодацетата от 0 до

2-Ю-

М, как показано на вставке (ф D555; • Deis). K

для иодацетата лежит в пределах от

4'IO-

до 8-Ю

-3

. После 24 ч необратимо прореагировавший с иодацетатом фермент титро-

вался цианидом (избыток CN- 7,1, 8,2 и 9 экв) [156].

процесса при взаимодействии карбоангидразы В обезьяны с

Н-иодацетатом в концентрации Ю

-2

M потребовалось около 12 ч

[107]. Характер концентрационной зависимости свидетельствует

о необходимости предварительного насыщения иодацетатом

центра его обратимого связывания. С кинетической точки зрения

причины этого не вполне ясны.

Инактивированный иодацетатом фермент сохраняет способ-

ность присоединять к активному центру цианид и крупные мо-

590 Г лава

л скулы сульфамидов [107]. При этом цианид так же изменяет

спектры карбоангидразы, как и в случае нативного фермента

(рис. 16.11). Следовательно, структура координационного комп-

лекса не нарушается при модифицировании гистидина. Эти дан-

ные соответствуют схеме на рис. 16.12, согласно которой метили-

руемый азот гистидина удален от атома Zn на расстояние не бо-

лее чем три длины связи, т. е. достаточно близко для переноса

Рис. 16.12. Схема взаимодействия иодацетата с активным центром карбоангид-

разы В человека.

протона. Установлено, что этот гистидин имеет р/(

=5,8 и реа-

гирует с иодацетатом только в виде основания [65, 66]. Для фер-

ментативной активности это слишком низкое значение. С другой

стороны, независимые измерения показали, что обратимое присое-

динение иодацетата зависит от группы с р/С

—

7 (координирован-

ная молекула воды) [65]. Активность полностью карбоксимети-

лированного фермента составляет 10%, причем сохраняется сиг-

моидальный вид рН-зависимости с р/Са

8,5. Эту величину также

можно объяснить ионизацией воды в модифицированном фер-

менте. По данным спектров КД, в модифицирО|ванном ферменте

сульфамиды попадают в более полярное окружение, чем в натив-

ной карбоангидразе [108].

Разные видовые варианты фермента не одинаково чувстви-

тельны к иодацетату [107]. Используя

Н-иодацетат, удалось

установить, что при концентрации 10~

M реакция необратимого

ингибирования карбоангидразы В человека завершается через

24 ч поглощением 1 моля иодацетата. Примерно так же взаимо-

действует и изофермент В обезьян. Однако с карбоангидразой С

человека реакция при этих условиях лишь слегка заметна, иона

Карбоангидраза

591

вообще не происходит в случае карбоангидразы В быка [107].

Отсюда вытекает, что если гистидин есть во всех разновидностях

фермента, то в некоторых из них он обладает пониженной реак-

ционной способностью.

Для выяснения механизма катализа оказались полезными ис-

следования смещения кислотно-основных равновесий в фермента-

тивной системе вследствие присоединения лигандов к свободным

местам координационной сферы металла активного центра. При

ингибировании ионами, подобными CN

или HS

, в области зна-

чений рН, меньших величины рН для диссоциации HCN или

S (при 23 °С —9,3 или 6,9 соответственно [108]), должно на-

блюдаться выделение протонов. Общее количество последних

будет зависеть уже от нового положения кислотно-основных рав-

новесий системы. Для карбоангидразы исследование этих явле-

ний было проведено с помощью дифференциального титрования

в интервале рН от 6 до 10 [86], т. е. в области устойчивости циа-

нидного комплекса фермента. Метод заключался в фиксировании

(на рН-стате с точностью

±0,02 мкмоль H+) выделения или по-

глощения протонов после прибавления к раствору фермента экви-

молярного количества ингибитора, содержащегося в небольшом

объеме его концентрированного раствора.

Для решения поставленной задачи полезно провести сравне-

ние экспериментальных результатов с теоретическими зависимо-

стями, основанными на использовании какой-нибудь гипотетиче-

ской модели исследуемого процесса. Одна из таких схем, пред-

полагающая замещение цианидом координированной молекулы

воды, может иметь вид:

(a) EZn H

O + HCN «=±. EZn CN

+ H

O + H+

VK =8

-H

р/С

=9,3

—H

(2)

(б) EZn-OH

+ CN

т—» EZn CN" + OH"

Реакции (2а) и (26) должны иметь место в очень кислых и

в очень щелочных растворах соответственно, если, конечно, зна-

чения рK

координированной молекулы H^O не выходят за пре-

делы экспериментального интервала рН. Как показано на

рис. 16.13, кривая титрования для реакции цианида с Zn(II)-Kap-

боангидразой пересекает ось абсцисс; 1 моль H

освобождается

при рН 6,0 и 0,7 моля HO

освобождается при рН 10,1. Подоб-

ное изменение кислотно-основных равновесий является функцией

металла, так как при добавлении ионов CN

к апоферменту рН

системы не смещается. Аналогичная кривая наблюдается и для

случая кобальта (рис. 16.13). Эти результаты указывают на су-

ществование еще одного равновесия с р/С

8 (пунктирная кривая

на рис. 16.13). Экспериментальная картина согласуется со схе-

592

Г лава

мой (2), если последнее значение относится к диссоциации моле-

кулы H

O. При увеличении рН возрастает доля фермента в

ОН-форме. Ион 0Н~, вытесняемый цианидом, постепенно нейтра-

лизует HCN в соответствии с теоретической кривой на рисунке.

В конце концов CN

вытесняет только ОН

. Дополнительной осо-

бенностью, предсказываемой схемой (2), является зависимость

рН

Рис. 16.13. Замещение H

и ОН- в карбоангидразе В человека цианидом и суль-

фидом.

1 и 3 — кривые титрования HCN и H

S, приведенные в виде доли недиссоциированного ин-

гибитора (ордината слева); 2 — теоретическая кривая титрования для группы с рХ

=8,1.

приведенная в виде отношения количества диссоциировавшего H+ в молях на моль белка

(ордината справа). А эстеразная активность КЛВ (мкмоль гидролизованного субстрата

в 1 мин на 1 мкмоль фермента). 4 и 5 — теоретические [по уравнению (2)] кривые диффе-

ренциального титрования для замещения H+ и OH- цианидом и сульфидом соответственно

как функции рН: • ZndU-карбоангидраза; О апофермент: • Со(П)-карбоангидраза +CN-

(максимальное количество H+ и OH- освобождается лишь тогда, когда добавлено —1,5 экв

цианид-аниона); • 2п(П)-карбоангидраза + сульфид [86].

дифференциального титрования от рK

ингибитора. Это можно

проверить, используя сульфид, так как H

S имеет р/С

=6,3. Как

и ожидалось, титрование происходит на 1,5 единицы рН в более

кислой области. И опять для совпадения теоретических и экспе-

риментальных данных необходимо учитывать равновесие с

р/Са«8.

Эти результаты согласуются с присутствием координированной

молекулы воды в активном центре карбоангидразы [уравнение

(2)], но не доказывают его.