Куценко С.А. Основы токсикологии

Подождите немного. Документ загружается.

3.4.2. Снижение максимальных значений кривой "доза-эффект"

В ряде случаев при изучении зависимости "доза-эффект" для агониста (А*) в присутствии

антагониста выявляется, что максимальный наблюдаемый эффект существенно слабее, чем

наблюдавшийся от действия того же вещества в отсутствии антагониста (А). Это снижение

максимального эффекта, которое может быть оценено в процентах, с позиции оккупационной

теории трактуется следующим образом.

Неконкурентный антагонист (В*) реагирует с рецептором (R*) биосистемы, не являющимся

рецептором R для агониста (А), при этом образование комплекса [R*B*] приводит к понижению

эффективности комплекса [RA] понижается. Это приводит к некоему кажущемуся снижению

внутренней активности

агониста, зависящему от [В*].

Снижение максимальных значений кривой "доза-эффект" может быть объяснено и необратимым

ингибированием рецептора для агониста конкурентным антагонистом (В).

Для количественной характеристики активности неконкурентного антагониста используют

величину отрицательного логарифма константы диссоциации комплекса антагонист-рецептор

-logK

= pD*

Для расчета этой величины необходимо экспериментально определить максимально возможное

снижение эффекта агониста в присутствии насыщающей концентрации антагониста (Е

АВ*М

). Тогда

pD*

= -log[B*] - log[(Е

АВ*М

- Е

)/(Е

АВ*

- Е

) - 1] (21)

С учетом (21) рD

можно рассматривать как отрицательный логарифм концентрации

неконкурентного антагониста, при которой эффект агониста снижается на половину максимально

достижимого уровня. В этом случае (Е

АВ*М

- Е

)/(Е

АВ*

- Е

) = 2. Обычно для упрощения расчетов

вместо эффекта Е

используют максимальные эффекты, развивающиеся при действии А в разных

условиях: Е

АМ

, Е

АМВ

, Е

АМВМ

Если с помощью неконкурентного антагониста возможно полностью заблокировать эффект

агониста, то величину рD*

можно рассчитать по более простой формуле

pD*

= -log[B*] + log(E

AB*

-1) (22)

3.4.3. Параллельный сдвиг с одновременным снижением максимальных значений

На практике чрезвычайно редко приходится сталкиваться с веществами (антагонистами),

вызывающими либо только параллельный сдвиг, либо только снижение максимальных значений

кривой "доза-эффект" для агониста. Как правило, выявляются оба эффекта. В этой связи

становиться понятным, что деление многих ксенобиотиков на группы конкурентных и

неконкурентных антагонистов ряда рецепторов носит во многом механистический характер. Тем не

менее и в данном случае имеется необходимость количественной характеристики действия

вещества.

рD

рассчитывается в соответствии с уравнением (22), в которое вместо значений эффектов Е

АВ

подставляют значения Е

АМ

и Е

АМВ

(рисунок 7).

Рисунок 7. Теоретические кривые зависимости относительной эффективности агониста [А] от его

концентрации в присутствии в инкубационной среде антагониста [В]. Для расчета величины рД

следует использовать отношение условно равноэффективных доз [А] и [А*], после определения

соответствующих Е

АМ

и Е

АМВ*

. Расчет осуществляется в соответствии с уравнением (23), после

подтверждения факта, что неконкурентный антагонист является полным.

3.5. Определение кажущихся констант диссоциации комплекса "агонист-рецептор"

В то время, как прямая связь между значениями величин рА

и рD*

антагонистов с одной стороны

и констант диссоциации комплекса антагонист-рецептор с другой признается хотя бы

теоретически, связь между рD

и К

агониста таковой, в строгом смысле не является, поскольку

между этапом образования комплекса "агонист-рецептор" и этапом формирования эффекта лежит

цепь промежуточных звеньев биохимических и физиологических реакций, как правило далеко не

изученных (см. выше). Из этого следует, что непосредственно определить сродство токсиканта к

рецептору (т.е. величину константы диссоциации комплекса "токсикант-рецептор") исходя из

зависимости "доза-эффект", выстраиваемой в процессе эксперимента, не возможно. Для

преодоления этой сложности предлагается определять величину кажущейся константы

диссоциации. Классическим является метод с использованием необратимого конкурентного

антагониста.

В 1956 году Nickerson установил, что алкилирующие соединения типа -галогеналкиламинов,

например дибенамин и феноксибензамин, могут вступать в необратимое взаимодействие с

рецепторами различных типов. Связываются рецепторы к ацетилхолину, гистамину, серотонину,

-адренорецепторам. Изучая совместное взаимодействие ингибиторов и агонистов с

биопрепаратами, удалось:

- установить специфический характер действия галогеналкиламинов на агонист-связывающую

область рецепторов;

- уточнить классификацию рецепторов в соответствии с их сродством к эндогенным агонистам.

Furchgott предложил метод, основанный на сравнении эквиэффективных доз агониста,

действующего на интактный биопрепарат и препарат, обработанный предварительно ингибитором

рецепторов (уменьшение [R]

на величину q[R]

Эффект, связанный с действием агониста до блокады рецепторов описывается уравнением (13),

после блокады - уравнением (14). Одинаковый по выраженности эффект в этих условиях

развивается при одинаковой величине стимула S. Если S = S*, то Е

/Е

= Е

А*

/Е

М*

, и тогда,

комбинируя уравнения 13 и 14, получаем

1/[A] = 1/q 1/[A] + (1-q)/qK

(23)

Выстраивая зависимость в координатах 1/[А] и 1/[А*] получаем прямую с углом наклона 1/q и

отрезок на оси 1/[А], равный (1-q)/qK

. Для практического определения К

можно использовать

выражение

= (наклон - 1)/отрезок

Процесс подготовки данных представлен на рисунке 8:

Рисунок 8. Определение величины кажущейся константы диссоциации агонистов на

мускариночувствительный рецептор продольной мышцы тонкой кишки морской свинки.

а). Кривая зависимости доза-эффект ацетилхолина для интактного препарата (q = 1), и препарата,

обработанного в течение 20 минут фенокисбензамином (5мкМ) (q = 0,1624).

б). Построение графика соотношения равноэффективных доз для интактного и обработанного

препарата в координатах 1/[А] и 1/[А*] приводит к прямой, на основе которой (а также уравнения

23) можно вычислить значения константы диссоциации.

4. Зависимость "доза-эффект" в группе

4.1. Зависимость "доза-эффект" для одного токсиканта

При изучении зависимости "доза-эффект" в группе, состоящей из большого количества особей,

можно исходить из представлений, развитых при изучении зависимости на уровне отдельного

организма. Дополнительным фактором, влияющим на получаемый результат, является

индивидуальная изменчивость.

Однако хотя реакция отдельных людей или животных в группе на токсикант не одинакова, по мере

увеличения действующей дозы тем не менее будет увеличиваться и выраженность эффекта и

количество индивидов (особей), у которых развивается оцениваемый эффект. Например, если на

кожу испытуемых апплицировать вещество, вызывающее раздражение (ирритант), то по мере

увеличения количества наносимого токсиканта будут отмечаться: - увеличение числа испытуемых,

у которых разовьется реакция раздражения; - увеличится выраженность явления раздражения у

испытуемых. Из этого следует, что получаемые в ходе работы величины должны определяться с

учетом статистических закономерностей.

При изучении действия токсиканта на организм следует различать эффекты, выраженность

которых градуально зависит от действующей дозы (например, понижение артериального

давления) и эффекты типа "все или ничего" (пал/выжил). При этом следует учитывать, что

эффекты первого типа можно практически всегда преобразовать в форму, пригодную для оценки

эффектов второго типа. Для определения зависимости "доза-эффект" в группе обычно прибегают

к двум типам построения эксперимента:

- с образованием подгрупп исследуемых животных;

- без образования подгрупп.

4.1.1. Анализ зависимости "доза-эффект" методом формирования подгрупп

Наиболее распространенный способ определения зависимости "доза-эффект" в группе состоит в

формировании в этой группе подгрупп. Животным, входящим в подгруппу токсикант вводят в

одинаковой дозе, а в каждой последующей подгруппе доза увеличивается. Формирование

подгрупп должно осуществляться методом случайных выборок. С увеличением дозы будет

увеличиваться часть животных в каждой из подгрупп, у которых развился оцениваемый эффект.

Получаемую при этом зависимость можно представить в виде кумулятивной кривой частот

распределения, где количество животных с положительной реакцией на токсикант (часть общего

количества животных в подгруппе) является функцией дозы (рис. 9)

Рисунок 9. Типичная кривая доза - эффект для группы животных, симметричная относительно

средней точки (50% ответ). Основные значения ответа группы на токсикант сосредоточены вокруг

среднего значения.

В большинстве случаев график представляет собой S-образную кривую log-нормального

распределения, симметричную относительно средней точки. Можно выделить ряд важных

характеристик этой кривой, которые целесообразно учитывать при интерпретации получаемых

результатов.

1. Центральная точка кривой (значение 50% ответа) или средняя эффективная доза (ЕД

) -

удобный способ характеристики токсичности вещества. Если оцениваемый эффект - летальность

животных в группе, эта точка обозначается, как среднесмертельная доза (см. ниже). Эта величина

является наиболее точной количественной характеристикой токсичности, поскольку значение 95%

доверительного интервала здесь минимальны.

2. Чувствительность большинства животных в популяции близка среднему значению. Интервал

доз, включающий основную часть кривой вокруг центральной точки, иногда обозначается как

"потенция" препарата.

3. Небольшая часть популяции в левой части кривой "доза-эффект" реагирует на малые дозы

токсиканта. Это группа сверхчувствительных или гиперреактивных особей. Другая часть популяции

в правой части кривой реагирует лишь на очень большие дозы токсиканта. Это

малочувствительные, гипореактивные или резистентные особи.

4. Наклон кривой "доза-эффект", особенно в близи среднего значения, характеризует разброс доз,

вызывающих эффект. Эта величина указывает, как велико будет изменение реакции популяции на

действие токсиканта с изменением действующей дозы. Крутой наклон указывает на то, что

большая часть популяции будет реагировать на токсикант примерно одинаково в узком диапазоне

доз, в то время как пологий наклон свидетельствует о существенных различиях в

чувствительности особей к токсиканту.

Форма кривой и её экстремальные точки зависят от целого ряда внешних и внутренних факторов,

таких как состояние механизмов репарации повреждений, обратимость вызываемых эффектов и

т.д. Так, токсический процесс может не развиваться до тех пор пока не истощатся механизмы

защиты организма от действующего токсиканта, не наступит насыщение процессов биохимической

детоксикации. Точно также насыщение процессов образования токсичных метаболитов из

исходного ксенобиотика может явиться причиной выхода кривой "доза-эффект" на плато.

Важным вариантом кривой "доза-эффект" является зависимость, прослеживаемая в генетически

гетерогенной группе. Так, в популяции с необычайно высоким количеством особей, у которых

генетически закреплена повышенная чувствительность к токсиканту, возможно зарегистрировать в

левой части кривой отклонения от типичной S-образной формы (Рис. 10).

доза

Рисунок 10. Вариант кумулятивной кривой "доза-эффект" с выраженным гиперреактивным

компонентом

Кривая "доза-эффект" часто преобразуется в линейную зависимость путем её построения в

координатах log - пробит (доза токсиканта представляется в логарифмах, выраженность ответной

реакции - в пробитах). Это преобразование позволяет исследователю подвергнуть результаты

математическому анализу (например, рассчитать доверительный интервал, крутизну наклона

кривой и т.д.) (рис. 11).

Рисунок 11. Преобразование экспериментальных данных определения зависимости "ДОЗА -

ЭФФЕКТ": а) зависимость "ЭФФЕКТ - ДОЗА"; б) зависимость "ЭФФЕКТ - log ДОЗЫ"; в) зависимость

"ПРОБИТ ЭФФЕКТА - log ДОЗЫ".

Методом формирования подгрупп можно определить зависимость выраженности оцениваемого

эффекта (например, степень падения артериального давления, снижения двигательной

активности и т.д.) от действующей дозы токсикант. В этом случае, на основе полученных данных

определяют среднюю величину эффекта, развившегося в подгруппе испытуемых на вещество в

веденной дозе, и определяют доверительный интервал показателя в каждой точке. Затем строят

график зависимости величины эффекта от введенной дозы, путем нахождения

аппроксимационной кривой через "облако" точек (рисунок 12).

Рисунок 12. Кривая "доза-эффект" для оценки обездвиживающего действия нейролептика

пимозида при внутрибрюшинном введении крысам. Каждая точка на графике получена путем

регистрации эффектов, полученных у 10 - 20 животных.

4.1.2. Анализ зависимости "доза-эффект" без формирования подгрупп

При изучении действия быстро распределяющихся, но медленно выводящихся из организма

веществ можно обеспечить их постепенное внутривенное введение лабораторному животному, до

наступления вполне определенного по выраженности токсического эффекта (например, снижение

частоты дыхания на 40%). Таким образом, появляется возможность для каждого отдельного

организма определить дозу вещества, вызывающую желаемый эффект. Исследование проводится

на достаточно большой группе животных. Если построить график зависимости числа животных, у

которых эффект развился от величины использованных доз, то получим уже известную S-

образную кривую, анализ которой осуществляется по общим правилам.

4.1.3. Зависимость "доза-эффект" по показателю летальность

4.1.3.1. Общие представления

Поскольку смертельный исход после действия токсиканта - альтернативная реакция,

реализующаяся по принципу "все или ничего", этот эффект считают наиболее удобным для

определения токсичности веществ, его используют для определения величины

среднесмертельной дозы (ЛД

Определение острой токсичности по показателю "летальность" проводится методом

формирования подгрупп (см. выше). Введение токсиканта осуществляется одним из

возможных способов (энтерально, парентерально) при контролируемых условиях. При

этом необходимо учитывать, что способ введения вещества самым существенным образом

сказывается на величине токсичности (таблица 4).

Таблица 4. Влияние способа введения на токсичность зарина и атропина для

лабораторных животных

ТоксикантЖивотноеСпособ введения Смертельная доза (мг/кг)

Зарин Крысы Подкожно

Внутримышечно

Внутривенно

через рот

0,12

0,17

0,05

0,6

Атропин Мыши Внутривенно

через рот

800

Используются животные одного пола, возраста, веса, содержащихся на определенной диете, при

необходимых условиях размещения, температуре, влажности и т.д. Исследования повторяют на

нескольких видах лабораторных животных. После введения тестируемого химического соединения

проводят наблюдения, определяя количество павших животных, как правило за период 14 суток. В

случае нанесения вещества на кожу, совершенно необходимо регистрировать время контакта, а

также оговаривать условия аппликации (из замкнутого или открытого пространства

осуществлялось воздействие). Очевидно, что степень поражения кожи и выраженность

резорбтивного действия являются функцией как количества нанесенного материала, так и

продолжительности его контакта с кожей. При всех, помимо ингаляционного, способах воздействия

экспозиционная доза обычно выражается как масса (или объем) тестируемого вещества на

единицу массы тела (мг/кг; мл/кг).

Для ингаляционного воздействия экспозиционная доза выражается как количество тестируемого

вещества, присутствующего в единице объема воздуха: мг/м

или части на миллион (ppm - parts

per million). При этом способе воздействия очень важно учитывать время экспозиции. Чем

продолжительней воздействие, тем выше экспозиционная доза, выше потенциал

неблагоприятного действия. Получаемая информация о зависимости "доза-эффект" для

различных концентраций вещества во вдыхаемом воздухе должна быть получена при одинаковом

времени экспозиции. Эксперимент может быть построен и иначе, а именно различные группы

экспериментальных животных ингалируют вещество в одинаковой концентрации, но в течение

различного времени.

Для приблизительной оценки токсичности ингаляционно действующих веществ, одновременно

учитывающей и концентрацию токсиканта и время его экспозиции, принято использовать величину

"токсодоза", рассчитываемую по формуле, предложенной Габером в начале века:

W = C t , где

W - токсодоза (мг мин/м

)

С - концентрация токсиканта (мг/м

)

t - время экспозиции (мин)

Предполагается, что при непродолжительной ингаляции веществ одинаковый эффект

(гибель лабораторных животных) будет достигаться как при краткой экспозиции высоких

доз, так и более продолжительном воздействии веществ в меньших концентрациях, при

этом произведение времени на концентрацию для вещества остается неизменным.

Наиболее часто к определению токсодоз веществ, прибегали для характеристики боевых

отравляющих веществ. Величины токсичности некоторых ОВ представлены на таблице 5.

Таблица 5. Токсодозы отравляющих веществ (при ингаляционном воздействии)

Вещества LCT

(мг мин/м

)

1. Удушающего действия

- хлор

- фосген

- дифосген

19000

3200

- хлорпикрин

2. Общеядовитого действия

- мышьяковистый водород

- синильная кислота

- хлорциан

3. Кожно-нарывного действия

а. Соединения мышьяка:

- метиларсиндихлорид

- этиларсиндихлорид

- фениларсиндихлорид

- 2-хлорвиниларсиндихлорид

б. Иприты:

- дихлор-диэтилсульфид

- трихлор-триэтиламин

4. Нервно-паралитического действия (ФОВ)

- табун

- зарин

- зоман

- Vx

800

5000

2000

7000

3000

3000 - 5000

2600

1200 - 1500

1500

400

100

(M. Kruger, 1991)

Кривая "доза-летальность" как правило, аналогична по форме кривой распределения

кумулятивной частоты эффекта для других зависимостей "доза-эффект" (см. выше). Для целей

сравнения получаемых данных и статистической их обработки кривую преобразуют в форму

линейной зависимости, используя систему координат "log D - пробит".

Токсичность по показателю "летальность", как правило, устанавливается по определенному

уровню гибели животных в группе. Наиболее часто в качестве контрольного уровня используется

50% гибель животных, так как это соответствует медиане кривой распределения дозы, вокруг

которой симметрично концентрируется большинство позитивных ответных реакций (см. выше).

Эта величина и получила название - среднелетальная доза (концентрация). По определению

вещество, действуя в этой дозе, вызывает гибель половины популяции животных.

Концепция определения ЛД

веществ была впервые сформулирована Trevan в 1927 году. С этого

момента начинается становление токсикологии как настоящей науки, оперирующей

количественными характеристиками исследуемого свойства (величина токсичности).

В качестве других уровней смертности, подлежащих определению, могут быть выбраны величины

ЛД

, ЛД

, которые согласно законам статистики близки соответственно к порогу и максимуму

токсического действия и являются границами дозового интервала, в рамках которого, в основном,

и реализуется эффект.

По этическим и экономическим соображениям в опыт для определения ЛД

стараются брать

минимальное количество лабораторных животных. В этой связи определение искомой величины

всегда сопряжено с фактором неопределенности. Эта неопределенность учитывается путем

нахождения 95% доверительного интервала определяемой величины. Дозы, попадающие в этот

интервал, не являются среднесмертельными лишь с вероятностью менее 5%. Доверительный

интервал величины ЛД

значительно меньше, чем доверительные интервалы доз других уровней

летальности, что является дополнительным аргументом в пользу именно этой характеристики

параметров острой токсичности.

Как уже указывалось важной характеристикой любой кривой "доза-эффект" является её крутизна.

Так, если два вещества имеют статистически не различимые значения величин ЛД

и одинаковую

крутизну кривой токсичности "доза-эффект" (т.е. статистически не различимые величины значений

соответственно ЛД

и ЛД

), они, по показателю летальность - эквитоксичны в широком диапазоне

доз (вещества А и В на рис. 13). Однако вещества, имеющие близкие значения величин ЛД

, но

различную крутизну кривой токсичности существенно отличаются по своим токсическим свойствам

(вещество С на рис. 13).

Рисунок 13. Зависимости "доза-эффект" токсикантов с близкими значениями величин ЛД

, но

различной крутизной наклона

Вещества с пологой зависимостью "доза-эффект" представляют большую опасность для лиц с

выраженной гиперчувствительностью к токсикантам. Вещества с высокой крутизной зависимости

более опасны для всего населения, поскольку даже несущественное увеличение доза по

сравнению с минимально действующей приводит к развитию эффекта у большинства популяции.

4.1.3.2. Определение безопасных доз действия токсикантов

В ряде случаев возникает необходимость количественно определить величину максимальной

недействующей (безопасной) дозы токсикантов.

Методика решения этой задачи предложена Годдам. Исследование строится на установлении

зависимости "доза-эффект" в группе животных. Желательно, чтобы оцениваемый эффект был

достаточно чувствительным и оценивался не в альтернативной форме (например снижение

активности энзима, подъем артериального давления, замедление роста, нарушение

кроветворения и т.д.). График зависимости строится в координатах "логарифм дозы -

выраженность эффекта". Анализ кривой позволяет оценить ряд показателей. Поскольку кривая,

как правило, имеет S-образную форму, вычленяют участок, в пределах которого зависимость

носит линейный характер. Определяют крутизну прямой (b). Пороговый эффект (y

) определяют по

формуле: y

= tS, где t - коэффициент Стьюдента, определяемый по соответствующим таблицам;

S - величина стандартного отклонения, определяемая из данных опта. Пороговая доза (D

) - это

такая доза, действуя в которой вещество вызывает пороговый эффект. Для безопасной дозы (D

)

имеем

log D

= log D

- 6(S/b)

Пример, представленный на рисунке 14, комментирует определение безопасной дозы.

Рисунок 14. Графический метод определения порога безопасного действия ксенобиотика.

Пример. В течение нескольких недель крысам в корм добавляли систокс (инсектицид) в различных

концентрациях (части на миллион по массе). Эффект оценивали по степени угнетения активности

холинэстеразы крови. Каждая точка на графике представляет собой среднюю величину из 6 - 12

наблюдений. На графике рисунка 14 по оси "у" представлены данные о различии активности

энзима у интактных и экспериментальных животных (в относительных единицах от 0 до 1,0); по оси

"х" - логарифм концентрации токсиканта. Как следует из полученных данных, начиная с

определенной дозы (концентрации) зависимость приобретает линейный характер. Крутизна

прямой (b) равна - 0,66; среднее значение всех стандартных отклонений в отдельных группах S =

0,097; t - 2. Отсюда пороговый эффект y

= 2 х 0,097 = 0,194. Соответствующее значение D

, как

следует из графика, равно 0,42. Тогда имеем: log D

= 0,42 - 6(0,097/0,66) = -0,462. Таким образом,

безопасное (недействующее) содержание систокса в пище составляет 0,34 части на миллион.

4.1.3.3. Интерпретация и практическое использование результатов

Как правило, основной вывод, который делает токсиколог при установлении позитивной

зависимости "доза-эффект", состоит в том, что между воздействием исследуемого вещества и

развитием токсического процесса существует причинно-следственная связь. Однако информация

о зависимости должна интерпретироваться только относительно условий, в которых она получена.

Большое количество факторов влияет на её характер, причем специфично для каждого вещества

и биологического вида, на представителей которого вещество действует. В этой связи необходимо

учитывать ряд обстоятельств:

1. Точность количественной характеристики значения ЛД

достигается путем тщательного

проведения эксперимента и адекватной статистической обработки получаемых результатов. Если

при повторении эксперимента по определению токсичности получают количественные данные,

отличные от ранее полученных, это может быть следствием вариабильности свойств

использованного биологического объекта и условий окружающей среды.

2. Важнейшей характеристикой опасности вещества является время наступления смерти после

воздействия токсиканта. Так, вещества с одинаковым значением ЛД

, но разным временем

наступления смерти могут представлять различную опасность. Быстро действующие вещества

часто рассматриваются как более опасные. Однако вещества "замедленного действия" с очень

продолжительным скрытым периодом часто склонны к кумуляции в организме и в силу этого также

чрезвычайно опасны. К числу быстро действующих токсикантов относятся боевые отравляющие

вещества (ФОВ, синильная кислота, вещества раздражающего действия и т.д.). Вещества

замедленного действия - это полигалогенированные полициклические углеводороды

(галогенированные диоксины, дибензофураны и т.д.), некоторые металлы (кадмий, талий, ртуть и

т.д.) и многие другие.

3. Более полная интерпретация полученных результатов по оценке токсичности, помимо

определения количественных характеристик, требует детального изучения причин смерти (см.

соответствующий раздел). Если вещество может вызвать различные потенциально смертельные

эффекты (остановка дыхания, остановка сердечной деятельности, коллапс и т.д.), необходимо

представлять какой из эффектов является ведущим, а также может ли этот феномен стать