Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

282

На рис. 4.17, в качестве иллюстрации, приведена полученная методом от-

тенения микрофотография бактериофага Т4 E. Coli.

Рис. 4. 17

Электронная микрофотография бактериофага Т4 E.coli. Метод контрастирования - от-

тенение. Направление тени обозначено стрелкой

Для получения представлений о трехмерной структуре образца напыле-

ние проводят при различных углах наклона образца (α) по отношению к потоку

атомов металла.

4.8.1.2 Трехмерная электронная микроскопия

Получаемое в микроскопе изображение есть плоскостной срез трехмер-

ного объекта. Для выявление объемной формы образца прибегают к помощи

специального устройства, называемого гениометром. Он позволяет наклонять

объект под различными углами к электронному лучу и получать различные

двухмерные проекции (плоские срезы). Реконструкция объемного изображения

на основе набора полученных двухмерных проекций опирается примерно на

тот же математический аппарат, что и рентгеновская дифракционная кристал-

лография.

283

4.8.1.3 Молекулярная электронная микроскопия

Техника трехмерной электронной микроскопии «окрашенных» образцов

может быть применена для исследования и неокрашенных объектов с более вы-

соким разрешением. Теоретически такой подход предполагает возможность

прямого визуального наблюдения образующих молекулу атомов. Попытки вы-

полнения таких экспериментов предпринимались. Однако, результаты пока не

удовлетворительны, а трудности весьма велики. Связаны они прежде всего с

тем, что образец нужно предохранить от дегидратации, которая в условиях глу-

бокого вакуума в рабочей камере электронного микроскопа наступает очень

быстро. Решают эту проблему заливкой образца в тонкую пленку сахарозы. Во-

вторых, «неокрашенный» образец не защищен от прямого радиационного раз-

рушения, избежать которого можно только путем значительного сокращения

времени пребывания объекта в зоне электронного луча (время экспозиции).

Практически, образец может выдержать только непродолжительный импульс,

т.е. получаемое изображение имеет чрезвычайно низкую контрастность. По-

этому, информация о структуре может быть получена только для высокоупоря-

доченных двухмерных кристаллов.

В случае «неокрашенных» тяжелыми металлами образцов объект (белок)

состоит из легких атомов. Как результат, его изображение формируется не в ре-

зультате поглощения электронов, а за счет их торможения. Последнее изменяет

только фазу электронной волны. Поэтому, единичное точно сфокусированное

изображение «неокрашенных» объектов не содержит информации и структуре.

Для получения такой информации необходимо сделать серию снимков с раз-

личной фокусировкой (на различной, грубо говоря, глубине объекта). Обработ-

кой с помощью ЭВМ этих снимков можно выйти на фазово-контрастное изо-

бражение и реконструировать объемную трехмерную структуру.

Микроскоп Крева. В обычном электронном микроскопе падающий пучок

электронов покрывает весь образец. Существует несколько типов взаимодейст-

вия электронов с образцом:

284

1) отсутствие взаимодействия (т. е. прохождение через межатомные про-

странства) - наиболее распространено;

2) упругое рассеяние (без потери энергии) орбитальными электронами ато-

мов образца - также встречается достаточно часто;

3) неупругое рассеяние (с потерей энергии) ядрами атомов - встречается ре-

же.

Соотношение последних двух видов взаимодействия является характери-

стическим для каждого элемента, так как для каждого характерен определен-

ный размер ядерной мишени и для более тяжелых элементов, следовательно,

увеличивается доля неупругого рассеяния.

Исходя из этого был разработан новый специальный тип микроскопа. В

нем пучок электронов сжимается до очень малого (приблизительно 5 Å) пятна.

Это пятно быстро обегает образец, подобно тому как это делает электронный

луч развертки изображения на экране телевизора. При движении пучка измеря-

ется соотношение интенсивности электронов двух последних видов в каждой

точке с помощью спектрометра энергии электронов. Полученное соотношение

преобразуется в изображение на телевизионном экране соответствующим элек-

тронным устройством. Это новый важный шаг вперед в электронной микроско-

пии, дающий новый элемент анализа, поскольку здесь возможна идентифика-

ции индивидуальных атомов. В некоторых случаях предельное разрешение

удается довести до 2 Å.

Сканирующий микроскоп обратного рассеяния. Сканирующий элек-

тронный микроскоп представляет собой прибор, который позволил получить

множество прекрасных микрофотографий клеточных поверхностей. Разреше-

ние микроскопа ограничено 200 Å, причем он работает по совершенно другому

принципу по сравнению с обычным электронным микроскопом.

Подобно микроскопу Крева, пучок здесь сжимается в маленькое (100 Å)

пятно, которое обегает поверхность образца, покрытого толстым (200 Å) слоем

285

золота или другого тяжелого металла. Когда пучок падает на металл и проходит

в нем короткое расстояние, золото начинает испускать электроны вследствие

вторичной эмиссии или электроны пучка за счет обратного рассеяния. Это по-

зволяет формировать объемные картины исследуемых поверхностей клеток

(см. рис. 4.18).

Рис. 4.18

Электронная микрофотография эритроцитов человека, полученная Томасом Хайесом с по-

мощью сканирующего электронного микроскопа

4.9 Рентгеноструктурный анализ

В начале 1960-х годов было завершено одно из выдающихся эксперимен-

тальных исследований прошедшего столетия по пространственной структуре

белков. Перутц и Кендрю расшифровали трехмерную структуру миоглобина и

гемоглобина на атомарном уровне методом рентгеноструктурного анализа

(РСА). Этот метод исследования до настоящего времени остается практически

единственным источником наших знаний о пространственном строении моле-

кул. К 1975 году число белков, структура молекул которых была установлена

методом РСА с разрешением менее 3,5Å составило около 70. В настоящее вре-

мя оно перевалило за 20000. Темпы продвижения исследований в этой области

возрастают в последние годы экспоненциально (см. диаграмму на рис . 4.19) и

286

сдерживаются, в основном, трудностями получения монокристаллических об-

разцов белков с достаточной степенью упорядоченности.

Рис. 4.19

Динамика накопления данных о пространственной структуре белков, полученных методом

РСА И ЯМР-спектроскопии по сотоянию на 08.09.2003 г.

(Диаграмма взята из банка данных белков: http://nist.rcsb.org/pdb/)

Для получения кристаллов белка приходится опробовать иногда более тысячи

различных приемов кристаллизации. В последнее время для решения этой зада-

чи все большее распространение получают методы генной инженерии, в основе

которых лежит сайт-специфическая рекомбинация ДНК

4.9.1 Электромагнитные волны и их свойства

Любая электромагнитная (ЭМ) волна характеризуется четырьмя парамет-

рами: направлением (S), длиной волны (

), амплитудой (Е

) и начальной фазой

(

287

Синусоидальная волна - волна, амплитуда которой изменяется по сину-

соидальному закону. Например, изменение величины вектора напряженности

электрического поля электромагнитной волны описывается во времени так:

E = E

sin(

t - kx -

)

где Ф = (

t - kx -

) - фаза колебания (фаза волны).

Интенсивностью электромагнитной волны (I) называется величина чис-

ленно равная энергии, которую переносит волна за единицу времени через еди-

ницу площади поверхности, перпендику-

лярной к направлению распространения

волны. Интенсивность электромагнитной

волны пропорциональна квадрату ампли-

туды (E

) Перечисленные параметры по-

казаны на рисунке

Когерентные волны. Две волны являются когерентными, если разность

их фаз постоянна во времени. Волны одной частоты когерентны всегда.

Интерференция волн - это наложение когерентных волн, при котором на-

блюдается устойчивое во времени взаимное усиление в одних точках простран-

ства и ослабления в других точках в зависимости от соотношения между фаза-

ми этих волн.

Результат интерференции двух волн в конкретной точке пространства за-

висит от разности хода волн.

Дифракция волн - это совокупность обусловленных волновой природой

электромагнитного излучения явлений, которые наблюдаются при распростра-

нении волны в среде с резко выраженной неоднородностью (например при про-

хождении через отверстия в экранах, вблизи границ непрозрачных тел и т.д). В

более узком смысле, дифракция - это огибание волной встречных препятствий.

= 2

(

∆λ

)

∆λ

288

В опыте дифракция проявляется интерференцией лучей, распространяющихся

от различных точек препятствия.

4.9.2 Физические основы РСА

Рентгеновские лучи (Х-лучи) открыты Рентгеном в 1895г. Они представ-

ляют собой поток фотонов с высокой энергией.

В приложении к белкам метод РСА впервые применил в начале 30-х го-

дов Уильям Астбюри (Англия). Им были получены первые рентгенограммы ря-

да фибриллярных белков. При выборе именно этих белков Астбюри исходил из

предположения, что их пептидные цепи упорядочены и ориентированы в одном

определенном направлении.

Рентгеновские лучи образуется при бомбардировке вещества электрона-

ми с большой энергией (ускоренными электронами). В качестве мишени чаще

всего используют медь и молибден.

Получают рентгеновские лучи в рентгеновских трубках, которые пред-

ставляют собой вакуумный двухэлектродный прибор. Эмиссия электронов про-

исходит на катоде. Под действием разности потенциалов между катодом и ано-

дом примерно в 20 - 90 кВ электроны ускоряются и бомбардируют вещество

анода. Сталкиваясь с мишенью (зеркалом анода) электроны тормозятся, т.е. те-

ряют свою энергию. Эта энергия частично или полностью превращается в элек-

тромагнитное излучение в соответствии с законом:

= ∆E

где h - постоянная Планка,

- частота испускаемого рентгеновского излучения,

∆Е - величина утраченной при столкновении (быстром торможении) энергии

электрона.

При столкновении электронов с анодом возникает сплошной (непрерыв-

ный) спектр тормозного излучения в некотором интервале частот ∆

. Это так

называемое белое рентгеновское излучение, которое имеет резкую границу в

289

коротковолновой части спектра. Положение

этой границы определяется величиной раз-

ности потенциалов между катодом и анодом

в рентгеновской трубке, т.е. предельной

энергией ускоренного электрона:

max

= ∆E

max

= eU

где е - элементарный заряд, U- напряжение.

4.9.3 Характеристическое рентгеновское излучение

При столкновении ускоренных электронов с анодом возникает не только

непрерывный спектр излучения, но появляются и отдельные линии излучения,

положение которых определяется веществом анода. Это тонколинейчатое излу-

чение называется характеристическим рентгеновским излучением. Механизм

возникновения этих линий следующий.

Ускоренный электрон, выбивает один из внутренних электронов атома

мишени (анода). На образовавшуюся вакансию перемещается электрон с одной

из высших электронных оболочек атома. Возникающий при этом избыток энер-

гии в атоме излучается в форме кванта электромагнитной волны. Частота этого

кванта определяется разностью энергий между соответствующими энергетиче-

скими уровнями. Положение линий характеристического излучения определя-

ется только строением

атомов вещества мише-

ни, не зависит от величи-

ны ускоряющей разности

потенциалов между ано-

дом и катодом. Послед-

няя определяет интен

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Длина волны,

Интенсивность

50 кВ

40 кВ

30 кВ

0 0.4 0.8 1.2 1.6

Длина волны,

Интенсивность, относит. ед.

290

сивность соответствующих линий в спектре.

Спектры характеристического излучения просты. Они классифицируются

в порядке возрастания длин волн, величина которых зависит от типа оболочки

атома из которой выбивается электрон (K-, L-, M- и т.д.). Так, если электрон

выбит с К-уровня, то в спектре характеристического излучения появятся линии

К-серии, с L-уровня - L-серии и т.д. Вид спектров рентгеновского излучения с

анодами изготовленными из Мо и Сu приведен на рисунке выше.

4.9.4 Дифракция рентгеновских лучей на кристаллах

Длина волны генерируемого в рентгеновских трубках электромагнитного

излучения составляет 0.2 - 2 Å. Эти значения как раз соответствует величинам

межатомных расстояний в молекулах. К сожалению, мы пока не умеем фокуси-

ровать рентгеновские лучи. Не знаем как и не умеем создавать для них линзы.

Следовательно, мы не можем построить микроскоп, использующий рентгенов-

ские лучи. По этой собственно причине рентгеноструктурное исследование не

позволяет получить непосредственное изображение объекта, а дает лишь созда-

ваемую им дифракционную картину. Последняя, как правило, весьма сложна

даже для простых кристаллов. По мере увеличения числа атомов в элементар-

ной ячейке, восстановление пространственной структуры объекта, породивше-

го наблюдаемую в опыте дифракционную картину, становится задачей, нераз-

решимой без применения мощной вычислительной техники и надлежащего

программного обеспечения.

Дифракцию рентгеновских лучей на кристаллах открыл Лауэ в 1912г. Он

же описал условия появления дифракционной картины при рассеяниии рентге-

новских лучей трехмерными кристаллами. В настоящее время, однако, более

широко распространена более наглядная трактовка дифракционного эффекта,

предложенная в 1914 г. Бреггом. Суть ее в следующем. Пусть мы имеем кри-

сталл, в котором атомы расположены регулярным образом в плоскостях, от-

стоящих друг от друга на расстоянии d. По законам линейной оптики,

291

падающие на эти две плос-

кости лучи, не будут гасить

друг друга после отражения

лишь в том случае, если

разность их хода (разность

путей пройденных лучами)

будет кратной длине волны

падающего излучения (см рис.)

Как видно из рис. разность хода лучей 1 и 2 равна СВ + ВD. Учитывая,

что:

CB = BD = dsinθ,

условие появления интерференционного максимума для лучей 1 и 2 выразится

следующим образом:

2dsinθ = n

где n- целое число 1,2,3... (порядок отражения)

Последнее соотношение и есть уравнение Брегга. Оно определяет то

единственное значения угла θ, при котором отраженные от различных плоско-

стей трехмерного кристалла лучи не гасят друг друга. Все остальные, рассеян-

ные под отличными от θ углами, лучи при наложении взаимно ослабляются и

гасятся, т.е. не дают интерференционной картины.

Очень существенными для понимания явления дифракции рентгеновских

лучей на кристаллах являются следующие особенности взаимодействия этих

лучей с веществом и закономерности их дифракции.

¾ Рассеяние рентгеновских лучей происходит на электронах.

¾ Показатель преломления рентгеновских лучей для обычных кристалличе-

ских веществ равен практически единице.