Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

А.Н. ШЕНДРИК

ХИМИЯ БЕЛКА. СТРУКТУРА, СВОЙСТВА,

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ,

ПОЛНЫЙ ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ КУРС

ПРЕДИСЛОВИЕ

На стыке устоявшихся и хорошо развитых наук почти всегда

рождаются новые идеи. Как правило, такие идеи или гипотезы бывает весьма

плодотворными и обеспечивают стремительный прогресс новым областям

знаний. Яркими представителями таких детищ современного естествознания

является, безусловно, целая группа наук, которые сформировались в

последние десятилетия на стыке химии с биологией, медициной, физикой.

Лидируют на сегодняшний день в этой группе молекулярная биология и

биоорганическая химия.

Успехи молекулярной биологии обязаны стремительному развитию

современных физико-химических методов исследования. Особенно большой

прогресс достигнут за последние десятилетия в сфере изучения процессов

жизнедеятельности на уровне молекулярных структур и молекулярных

взаимопревращений с использованием методов меченных атомов,

скоростного (ультра-) центрифугирования, различных методов и вариантов

хроматографического анализа, методов оптической спектроскопии, ЯМР,

масс-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа, электронной и

сканирующей электронной микроскопии и т.д.

Новые подходы и приемы исследований в молекулярной биологии с

использованием современных инструментальных методов эксперимента

позволили проникнуть в самые глубинные недра клетки и проследить такие

основные этапы ее жизнедеятельности как рост, размножение, развитие,

наследственность и изменчивость.

Ключевые позиции в регулировании и протекании всех этих процессов

в клетке принадлежат двум классам органических биомолекул

(биополимеров): белкам и нуклеиновым кислотам. Именно они составляют

главную материальную основу любой живой клетки, органов или

организмов. Они ответственны за важнейшие структурные и каталитические

функции в процессах жизнедеятельности. Не удивительно, поэтому, что

одной из первостепенных задач молекулярной биологии является

исследование белков и нуклеиновых кислот, их структуры, свойств и законов

функционирования.

Задача эта необыкновенно сложная, прежде всего потому, что каждая

отдельная клетка содержит в своем составе порядка 10

молекул. Даже с

учетом того, что 98% этих молекул есть вода, доля органических молекул

клетки составляет около 400 миллиардов. Примерно половина из них – белки

и нуклеиновые кислоты. Выяснение их роли в обеспечении

жизнедеятельности клетки – одна из наиболее важных проблем современного

естествознания. Что же требуется для решения этой задачи от химии?

Для начала, необходимо установить природу основных компонентов

клетки, их химический состав, пространственное строение, функциональную

направленность, типы и механизмы, протекающих в клетке химических

реакций. Решая эти вопросы, химики используют традиционные приемы:

выделение отдельных компонентов клетки и их анализ, с одной стороны,

встречный синтез – с другой. При этом, принципиально существенной

стороной встречного синтеза при исследованиях биологических объектов

является получение биологически активных молекул. Как выяснилось,

выполнить синтез белковых компонентов клетки в лабораторных условиях

весьма непросто.

ВВЕДЕНИЕ

Основные этапы становления химии белка

Впервые, в числе объектов химических исследований белок оказался в

начале 18 столетия. В 1728 году итальянский ученый Я. Беккари выделил из

пшеничной муки клейковину и исследовал продукты ее сухой перегонке. В

1745 году он опубликовал результаты своих исследований, и это была первая

научная публикация о белке. Позже были выделены белковые вещества

растительного и животного происхождения, установлена близость их

химических свойств.

Первые элементные анализы белков растительного происхождения

выполнили Ж. Гей-Люссак и Л. Тенар в 1810 г. Результаты этих анализов

для различных белков оказались весьма близкими. На основании чего были

предложены первые эмпирические структурные формулы белков и

высказаны некоторые гипотезы относительно их состава. В 1841 г. немецкий

химик Ю.Либих предположил, что белки растительного и животного

происхождения близки по своему составу. Несколько раньше (в 1836 г.)

голландец Г. Мульдер высказал мнение, что в составе всех белков

содержится один и тот же радикал (фрагмент), который он назвал протеином

(от греческого «первенствую»). Этот радикал (Pr), по Мульдеру, имел

следующий состав Pr = C

. Это, пожалуй все, что дали

накопленные эмпирические данные об элементном составе белковых

веществ. Они не позволили выявить ни структуру белков, ни зависимость

между их строением и свойствами. Не смогла разрешить эту задачу и теория

протеина. Более того, проверка данных Мульдера Н. Лясковским, Ю.

Либихом и его учениками завершилась заключением, что никакого белкового

радикала не существует.

К середине 19 века были разработаны многочисленные приемы

выделения и очистки белков путем осаждения их из растворов солей.

Используя эти методики, Т. Шванн выделил в 1836 г. пепсин, К. Рейхерт в

1847 г. впервые получил кристаллы гемоглобина, Л. Корвизар в 1856 г.

открыл трипсин. Дальнейшее развитие этих исследований привело к

установлению того факта, что некоторые белки обладают способностью

расщеплять белковые молекулы. Они были названы протеолитическими

ферментами или протеазами. Белковые фрагменты, образующиеся под

действием протеаз, получили название пептонов. При анализе смесей

пептонов в их составе были обнаружены известные уже с начала 19 века

аминокислоты. Этот факт и был, вероятно, отправной точкой гипотезы об

аминокислотном составе белков.

Истоки химии аминокислот

Становление химии аминокислот связано, в основном, со следующими

открытиями.

¾ В 1806 г. было открыто первое производное аминокислот – амид

аспарагина.

¾ В 1810 г. открыта первая аминокислота – цистин. Она была выделена из

мочевых камней, т.е. вещества небелковой природы.

¾ В 1820 г. французский химик А. Браконно впервые выполнив

кислотный гидролиз белка, выделил из гидролизата неизвестную

аминокислоту, которую назвал глицином.

¾ Наличие в составе белков лейцина было доказано в 1839 г. В 1849 г. Ф.

Бопп открыл в составе белка еще одну аминокислоту – тирозин.

Таким образом, к началу 40-х годов 19 в. было известно только 4

аминокислоты и один амид аминокислоты. Тем не менее, эти факты

подтолкнули к мысли о наличии в природе особого класса органических

соединений – аминокислот. И уже в 1850 г. А. Штреккер синтезировал в

лаборатории аланин.

К концу 80-х гг. 19 в. из гидролизатов белков было выделено девять

различных аминокислот, что явно свидетельствовало о наличии этих

соединений в составе белков. К концу 19 в. число открытых аминокислот

достигло 13, однако они оставались в глазах исследователей только

обязательными, но не главными компонентами белковых молекул.

Значительно большее значение, как структурным элементам белка,

отводилось более сложным и менее определенным по строению пептонам.

Кратко история открытия аминокислот отражена в таблице.

Таблица

Хронология открытий аминокислот в составе белков

№ Аминокислота Год Источник Впервые

выделил

1 Глицин 1820 Желатина А. Браконно

2 Лейцин 1820

1839

Мышечные

волокна, шерсть

А. Браконно

Г. Мульдер

3 Тирозин 1848 Казеин Ф. Бопп

4 Серин 1865 Шелк Э. Крамер

5 Глутаминовая кислота 1866 Растительные

белки

Г. Риттхаузен

6 Аспарагиновая

кислота

1868 Конглутин,

легумин

Г. Риттхаузен

7 Фенилаланин 1881 Ростки люпина Э. Шульце

Й. Барбьери

8 Аланин 1888 Фиброин шелка Т. Вейль

9 Лизин 1889 Казеин Э. Дрексель

10 Аргинин 1895 Вещество рога С. Хедин

11 Гистидин 1896 Стурин,

гистоны,

А. Коссель

С. Хедин

12 Цистин 1899 Вещество рога К. Мёрнер

13 Валин 1901 Казеин Э. Фишер

14 Пролин 1901 Казеин Э. Фишер

15 Оксипролин 1902 Желатина Э. Фишер

16 Триптофан 1902 Казеин Ф. Гопкинс

Д. Кол

17 Изолейцин 1904 Фибрин Ф. Эрлих

18 Метионин 1922 Казеин Д. Мёллер

19 Треонин 1925 Белки овса С.Шрайвер и др

20 Оксилизин 1925 Белки рыб С.Шрайвер и др

* - цит. по: В.Т.Иванов, А.Н.Шамин Путь к синтезу белка.- Л.: Химия, 1982.

Пептидная гипотеза строения белков

Предположения о полимерном строении молекул белков были

высказаны Р. Хертом и А. Данилевским уже в 70-80 гг. 19 века. Однако, в

основе этих идей остались представления о том, что «мономерами» в этих

природных полимерах являются сложные образования. Данилевский,

опираясь на результаты исследований биуретовой реакции, пришел к

заключению о наличии в составе белковой молекулы цепочек

перемежающихся атомов азота и углерода (R’-NH-CO-NH-CO-R’’) и назвал

их углеазотными комплексами. Небиуретовыми структурами в белках по

Данилевскому являлись присоединенные к углеазотным комплексам

аминокислоты.

Дальше, в признании важной роли аминокислот в строении белков,

пошел немецкий физиолог и биохимик А. Коссель. Изучая протамины и

гистоны, он нашел, что при их гидролизе образуются большие количества

аргинина. Кроме того, в гидролизате он открыл ранее неизвестную

аминокислоту гистидин. Исходя из этих данных Коссель считал, что

основными составляющими белков являются аминокислоты. Однако в

предлагаемых им структурных формулах белок еще не представлялся в виде

пептидной цепи.

Отталкиваясь от Косселя немецкий химик Зигфрид в 1903 году

высказал гипотезу о том, что основу белковой молекулы составляют

комплексы построенные из нескольких аминокислот. Прежде всего –

аргинина, лизина, глутаминовой кислоты. Эта гипотеза не успела найти

широкого распространения, поскольку выдающийся немецкий химимк Э.

Фишер в это время уже активно разрабатывал пептидную теорию строения

белка.

ФИШЕР (Fischer), Эмиль

9 октября 1852 г. – 15 июля 1919 г.

Нобелевская премия по химии, 1902 г.

Немецкий химик-органик Герман Эмиль Фишер родился в

Ойскирхене, маленьком городке вблизи Кельна, в семье Лоренца

Фишера, преуспевающего коммерсанта, и Юлии Фишер (в

девичестве Пенсген). Весной 1871 г. отец направил его в Боннский

университет. Здесь он посещал лекции известного химика

Фридриха Августа Кекуле, физика Августа Кундта и минералога

Пауля Грота. В значительной степени под влиянием Кекуле, уделявшего мало внимания

лабораторным занятиям, интерес к химии у Ф. стал ослабевать, и он потянулся к

физике. В 1872 г. по совету своего кузена, химика Отто Фишера, он перешел в

Страсбургский университет, где под влиянием одного из профессоров, молодого химика

органика Адольфа фон Байера, у Ф. вновь возник интерес к химии. Вскоре Ф. окунулся в

химические исследования и был замечен после открытия фенилгидразина. После

получения докторской степени в 1874 г. он занял должность преподавателя в

Страсбургском университете. Когда в следующем году Байер получил пост в

Мюнхенском университете, Ф. дал согласие стать его ассистентом. В 1878 г. Ф. стал

приват-доцентом Мюнхенского университета, а в 1897 г. – адъюнкт-профессором

аналитической химии. Спустя три года он оставил Мюнхен и стал профессором химии в

Эрлангенском университете. Там он исследовал такие соединения, как кофеин,

теобромин (алкалоид), мочевую кислоту и гуанин, который, как он обнаружил,

получается из бесцветного кристаллического вещества, названного им пурином. Мочевая

кислота была открыта значительно раньше (в 1776 г.) Карлом Вильгельмом Шееле, а в

1820 г. Фридлиб Фердинанд Рунге выделил кофеин. Однако Ф. доказал, что соединения

эти имеют подобную структуру и могут быть синтезированы один из другого.

Продолжая работать над этой темой вплоть до 1899 г., Ф. синтезировал большое

число производных пуринового ряда, включая и сам пурин (1898 г.). Пурин – важное

соединение в органическом синтезе, так как оно, как было открыто позднее, является

необходимым компонентом клеточных ядер и нуклеиновых кислот. После занятия в 1885

г. поста профессора химии в Вюрцбургском университете Ф. продолжил свои

исследования пуриновых производных. Он также интересовался проблемами

стереохимии молекул сахаров. Применив принцип асимметрии атомов углерода

(опубликованный в 1874 г. Якобом Вант-Гоффом), Ф. предсказал все возможные

трансформации атомных структур для соединений класса сахаров; к 1890 г. он смог в

лаборатории синтезировать маннозу, фруктозу и глюкозу. В 1892 г. Ф. стал директором

Химического института Берлинского университета и занимал этот пост до самой

смерти. Расширив область исследования от сахаров до ферментов, он открыл, что

ферменты реагируют только с веществами, с которыми они имеют химическое

родство. Проводя исследования с белками, он установил число аминокислот, из которых

состоит большинство белков, а также взаимосвязь между различными

аминокислотами. Со временем он синтезировал пептиды и классифицировал более сорока

типов белков, основываясь на количестве и типах аминокислот, образовавшихся при

гидролизе. Активный сторонник фундаментальных исследований, Ф. проводил кампанию

в защиту таких междисциплинарных проектов, как экспедиция по наблюдению за

солнечным затмением для проверки теории относительности. Ориентируясь на

политику Рокфеллеровского фонда, которая позволила направить деятельность

американских ученых исключительно на фундаментальные исследования, Ф. в 1911 г.

получил денежные средства для создания Института физической химии и электрохимии

кайзера Вильгельма в Берлине. В 1914 г. он получил оборудование для создания

Института исследований угля кайзера Вильгельма в Мюльгейме.

В 1902 г. Ф. была присуждена Нобелевская премия по химии «в качестве признания

его особых заслуг, связанных с экспериментами по синтезу веществ с сахаридными и

пуриновыми группами». Говоря об исследованиях сахаров, Ф. в Нобелевской лекции заявил,

что «постепенно завеса, с помощью которой Природа скрывала свои секреты, была

приоткрыта в вопросах, касающихся углеводов. Несмотря на это, химическая загадка

Жизни не может быть решена до тех пор, пока органическая химия не изучит другой,

более сложный предмет – белки».

В 1888 г. Ф. женился на Агнессе Герлах, дочери профессора анатомии

Эрлангенского университета, у них было трое сыновей. Его старший сын Герман стал

профессором биохимии Калифорнийского университета в Беркли. Жена Ф. умерла через

семь лет после замужества.

После длительных контактов в лаборатории с фенилгидразином у Ф. образовались

хроническая экзема и желудочно-кишечные нарушения, что в 1919 г. привело его к

смерти. Рихард Вильшеттер считал его «не имеющим равных классиком, мастером

органической химии как в области анализа, так и в области синтеза, а в личностном

отношении прекраснейшим человеком». В его честь Германское химическое общество

учредило медаль Эмиля Фишера. Среди его многочисленных премий и наград были медаль

Дэви Лондонского королевского общества, прусский орден «За заслуги» и орден

Максимилиана за заслуги в искусстве и науке. Он был почетным доктором

университетов Осло, Манчестера, Брюсселя и Кембриджа. Являлся членом Прусской

академии наук и президентом Германского химического общества. Ф. создал одну из

самых обширных в истории науки научную школу, учениками которой были

представители самых разных стран, в том числе и России.. Среди его учеников – Отто

Дильс, Адольф Виндаус, Фриц Прегль, Отто Варбург.

Источник информации:

Лауреаты Нобелевской премии: Энциклопедия: Пер. с англ.– М.:Прогресс,

1992.

К моменту начала работы над проблемой строения белка Фишер был

уже всемирно признанным авторитетом. Он прославился своими

фундаментальными исследованиями пуриновых соединений, а также

расшифровкой строения сахаров. За последние работы он был награжден

второй в истории химии Нобелевской премией. Первым среди химиков эту

награду получил Я.Вант-Гофф в 1901 г.

В решении проблемы строения белка решающую роль сыграла

высказанная Фишером гипотеза о том, что белки образованы

аминокислотами, соединенными друг с другом амидной связью: -NH-CO-.

Такой тип связи Фишер назвал пептидной, а белок представил в виде

состоящего из аминокислот цепочечного полимера.

Обосновывая пептидный тип соединения аминокислот в белковые

молекулы, Фишер исходил из следующих экспериментальных фактов:

При гидролизе белков и их ферментативном расщеплении образуются

различные аминокислоты.

В молекулах белков содержится небольшое количество свободных

амино- и карбоксильных групп, т.е. соединение аминокислот в цепь

происходит так, что эти группы маскируют друг друга.

При разработке стратегии доказательства строения белков Фишер

сформулировал четыре основных направления исследований:

качественное и количественное определение продуктов полного

гидролиза белков;

установление строения конечных продуктов гидролиза;

синтез полимеров из аминокислот, соединенных пептидными связями;

сравнение свойств полученных пептидов с природными белками

Успешная реализация намеченной программы привела Фишера к

успеху. Работая над ней он параллельно уже в 1899-1900 гг. впервые доказал,

что в состав белков входят только L-стереоизомеры аминокислот.

Сегодня уже хорошо известно, что функции белков в клетках очень

сложны и многообразны. Есть белки переносчики веществ, белки-

катализаторы реакций (ферменты), белки - регуляторы процессов в клетке,

опорные и сократительные белки, белки защитники клетки от вирусов и

чужеродных тел и т.д. Контакт клетки с окружением также выполняют

разнообразные белки, способные «различать» формы молекул, температуру,

фиксировать ничтожные количества примесей и т.п.

По своему брутто-составу белковые молекулы очень просты. В них

входят в основном пять элементов: углерод, кислород, водород, азот и сера.

При этом, белками контролируется масса разнообразнейших одновременно