Журнал Биотехнологии. Теория и практика. 1, 2010 г

Подождите немного. Документ загружается.

11Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Нано-

материал

Применение Механизм цитотоксичности

Приёмы, потенциально

позволяющие избежать

токсичности

Фуллерены Доставка лекарств.

Фотоактивируемые

антимикробные

агенты. Нейропротек-

торная и антиокси-

дант ная активности.

Фотодинамическая

терапия опухолей

Спонтанная или

фотоактивируемая продукция

АФК. Гидрофобная

поверхность вызывает

агрегацию

Уменьшение гидрофобности

покрытием или модификацией

поверхности анионными

соединениями

Катионные

наносферы и

дендримеры

Уникальный носитель

для направленной

доставки лекарств

Повреждение и утончение

мембраны. Повреждение

эндосом и лизосом

(см. далее)

Уменьшение плотности

катионного (положительного)

заряда. Замена катионных групп

амфифильными. Уменьшение

вероятности неспецифических

внутриклеточных взаимодей-

ствий путём специальных

химических модификаций

Ni/Co

ферри товые

нано частицы,

магнитные

наночас тицы

Контрастирование

в томографии,

разделение сложных

биологических

образцов (молекул,

клеток)

Выделение токсичных

катионов

Покрытие частиц полимерами,

углеродом, фосфоновыми

кислотами. Заключение в

полимерную капсулу или

липосому

Продукция АФК.

Провоспалительная

активность

Покрытие биосовместимыми

материалами

Cu/CuO Антибактериальные

качества

Повреждение ДНК и

окислительный стресс

MoO

Разрушение мембраны

Наночастицы внутри клетки: в процессе эндоцитоза

Пути и взаимодействия наночастиц после того, как они попадут внутрь клетки, изучены

пока довольно слабо, хотя это и представляет огромный интерес в смысле направленной

доставки лекарств в клетку [4]. Не oчень понятно и как клетка выбирает конкретный путь

захвата: это может быть фагоцитоз, пиноцитоз, рецептор-опосредованный или кавеолин-

опосредованный эндоцитоз, причём этот выбор зависит как от клетки, так и от параметров

частицы.

Первоначальное расположение захваченной внутрь клетки частицы – это фагосома или

эндосома (в зависимости от того, каким способом был произведён «захват»). Следующим

этапом эти везикулы сливаются с лизосомой, образуя вторичную лизосому, и уже на этом

этапе наночастицы могут начать оказывать на клетку аномальное влияние. В частности,

внутри лизосомы такие наноматериалы как катионные дендримеры, полимеры в комплексе

с ДНК, производные полистирола могут вызывать эффект протонной губки. Часто

содержащиеся в наноматериалах ненасыщенные аминогруппы присоединяют протоны, в

обилии содержащиеся в кислой среде лизосом, что заставляет протонные помпы (равно

как и каналы ионов хлора) продолжать работать до тех пор, пока лизосома не набухнет

и, в конце концов, не лопнет (рис. 5). При этом, конечно, всё содержимое лизосомы

попадает в цитоплазму – и наночастицы, и кислота. Кроме этого, разрыв лизосомы чреват

активацией Ca

-зависимых пор в митохондриях, что приводит к снижению синтеза АТФ

и даже апоптозу. Многие другие механизмы токсичности наночастиц также связаны с

происходящим в лизосомах.

12 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Рис. 5. Схема механизма «протонной губки», приводящего к разрушению лизосом и лежащему в

основе цитотоксичности некоторых наночастиц

Эффект наночастиц на организм в целом

Наноматериалы, благодаря своим уникальным свойствам, имеют широчайшие

перспективы применения в биологии и медицине: флуоресцентные метки для исследований

и диагностики (особенно любопытны в этом смысле полупроводниковые квантовые

точки, чьими оптическими параметрами легко управлять, просто меняя размер частицы);

• направленная доставка лекарств и генов;

• детектирование патогенов на молекулярном уровне;

• изучение взаимодействий белков и нуклеиновых кислот;

• разрушение опухолей селективным нагреванием (фототермическая терапия);

• выделение и очистка биомолекул и клеток – уникальные возможности для этой

задачи дают магнитные наночастицы;

• контрастирование при томографии;

• изучение фармакокинетики и многое другое.

Первостепенное значение на настоящий момент имеют системы направленной

доставки лекарств, созданные на основе нанотехнологий – на них приходится около ¾ всех

выпущенных на рынок продуктов [6]. Это обстоятельство объясняется тем, что доставка –

это, хотя и сложный, но далеко не единственный момент в молекулярной медицине. Куда

сложнее разработать активное вещество, которое излечило бы болезнь, будучи доставлено

по адресу. Сами лекарственные вещества, применяемые в настоящее время, в большинстве

случаев были разработаны ещё десятилетия назад, но усовершенствованные системы

доставки дают им «второе дыхание».

Впрочем, на конвейере у фармацевтических концернов разрабатывается много новых

лекарств, так что объём наномедицинского рынка в ближайшие годы превысит 10–15 млрд.

$ ежегодно. Только по данным 2006 года, в мире насчитывается около 200 фармацевтических

компаний, занимающихся разработками в области наномедицины, и ими выпущено около

40 продуктов, так или иначе классифицируемых как «наномедицинские» [7]. На текущий

момент можно смело эти цифры удвоить.

13Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Однако полноценно эксплуатировать преимущества, которые сулит применение

нанотехнологий в медицине, можно только адекватно оценив связанные с наноматериалами

опасности и приняв соответствующие меры по защите. Свойства барьера нано–био

непосредственно определяют биосовместимость наноматериала в целом – то есть,

будет ли он токсичным, какой способ введения наночастиц в организм будет наиболее

эффективным, насколько активно частицы будут выводиться из организма.

Интересно отметить, что наноматериалы – в частности, знаменитые углеродные

нанотрубки, – ведут себя подобно двуликому Янусу – уникальные терапевтические и

диагностические свойства (табл. 2) сочетаются с токсическим эффектом, оказываемым на

лёгкие.

В повреждении лёгких виноваты нанотрубки и дендримеры. При слежении за «судьбой»

меченных частицами золота однослойных углеродных нанотрубок после вдыхания их аэрозоля

оказывается, что альвеолярные макрофаги реагируют на них по-разному в зависимости

от свойств поверхности. «Сухие» нанотрубки оставались практически незамеченными

и мигрировали за стенку альвеол, где, взаимодействуя с фибробластами, стимулировали

выработку коллагена (что приводит к фиброзу лёгочной ткани). Но если принимать суспензию

нанотрубок в 10–15% растворе альбумина, макрофаги начинают идентифицировать их как

инородные объекты и захватывают внутрь себя.

Реакция организма на наночастицы сильно зависит от их размера: на примере TiO

продемонстрировано, что частицы более мелкого «помола» вызывают значительно более

сильное воспаление лёгочной ткани и имеют бóльшую токсичность, чем та же масса

более крупных частиц. Оказалось, что всё дело в поверхности: одинаковой токсичностью

обладают образцы с равной общей площадью поверхности, а не с равной массой.

Ещё один тип наночастиц, которые могут быть токсичными при накоплении в лёгких, –

это сверхразветвлённые полимеры, в частности – дендример полиамидоамина (PAMAM).

Дендримеры уже довольно активно применяются для доставки лекарств в клетку, переноса

генов в задачах генной терапии и в других областях. Среди их преимуществ можно

назвать точно контролируемые размеры и форму частиц, что связано с особенностями

их получения: дендримеры синтезируются «по слоям» и напоминают дерево, «корень»

которого находится в центре сферической частицы, а «крона» покрывает всю поверхность.

В зависимости от числа таких «слоёв» говорят о «генерации» (G) конкретного дендримера,

имея в виду число стадий синтеза и размер результирующих частиц. Дендримеры PAMAM

генераций G

–G

имеют схожий размер с гистонами, из-за чего они хорошо связывают

ДНК, – и это обусловливает их способность работать в качестве переносчика генов.

Поскольку дендримеры накапливаются преимущественно в лёгких, исследования их

эффекта in vitro проводили на культуре клеток аденокарциномы лёгких A549. Токсический

эффект обнаружен только на катионных дендримерах, – в частности, на дендримере

PAMAM G3 [8]. Исследование механизма токсичности показало, что дендример

запускает программу гибели клетки, но это, против ожиданий, оказался не апоптоз, а

аутофагия, активируемая в сигнальном пути Akt–TSC2–mTOR. В то время как основным

диагностическим признаком апоптоза является «нарезание» генома клетки на части,

при аутофагии характерно образование специальных органелл с двойной мембраной

– аутофагосом, в которых клетка фактически «переваривает» себя по частям. То, что

это именно аутофагия, было подтверждено использованием 3-метиладенина (3-МА) –

ингибитора этого варианта «самоубийства» клетки, – как in vitro, так и in vivo: мыши,

получавшие 3-МА на фоне приёма PAMAM G3, меньше страдали от токсического действия

дендримера.

К сожалению, 3-МА нестабилен в организме человека и не может использоваться

для снижения токсичности наночастиц; однако наверняка будут открыты и другие

14 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

ингибиторы, применение которых сделает использование наночастиц в медицине более

безопасным, – главное, механизм токсичности уже стал известен. «Наше открытие является

перспективной отправной точкой для снижения побочных эффектов от использования

наноматериалов в лечении людей. Наномедицина обещает невероятные возможности в

лечении таких сложнейших заболеваний как рак и вирусные инфекции, однако вопрос

безопасности встаёт тут как никогда остро», – говорит автор исследования по PAMAM G3

Ченгу Жанг (Chengyu Jiang) [9].

Не только вред: антимикробные наночастицы на основе катионных пептидов

Есть у наночастиц и положительные стороны. Учёные из сингапурского Института

биоинженерии и нанотехнологий разработали самособирающиеся наночастицы на основе

катионных антимикробных пептидов (АМП), которые более активны и менее токсичны, чем

«обычные» АМП (а они уже давно привлекают внимание как альтернатива традиционным

антибиотикам [10], утратившим свой ореол из-за выработки микроорганизмами

резистентности).

Катионные антимикробные пептиды интересуют учёных всё больше из-за их

способности действовать сразу на множество микроорганизмов и уничтожать даже те из

них, которые выработали устойчивость против большинства современных антибиотиков.

В основе их действия лежат главным образом неспецифические взаимодействия с

отрицательно заряженной клеточной стенкой бактерий и разрушение мембраны, за

которым следует лизис и гибель микроорганизма.

Сингапурские учёные взяли за основу пептид TAT (последовательность YGRKKRRQRRR)

– минимальный фрагмент белкá TAT ВИЧ-1, способный проникать через мембрану, – и

оптимизировали его, добавив «для верности» ещё шесть положительно заряженных остатков

аргинина и – через глициновый «линкер» – молекулу холестерола, предназначенного для

формирования гидрофобного «ядра» наночастицы [11] (рис. 6). Для пептида TAT известны его

свойства доставлять через мембрану белки, киРНК, липосомы, мицеллы и квантовые точки, и

исследователи решили, что в составе наночастицы, где концентрация положительного заряда

будет выше, и эффект будет сильнее.

Рис. 6. Структура пептида, образующего наночастицы с антимикробными свойствами [12].

Показана схе-

ма образования ми-

целлы пептида

составом Хол–G

–

–TAT, в которой

холестерол (Хол)

образует гидрофоб-

ное ядро, а положи-

тельно заряженные

в растворе остатки

устилают поверх-

ность наночастицы.

На врезке – сканиру-

ющая электронная

микрофотография,

позволяющая оце-

нить размер образу-

ющихся наночастиц

(≈100–150 нм).

15Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Испытания новых наночастиц на ряде микроорганизмов – бактерий (в том числе,

устойчивых к антибиотикам), грибов и дрожжей – показали высокую активность

(минимальная ингибирующая концентрация ~10 μМ) и, что самое главное, не обнаружили

вредных побочных эффектов: гемолиз практически отсутствовал, равно как и токсическое

действие наночастиц на почки и печень. Под электронным микроскопом в мембранах

убитых бактерий видны многочисленные поры, образованные наночастицами, что, видимо,

привело к обнажению протопласта и лизису микроорганизмов.

Лечебное действие пептидных наночастиц проверили и на живых организмах:

подопытным мышам вводили в мозг минимальную летальную дозу золотистого

стафилококка (Staphylococcus aureus), вызывающего острое воспаление мозга – менингит

– и 100% гибель в течение 48 часов при отсутствии лечения. Однако одновременное

введение этих наночастиц (и ещё одно – через сутки) позволило сохранить жизнь многим

животным. Высокий терапевтический индекс (отношение летальной концентрации (LD

) к

терапевтической концентрации (ED

), равное в этом случае 50) объясняется ещё и тем, что

наночастицы с лёгкостью преодолевают гематоэнцефалический барьер – что недоступно

«обычным» антибиотикам, – и борются с инфекцией уже «на местах».

Сконструированные сингапурцами наночастицы являются весьма перспективным

средством лечения различных инфекционных заболеваний, причём это касается не только

менингита. «Полученный нами олигопептид – уникальное вещество, которое само образует

наночастицы, способные проникать через мембраны», – говорит И-Ян Янг (Yi-Yan Yang),

руководитель этого исследования – «Эти наночастицы с лёгкостью „пробивают“ мембраны

бактерий, дрожжей и грибов и дестабилизируют и убивают клетки» [12].

Как видим, наночастицы несут и угрозы (правда, не такие уж леденящие, как

пресловутая «серая слизь»), и преимущества. Если попытаться резюмировать вопрос

о биосовместимости наночастиц, то оказывается, что самыми главными параметрами,

позволяющими оценить токсичность, являются размер наночастиц, их гидрофобность и

электрокинетический потенциал (ζ-потенциал) частицы в растворе (рис. 7).

Рис. 7. Биосовместимость наночастиц в зависимости от их физических характеристик [2].

Гидрофобные частицы имеют очень небольшое время жизни в кровотоке, поскольку

они оперативно выводятся из организма печенью и селезёнкой. Размер наночастиц также

является определяющим фактором в этом вопросе: частицы размером менее 8 нм выводятся

почками, в то время как печень «специализируется» на более крупных образованиях

– она удаляет из кровяного русла любые частицы диаметром >200 нм. Частицы же

16 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

промежуточного диаметра (от 30–40 до 200 нм) могут пассивно аккумулироваться, причём

в опухолевых очагах (!) – по механизму, известному как увеличенная проницаемость

и удерживание. Происходит это из-за повышенного кровоснабжения и пониженного

лимфатического дренажа в опухоли.

Что касается поверхностного заряда частиц, то катионные частицы в большинстве

случаев токсичны и вызывают гемолиз и агрегацию эритроцитов.

Безопасные наноматериалы будущего

Уже сегодня, по данным промышленной аналитики, на рынке более 800 продуктов,

при изготовлении которых использовались нанотехнологии. Очевидно, что в ближайшем

будущем эта тенденция не только сохранится, но и усилится – и не в последнюю очередь

за счёт нанобиотехнологий. Чтобы избежать потенциальных опасностей со стороны

«нанолекарств» и наноматериалов, необходимо иметь полные сведения о структуре

интерфейсов «нано–био», в которых принимают участие наночастицы, оказавшись внутри

живого организма. Видимо, эти знания станут хрестоматийными для первого поколения

«наноучёных», которые обеспечат человечество неслыханными – в хорошем смысле –

наноматериалами. Главное, чтобы не получилась ненароком «серая слизь».

Литература

1. STRF.ru: «Медицина и фармацевтика в наномире».

2. Nel A.E., Mädler L., Velegol D., Xia T., Hoek E.M.V., Somasundaran P., Klaessig F.,

Castranova V., Thompson M. (2009). Understanding biophysicochemical interactions at the

nano-bio interface. Nature Materials 8, 543–557.

3. Auffan M., Rose J., Bottero J.-Y., Lowry G.V., Jolivet J.-P., Wiesner M.R. (2009).

Towards a denition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety

perspective. Nature Nanotechnology 4, 634–641.

4. биомолекула: «Наномедицина будущего: трансдермальная доставка с

использованием наночастиц».

5. биомолекула: «Доставка лекарственных препаратов на основе рецептор-

опосредованного эндоцитоза».

6. Farokhzad O.C., Langer R. (2009). Impact of nanotechnology on drug delivery. ACS

Nano 3, 16–20.

7. Wagner V., Dullaart A., Bock A.K., Zweck A. (2006). The emerging nanomedicine

landscape. Nat. Biotechnol. 24, 1211–1217.

8. Li C., Liu H., Sun Y., Wang H., Guo F., Rao S., Deng J., Zhang Y., Miao Y., Guo C.,

Meng J., Chen X., Li L., Li D., Xu H., Wang H., Li B., Jiang C. (2009). PAMAM nanoparticles

promote acute lung injury by inducing autophagic cell death through the Akt-TSC2-mTOR

signaling pathway. J. Mol. Cell. Biol. 1, 37–45.

9. ScienceDaily: “Health Risks Of Nanotechnology: How Nano-particles Can Cause Lung

Damage, 9. And How The Damage Can Be Blocked”.

10. биомолекула: «Антимикробные пептиды – возможная альтернатива

традиционным антибиотикам».

11. Liu L., Xu K., Wang H., Tan P.K., Fan W., Venkatraman S.S., Li L., Yang Y.Y.

(2009). Self-assembled cationic peptide nanoparticles as an efcient antimicrobial agent. Nat.

Nanotechnol. 4, 457–463.

12. ScienceDaily: “Nanotechnology Combats Fatal Brain Infections”.

Статья напечатана по материалам сайта «biomolecula.ru»

17Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

УДК 614.2+575.191-616.006

ГеНетичеСКая ПреДраСПОЛОжеННОСть

К раКУ МОЛОчНОй жеЛеЗы

А.Р. Акильжанова

РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» КН МОН РК, г.

Астана

В последние годы в нашем понимании генетической предрасположенности к раку молочной железы

был достигнут значительный прогресс. В настоящее время известно три класса факторов генетической

предрасположенности, классифицированных по риску развития рака молочной железы. Гены BRCA1 и

BRCA2 являются генами предрасположенности к развитию рака молочной железы высокой пенетрантности,

определенные с помощью геномных ассоциативных исследований и позиционного клонирования. Скрининг

мутаций в генах, функционально связанных с BRCA1 и/или BRCA2, выявил четыре гена, CHEK2, ATM,

BRIP1 и PALB2; мутации в этих генах редки и определяют промежуточный риск рака молочной железы.

Ассоциативные исследования определили восемь общих вариантов, связанных с низко пенетрантной

предрасположенностью к раку молочной железы. Несмотря на все эти открытия, большая часть семейного

риска рака молочной железы остается невыясненной. В этом обзоре мы описываем известные генетические

факторы предрасположенности, излагаем методы, с помощью которых они были выделены, более подробно

останавливаемся на генах BRCA1 и BRCA2, и рассматриваем вопросы о применении в клинике знаний о

генетической предрасположенности к раку молочной железы.

Ключевые слова: BRCA1/2 гены, аллель, семейная предрасположенность, восприимчивость,

пенетрантность.

Определения и сокращения, ис-

пользуемые в тексте

анализ наследования (Segregation

analysis) – определение количества потом-

ков, которые унаследовали различные и

взаимоисключающие фенотипы; исполь-

зуется в качестве критерия оценки пред-

полагаемого типа наследования, например,

менделевского, аутосомно-доминантного,

аутосомно-рецессивного и др.

анализ сцепления (linkage analysis) –

статистический метод для оценки сцеп ления

между болезнью и маркерами в известном

месте с помощью анализа их наследования

в семьях.

аллель – одна из двух (или несколь ких)

альтернативных структурных форм гена.

ATM - Ataxia-Telangiectasia Mutated ген.

BRCA1 – BReast-Cancer succeptibility

gene 1, breast cancer associated, ген,

ассоциированный с раком молочной железы

BRCA2 – BReast-Cancer succeptibility

gene 2.

Гены BRCA1, BRCA2 – гены, подав-

ляющие опухоль, мутантные фенотипы

которых предрасполагают к развитию

рака молочной железы и яичников.

Они участвуют в регуляции клеточного

размножения, предохраняя клетки от

чрезмерно быстрого роста и деления,

ингибируют рост клеток, выстилающих

протоки молочной железы.

Ген – транскрибируемый участок хро-

мосомы, кодирующий функциональный

белок либо тРНК или рРНК.

Генетический полиморфизм – наличие

двух или более аллельных форм отдельных

генов.

Генотип – генетическая конструкция

организма, набор всех его аллелей.

ДНК, Дезоксирибонуклеиновая кис-

лота – полимер, состоящий из дезок-

сирибонуклеотидов; видоспеци фичный

носитель генетической информации.

Локус – место в хромосоме, где

находится специфический ген.

Мутация – спонтанное или инду-

цированное изменение структуры гена.

Неравновесность по сцеплению

(Linkage disequilibrium) – не случайная

ассоциация аллелей в двух или более

18 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

локусах, которая предполагает, что они

могут физически близко находиться и быть

сцепленными.

Пенетрантность – вероятность выра-

жения конкретного фенотипа/заболевания у

лица с определенным генотипом

рМж – рак молочной железы

ря – рак яичников

CHK1/2 – чекпоинт киназы 1/2

единичный нуклеотидный поли-

морфизм (Single nucleotide polymorphism

- SNP) – сиквенс варианты единичного

основания/нуклеотида, которые обычно

появляются в определенном положении в

геноме.

Фенотип – совокупность всех приз-

наков особи, формирующаяся в процессе

взаимодействия ее генотипа и внешней

среды.

Хромосома – структура, основу кото-

рой составляет конденсированная молекула

ДНК; носитель генетической информации.

Введение

С помощью динамического исполь-

зования различных подходов в последние

два десятилетия мы стали свидетелями

постепенного появления четкого понимания

генетической предрасположенности к раку

молочной железы (РМЖ). Клинические

наблюдения необычной семейной

кластеризации и фенотипов, связанных с

РМЖ, явились основой этих достижений.

Наблюдательная эпидемиология также

подвела необходимую основу для нашего

понимания, как в количественном вкладе

генетических факторов в развитие РМЖ,

так и в прогнозировании, как эти факторы

будут действовать в отдельности и во

взаимодействии. Риск развития РМЖ у

женщин определяется как генетическими

факторами, так и факторами образа жизни

и внешней среды. Вариации частоты

РМЖ среди популяций в большей степени

объяснимы с точки зрения факторов образа

жизни, такие как репродукция, диета,

физическая активность и др. и частично

генетически детерминированы.

Было выполнено генетическое моде-

лирование с целью определения профиля

генов, что в свою очередь облегчает выбор

молекулярно-генетических методов, под-

ходящих для их идентификации. Анализ

сцепления, скрининг мутаций в генах-

кандидатах, а также ассоциативные

исследования были использованы для

выявления факторов предрасположенности

к РМЖ трех разных профилей риска и

преобладания: редких аллелей высокой

пенетрантности, редких аллелей средней

пенетрантности и общих аллелей низкой

пенетрантности.

В этом обзоре мы описываем

известные генетические факторы пред-

расположенности, излагаем методы, с

помощью которых они были выделены,

более подробно останавливаемся на

генах BRCA1 и BRCA2 и рассматриваем

вопросы о применении в клинике знаний о

генетической предрасположенности к раку

молочной железы.

Наблюдательная эпидемиология и

анализ наследования

Эпидемиологическое наблюдение

кластеризации РМЖ среди семей, члены

которой страдали РМЖ, было сделано

во времена Римской империи, и было

подтверждено ранними социально-

научными комментаторами [1, 2]. Более

50 исследований посвящено изучению

этой семейной агрегации РМЖ с

использованием в основном исследований

типа «случай-контроль» и когортных

исследований. Мета-анализ этих данных

позволил сделать вывод, что, в целом,

РМЖ встречается в два раза чаще у

женщин, имеющих родственницу первой

степени родства с данным заболеванием.

Исследования на моделях показывают, что

факторы внешней среды могут вызвать

минимум десятикратное увеличение риска

развития РМЖ у подверженных им лиц,

даже при умеренном семейном риске [3].

Поскольку ни один фактор внешней среды,

оказывающий влияние такого масштаба,

19Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

не был определен для рака груди, кажется

маловероятным, что общая окружающая

среда составляет значительную часть

семейной агрегации. Анализ наследо-

вания может помочь в разъяснении

относительного вклада генетических

факторов и факторов общей окружающей

среды. Исследования наследования с ис-

пользованием близнецового метода проде-

монстрировали, что риск развития РМЖ

для монозиготного близнеца значительно

выше, чем у двуяйцевого близнеца

пострадавшего человека, и подтвердили,

что преобладающим компонентом семейной

агрегации при РМЖ является генетический

компонент, а не факторы образа жизни или

внешней среды [4, 5]. Модели агрегации

болезней у близнецов представляют дока-

зательства не только для генетической

основы РМЖ, но и показывают нерав-

но мерное распределение генетической

предрасположенности, предполагая, что

большая часть генетического риска может

находиться в пределах генетически пред-

рас положенного меньшинства [5].

Анализ наследования (генетического

моделирования) включает в себя моде-

лирование различных сценариев, при

которых болезнь возникает из-за комбина-

ции известных и гипотетических генов

определенного риска, распространенности

и режима наследования. Картины рака,

предсказанные с помощью различных

моделей, сравнивают с обследованной

частотой болезней, и выбирается наиболее

подходящая модель. Анализ наследования

оказал сильное влияние на молекулярные

подходы исследования генетических фак-

торов предрасположенности. Так, дан-

ные исследования «Рак и стероидные

гормоны» и других ранних исследований

насле дования в семьях, больных РМЖ,

позволили выявить предпочтительную

высоко пенетрантную аутосомно-доми-

нант ную генетическую модель [6-9]. Это

предположение было подтверждено путем

анализа сцепления и выявления высоко

пенетрантных аутосомно-доми нантных

генов предрасположенности к РМЖ -

BRCA1 и BRCA2. Последующий комплекс

анализов наследования выявил эффекты

генов BRCA1 и BRCA2 и позволил выявить

доказательства наличия дополни тельных

генов [10-13]. Возможно, результаты наи-

более всеобъемлющих из этих анализов,

основанных на обширной серии, вклю-

чающей как случаи заболевания РМЖ среди

населения, так и семейные случаи, сильно

способствовали развитию полигенной

модели. Полигенный компонент риска

в этой модели эквивалентен нескольким

генетическим факторам, действующим

независимо. Этот компонент является

логарифмически/нормально рас преде лен-

ным, имеет вариации, снижающиеся с воз-

растом, и применим как у носителей, так

и не-носителей мутаций в гене BRCA [10,

11, 14]. Полигенная модель согласуется

с многочисленными наблюдениями, что

большая частота семейного РМЖ встре-

чается во многих семьях, как правило, с

ограниченным числом случаев заболевания,

а не просто в нескольких очень обширных

семьях [11, 12]. Полигенная модель в

зна чительной степени была принята в

качестве объяснения остаточной предрас-

положенности к РМЖ и была подтверждена

частично идентификацией ряда нынешних

полигенов.

Стратегии выявления предраспо-

лагающих факторов к раку молочной

железы

Три основных экспериментальных

дизайна исследований были использованы в

идентификации молекулярных генетических

факторов предрасположенности к РМЖ:

геномный анализ сцепления, скрининг

мутаций в генах-кандидатах, а также

ассоциативные исследования.

Анализ сцепления и позиционное

клонирование

В дополнение к систематическим

эпидемиологическим данным, в опре-

деленных семьях в очень высокой степени

20 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

наблюдаются случаи раннего РМЖ, в

соответствии с наследованием мутаций

высокого риска. Такие множественные

случаи РМЖ в пределах одной семьи дали

толчок к идентификации генов высокого

риска с использованием анализа сцепления

для определения маркеров, которые насле-

дуются сцепленно с заболеванием. Анализ

сцепления используется для карти рования

локуса, связанного с болезнью, через

исследование сцепления геномных марке-

ров с указанным фенотипом болез ней с

использованием образцов ДНК несколь-

ких членов больших семей. Область

генома вокруг сцепленных маркеров затем

допол нительно изучается с целью обнару-

жения причинных генов (позиционное

клонирование). Анализ сцепления подходит

для картиро вания высоко пенетрантных

генов предраспо ложенности к РМЖ, мута-

ции которых приводят к формированию

«раковых» семей, в которых большинство

членов, страдающих заболеванием, несут

мутации. Если ген имеет более низкую

пенетрант ность, корреляция между РМЖ

и мутацией в семьях с наличием мутаций

недостаточна для обнаружения сигнала

сцепления. Значительный сигнал также

трудно обнаружить, если РМЖ сцеплен с

опреде ленным локусом лишь в небольшой

части про анализированных семей.

Карты сцепления и наборы маркеров,

которые в достаточной степени обнаружены

в геноме человека, стали доступны в конце

1980-х годов. Использование больших

родословных семей с РМЖ, геномных

исследований позволили картировать гены

предрасположенности к РМЖ высокой

пенетрантности, предварительно пред ло-

женные анализами наследования, BRCA1

и BRCA2 [15, 16]. Анализы сцепления

также проводятся в группах фенотипически

различных семей для карти рования локусов,

связанных с развитием конкретных основных

синдромов, которые включают повышенный

риск развития РМЖ. Позиционное кло-

нирование, было затем использовано для

выявления причин ных генов, таких как

PTEN, STK11 и CDH1 [17-22].

Исследования по секвенированию

генов: скрининг мутаций в генах-

кандидатах

Во время 1990-х годов понимание

молекулярных механизмов патогенеза

РМЖ выявило возможные гены-кандидаты,

которые предрасполагают к РМЖ. Казалось

биологически правдоподобным, что белки,

взаимодействующие с BRCA1 и BRCA2, или

вовлеченные в процессы репарации ДНК,

могут быть вовлечены в восприимчивость

к РМЖ. Несколько патологических мутаций

было найдено с частотой, позволяющей

оценить их с помощью ассоциативных

иссле дований. Однако в большинстве

изу ченных генов репарации ДНК, вызы-

вающие болезнь мутации (в первую очередь

приводящие к преждевременной остановке

синтеза белка или nonsense мутации,

ведущие к угасанию РНК), встре чались

индивидуально очень редко. Надежная

демонстрация того, что такие гены

предрасполагают к РМЖ, вызвала необхо-

димость мутационного скрининга всей

кодирующей последовательности генов на

большом количестве случаев заболевания

и контроля в целях сравнить общее число

пато генных мутаций. Эксперименты такого

масштаба были опубликованы лишь для

нескольких генов репарации ДНК. Другие

гены, такие как вовлеченные в регуляцию

клеточного цикла, контроль чекпоинткиназ,

апоптоз, метаболизм стероидных гормонов,

на таком уровне были оценены реже.

Ассоциативные исследования

В ассоциативных исследованиях частота

указанного варианта сравнивается между

больными РМЖ и лицами контрольной

группы. Статистически значимые различия

в частоте аллелей между больными и лицами

контрольной группы более демонстративны

для вариантов с частотой в популяции >5%.

Поэтому ассоциативные исследования

наиболее подходят для идентификации

общих вариантов предрасположенности к

РМЖ.