Журнал Биотехнологии. Теория и практика. 1, 2010 г

Подождите немного. Документ загружается.

81Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

1-дәнекер ұлпасынан бөлінген макрофагтар

2-перитонеалдық макрофагтар

3-сурет. егеуқұйрықтың перитонеалдық қуысы

және тері асты шандырларынан бөлініп алынған

ЛПС белсенді макрофагтар іНФ өнімінің

дәрежесі. іНФ концентрациясы әр егеуқұйрық

үшін 9 рет өлшенді. 3 жануардан алынған жалпы

орташа көрсеткіш. * -ауытқу айырмашылығы,

р< 0,05

4-суретте көрсетілгендей егеу құй рық-

тың тері асты шандырларынан бөлініп

алынған LYVE-1+макрофагтары ФИТЦ-

гиалурон қышқылын байланыс ты рып

қа на қоймай, оны қарқынды сіңірді.

Сіңірілген гиалурон қышқылы (→) LYVE-

1+макрофагтарының фагоцитарлық вакуо-

лінде аккумуляцияланды. LYVE-1 экспрес-

сияламаған қарсы жасушалар гиалурон

қышқылын сіңіруге қабілетті болған жоқ.

LYVE-1 гиалурон қышқылының

басты рецепторы екені белгілі [1, 2]. Бірақ

оның биологиялық қызметі толығымен

зерттелмеген [15]. LYVE-1-дің гиалурон

қышқылы транспортына қатысатынына

болжам жасалды [16]. Гиалурон қышқылы

дәнекер ұлпасының сыртқы жасуша

мат риксінің негізгі молекуласы болып

табылады [17].

ФИТЦ-

гиалурона

LYVE-1

LYVE-1 +

гиалуронан

4-сурет. LYVE-1+макрофагтары гиалурон қышқылын қарқынды сіңіруде. (→) Макрофаг

мембранасында қарқынды түрде экспрессияланған LYVE-1 рецепторы

Гиалурон қышқылының гомеостазын

ұстап тұру әртүрлі ұлпалық қабынудан

сақтау үшін өте маңызды. Гиалурон

қышқылы әдетте деградацияға ұшырайды

және бауырда толығымен ыдырайтын оның

гиалурондық олигосахаридтері лимфалық

система арқылы қанға рециркуляцияланады

[18]. Бұл жұмыста зерттелген LYVE-

1+ макрофагтар гиалурон қышқылын

сіңіру және байланыстыруда жоғары

белсенділік көрсетті. Олар гиалурон

қышқылының қалдығын және лимфалық

қан тамырларынан айырылған тері асты

шандырындағы ұлпа ішілік молекулаларын

жоятын қоқыс жинау жасушасы қызметін

атқаруы мүмкін. LYVE-1+ макрофагтары

гиалурон қышқылының гомеостазын сақ-

тауда басты қызмет атқаратыны анық.

Алынған нәтижелер LYVE-1+ макро фаг-

тарды лимфалық тамырлар мен капилляр

ұлпаларында тапқан басқа зерттеушілер

мәліметтерімен сәйкес келді. LYVE-1 адам

қағанағы хорионы бүрлерінің, сонымен

қатар тышқан және адам көзінің қасаң және

тамырлы қабығының макрофагтарымен

экспрессияланатыны көптеген ғалымдар

арқылы баяндалған. LYVE-1+ макрофаг-

тары қабыну процесі кезінде жаңа

лимфалық тамырлар мен капиллярлар

пайда болуына қатысуы мүмкін [8, 17].

82 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Қабыну процесі кезінде LYVE-1+ CD11b+

F4/80+ макрофагтар лимфангиогенезде

маңызды рөл атқаратыны және көздің

қасаң қабығының қабыну процестеріне

қатысатыны баяндалған. Қабыну кезінде

макрофагтар VEGF-A жолына қатыстыры-

луы мүмкін және ұлпалық қабыну

аймақтарына VEGF-С, VEGF-D лимфалық

тамырлардың өсу факторын көп мөлшерде

өндіру үшін қайта бағдарлануы және

лимфалық эндотелиалдық жасушалардың

шоғырланып өсуін индуцирлеуі мүмкін

[18]. LYVE-1+ макрофагтар лимфалық

тамырларға интеграциялануы және жасу-

шалық агрегаттарды қалпына келтіруі

мүмкін [8]. Оған қарамастан, біздің зерт теу-

імізде LYVE-1+ макрофагтардың VEGF-С,

ангиопоэтин, плейротропин және VEGFR3

сияқты өсу факторларын өндіре алатын-

дығы зерттелмеді. Бірақ біз қалыпты

физиологиялық жағдайда егеуқұйрықтың

тері асты шандырынан бөлініп алынған

LYVE-1+ макрофагтардың ұлпалық қабыну

және зақымдануға жауап ретінде, жаңа

лимфалық тамырлардың тез өсуінің көзі

ретінде табылатынын болжаймыз.

Жақында бірінші тип диабетімен

ауыратын тышқандарда трофикалық жара -

ның жазылуы кезінде LYVE-1+ макро-

фагтарының рөлі бар екені көрсе тілген

[20]. Бұл жұмыстың авторлары диабет-

пен ауыратын db/ db гомозиготалы тыш-

қандарда емес, тышқанның гетеро зиго-

талы жабайы типінде (+/db) макро фагтар

лимфалық тамырлардың өсуіне қатыса-

тынын көрсеткен. Диабетпен ауыратын

гомозиготалы тышқандардан бөлініп

алынған макрофагтарда ІНФ-альфа,

интерлейкин-1β сияқты қабыну цитокиндері

төмен деңгейде секрецияланды. Сонымен

қатар бұл диабетпен ауыратын тышқандарда

LYVE-1+ макрофагтарының санының

төмендегені байқалды, ол диабет кезінде

жараның дұрыс жазылмауына әкеліп

соқтырған гранулярлық ұлпадағы лимфалық

құрылымның пайда болуының төмендеуіне

себеп болған. Бірақ интерлейкин-1β экзо-

гендік белсенділігінен кейін LYVE-1+

макрофагтарының саны қалпына келді

және жараның және трофикалық жараның

тез жазылуына әкелді [19]. Сол себептен

егеуқұйрықтың тері асты шандырынан

бөлініп алынған LYVE-1+ макрофагтар

гиалурон қышқылының гомеостазына

ғана емес, әртүрлі қабыну процесі кезінде

лимфалық тамырлардың пайда болуына,

патология кезіндегі жаралардың жазылуына

қатысады деп болжаймыз. LYVE-1+ макро-

фагтарының биологиялық рөлін зерттеу

трофикалық және ұзақ жазылмайтын

жараларды емдеу үшін жаңа терапиялық

әдістемелерді табуға мүмкіндік береді деп

ойлаймыз.Осы ұсынылған мәліметтерді

дәлелдеу үшін келешекте біз қосымша

зерттеулерді өткізуді жоспарлап отырмыз.

Әдебиеттер

1. Banerji S, Ni J, Wang S-X, et al. 1999. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a

lymph-specic receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144:789–801.

2. Prevo R, Banerji S, Ferguson D, Jackson DG. 2001. Mouse LYVE-1 is an endocytic receptor for

hyaluronan in lymphatic endothelium. J Biol Chem. 276:19,420–19,430.

3. Beasley NJP, Prevo R, Banerji S, et al. 2002. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node

metastasis in head and neck cancer. Cancer Res. 62:1315–1320.

4. Carreira CM, Nasser SM, di Tomaso E, et al. 2001. LYVE-1 is not restricted to the lymph vessels:

expression in normal liver blood sinusoids and down-regulation in human liver cancer and cirrhosis.

Cancer Res. 61:8079–8084.

5. Grant AJ, Goddard S, Ahmed-Choudhury J, et al. 2002. Hepatic expression of secondary lymphoid

chemokine (CCL21) promotes the development of portal-associated lymphoid tissue in chronic

inammatory liver disease. Am J Pathol. 160:1445–1455.

6. Nonaka H, Tanaka M, Suzuki K, Miyajima A. 2007. Development of murine hepatic sinusoidal

endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Dev Dyn. 236:2258–2267.

83Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

7. Cursiefen, C., et al. 2004. VEGF-A stimulates lymphangiogenesis and hemangiogenesis in

inammatory neovascularization via macrophage recruitment. J. Clin. Invest. 113:1040–1050.

8. Maruyama K, Ii M, Cursiefen C, et al. 2005. Inammation-induced lymphagiogenesis in the cornea

arises from CD11b-positive macrophages, J Clin Invest. 115: 2363-2372.

9. Schledzewski K, et. al. 2006. Lymphatic endothelium-specic hyaluronan receptor LYVE-

1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+macrophages in malignant tumours and wound

healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro:implications for the assessment of

lymphangiogenesis; J Pathol. 209: 67–77.

10. Heping Xu, Mei Chen, Delyth M. Reid, and John V. Forrester. 2007. LYVE-1–Positive Macrophages

Are Present in Normal Murine Eyes. 48:2162-2171.

11. Bockle BC, Solder E, Kind S, Romani N, Sepp N.T. 2008, DC-SIGN+CD163+macrophages

expressing hyaluronan receptor LYVE-1 are located within chorion of the placenta. Placenta. 29:187-

192.

12. Schroedl F, Brehmer A, Neuhuber WL, Kruse FE, May CA, Cursiefen C. 2008. The normal human

choroids is endowed with a signicant number of lymphatic vessel endothelial hyaluronate receptor

1(LYVE-1)-positive macrophages. IVOS.49(12):5222-9.

13. Ogay V, Soh K.S. 2008. Expression of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 on

macrophages in rat subcutaneous connective tissue. FASEB J. 22:1198,6.

14. Rosental GJ, Corsini E. 1995. Tumor necrosis factor-α in immunotoxicity assessment. Methods in

Immunotoxicology. 327-343.

15. Jackson DG. 2003. The lymphatic revisited: new perspectives from the hyaluronan receptor LYVE-1.

Trends Cardiovasc Med. 13:1-7.

16. Tripathi RC, Tripathi BJ. 1982. Human trabecular endothelium, corneal endothelium, keratocytes, and

scleral broblasts in primary cell culture: a comparative study of growth characteristics, morphology,

and phagocytic activity by light and scanning electron microscopy. Exp Eye Res. 35:611–624.

17. Laurent TC, Fraser JR.1992. Hyaluronan. FASEB J. 6:2397–2404.

18. Reed RK, Laurent UB. 1992. Turnover of hyaluronan in the microcirculation. Am Rev Respir Dis.

146:S37–S39.

19. Maruyama K, Asai J, Li M, Thorne T, Losordo DW, D’ Amore PA. 2007. Decreased macrophage

number and activation lead to reduced lymphatic vessel formation and contribute to impaired diabetic

wound healing. Am J Pathol. 170:1178-1191.`

Резюме

В данной работе изучали функциональную активность LYVE-1+макрофагов, выделенных

из подкожной фасции крыс. Для определения функциональной активности мы использовали

иммунофлуоресцентный анализ и цитотоксический тест для определения ФНО-альфа. Было

обнаружено, что LYVE-1+макрофаги способны связывать гиалуроновую кислоту и активно ее

поглощать. Кроме того, было показано, что ФНО продуцирующая активность LYVE-1+макрофагов,

была значительно выше по сравнению с перитонеальными макрофагами крыс. Таким образом,

основываясь на наших и литературных данных, мы предполагаем, что LYVE-1+макрофаги могут

участвовать в гомеостазе метаболизма гиалуроновой кислоты в подкожной фасции, которая

лишена лимфатических сосудов.

Summary

In this work the function of activity of LYVE-1+macrophages isolated from the normal subcutaneous

fascia of rats was studied. To test the function activity we used immunouorescent analysis and cytotoxic

assay for TNF-α detection. It was observed that LYVE-1+macrophages are able to bind and actively

uptake hyaluronic acid.

Moreover, it was shown that TNF-α production activity of LYVE-1+macrophages was signicantly

higher in comparison with peritoneal macrophages of rats. Thus based on our and literature data we

suggest that LYVE-1+macrophages may participate in homeostasis of hyualuronic acid metabolism in

subcutaneous fascia that is devoid of lymphatic vessels.

84 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

УДК 606:57.063.8:577.15:061.62(574):579

ХараКтериСтиКа иЗОЛятОВ и КОЛЛеКЦиОННыХ ШтаММОВ БаЦиЛЛ,

ОБЛаДаЮЩиХ ЛиПОЛитичеСКОй, ПрОтеОЛитичеСКОй и ЛиПаЗНОй

аКтиВНОСтьЮ

З.С. Сармурзина, С.С. Ануарбекова, К.Х. Алмагамбетов

ДГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» РГП «НЦБ РК» КН МОН РК, г. Астана

Бациллы являются одними из активных продуцентов биологически активных веществ, в том

числе ферментов. Нами были выделены бациллярные микроорганизмы из различных экологических

ниш. Выделенные изоляты бацилл отнесены к различным видам Bacillus sp. Проведен скрининг по

протеолитической, липолитической и липазной активности среди изолятов и коллекционных штаммов

бацилл Республиканской коллекции микроорганизмов. Отобраны 48 наиболее активных изолятов и 11

штаммов культур бацилл.

Введение

Аэробные спорообразующие бакте-

рии составляют довольно обшир ную

группу микро организмов. Они широко

распространены в природе и играют

большую роль в разнообраз ных биоло-

гических процессах. С использо ванием

этих бактерий в промыш ленности освоено

производство ценных ферментов: липазы

[1-3], протеазы [4], амилазы, глюкоизо-

меразы, пептидогидролазы, расщеп ляющие

полисахариды, белки, жиры и другие

макромолекулы; которые легко выделяются,

растут на дешевых средах с выходом

большой биомассы [5, 6].

Целью данного исследования было

выделение культур бацилл, обладающих

протеолитической, липолитической и ли-

пазной активностью.

Материалы и методы

Объектами исследования были 172

изолята микроорганизмов, выделенные из

различных экологических ниш и 32 штамма

культур бацилл РКМ.

Выделение культур бацилл [7] из

природных источников осуществляли по

общепринятым методам с соблюдением

правил асептики. Посев производили по

методу Гоулда на мясопептонный агар

(МПА), сусло-агар, среду Громыко. Чашки

инкубировали при 29°С и 37°С. Через 3-5

суток инкубации проводили отбор колоний

с характерными признаками для бацилл.

родовую и видовую принадлежность

выделенных изолятов определяли по обще-

принятым в бактериологической прак тике

методам [8-15].

Определение протеолитической ак-

тивности проводили, используя в качестве

субстрата казеин и желатин [8].

Для выявления липолитической ак-

тивности по отношению к твинам [8]

исследуемые микроорганизмы высевают

на среды, содержащие твины 20, 60, 80

(лауриловая, стеариновая и олеиновая

жирные кислоты соответственно).

Качественное определение липо-

литической активности по отношению

к органическим жирам проводят [16],

используя бараний, говяжий, свиной жиры

и растительное масло.

Готовят жир нужного типа, окрашенный

нильским голубым сернокислым. Добав-

ляют 1 мл эмульсии в 20 мл агара, рас-

плавленного и охлажденного до 45-50ºС.

85Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Смесь хорошо перемешивают и разливают

в чашки. Положительная реакция –

образование синего ореола вокруг колоний.

Определение липазной активности

Активность липазы определяют [8]

титрованием щелочью свободных жирных

кислот, образующихся из оливкового

масла в результате действия фермента.

Реакционную смесь, содержащую 0,5 мл

оливкового масла, 5 мл ацетатного буфера

(рН 5,6) [17], 10 мМ CaCl

и 50-100 мкл

раствора фермента, инкубируют при 30°С

в течение 30 мин на магнитной мешалке.

Реакцию останавливают добавлением 20

мл этанола. Количество образовавшихся

жирных кислот определяют титрованием

0,1 н. КОН с индикатором фенолфталеином.

Контролем служит проба с прокипяченным

раствором фермента. Результаты титро-

вания контроля вычитают из данных

опытных проб. Активность липазы выра-

жают в миллилитрах 0,1 н. КОН. За еди-

ницу липазной активности принимают

количество 0,1 н. щелочи, пошедшей на

титрование 1 мкмоля жирных кислот,

образующихся за 1 мин.

результаты и обсуждение

В ходе исследовательской работы было

изучено 172 изолята бацилл, выделенные

из различных источников окружающей

среды: почва, зерновые отходы, мука, хлеб,

сточные воды мясокомбината, кана ли-

зационные трубы, речная вода, экстракты

цветов календулы и осота полевого,

различные сорта винограда, кисломо-

лочные продукты домашнего изготов-

ления. Также в работе были изучены 32

штамма культур бацилл, находящихся на

хранении в Республиканской коллекции

микроорганизмов (РКМ), представленные

следующими видами: B. subtilis, B.

thuringien sis, B. licheniformis, B. polymyxa, B.

acido coldarius, B. rmus.

Родовая принадлежность выделенных

изолятов бацилл к роду Bacillus определяли

по морфо-культуральным признакам.

При определении протеолитической

активности на молочном агаре наибольшей

активностью обладают выделенные изо-

ляты Bacillus sp. Zb 11, Zb 23, Zb 32, Zb

52 (диаметр зон лизиса 10-15 мм). Среди

коллекционных культур бацилл штаммы

B. subtilis ИПМ-215, B. polymyxa 1459-

B и B. subtilis 65 обладают наибольшей

активностью (диаметр зон лизиса 9-10

мм), что продемонстрировано на рисунке

1. Штаммы B. thuringiensis Z-52, B.

thuringiensis BТS-393, B. thuringiensis 4-Cr

06, B. subtilis АТСС-6633, B. subtilis 82,

B. subtilis 168, B. acidocoldarius БТ-90,

B. thuringiensis 49, B. subtilis НИ-1 менее

активны (5-7 мм).

Рис. 1. Гидролиз казеина коллекционными

штаммами бацилл

При определении протеолитической

активности на желатине разжижжение

желатины отмечалось только у коллек-

ционных штаммов культур бацилл: B.

subtilis 65, B. thuringiensis Z-52 v-3, B.

thuringiensis BТS-393, B. subtilis ИПМ-

215, B. thuringiensis kurstaki к-Ym 07/КБ, B.

thuringiensis 4-Cr 06.

При определении липолитической ак-

тивности по отношению к твинам жир ных

кислот среди выделенных изолятов Bacillus

sp. Zb 17, Zb 45, Zb 80, Zb 22, Zb 3, Zb 60,

Zb 28, Zb 32, G13, G26 и G27 обладали

наибольшей активностью (диаметр непроз-

рачной зоны 10-12 мм). Изоляты Bacillus sp.

G12, G22, G23, G24, G25 (рис. 2) обладали

данной активностью по отношению ко

всем исследуемым твинам лауриловой,

86 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

стеариновой и олеиновой жирных кислот,

где данная активность варьирует в пределах

3-6 мм.

Рис. 2. Липолитическая активность изолятов

на среде с твином 20

У остальных выделенных изолятов

липолитическая активность составляла в

пределах 3-9 мм. Среди коллекционных

культур микроорганизмов у штаммов B.

subtilis АТСС-6633, B. subtilis 720 и B.

subtilis 1-304/pMX 45 наблюдается самая

высокая липолитическая активность, что

соответствует диаметру непрозрачной зоны

13-20 мм.

При изучении липолитической актив-

ности по отношению к органическим

жирам Bacillus sp. Zb 60, Zb 82, Zb 30, Zb

105, Zb 66, Zb 68, Zb 31, G13, G15, G17, G22,

G23, G24, G25 проявили активность ко всем

исследуемым жирам: бараний, говяжий,

свиной, растительное масло (рисунок 3).

Рис. 3. Липолитическая активность изолятов

на среде с говяжьим жиром

Среди коллекционных культур штам-

мы B. thuringiensis B12C, B. subtilis 30,

B.thuringiensis BТS-393, B. thuringiensis

Z-52, B. thuringiensis Z-52 v-3, B. subtilis PR

28, B. polymyxa DH, B. thuringiensis A1, B.

thuringiensis Z-52 v-3, B. thuringiensis BТS-

393 обладали липолитической активностью

на средах, содержащих бараний, говяжий и

свиной жиры.

При изучении липазной активности

контрольная проба с прокипяченным

раствором фермента составляла 1,3 ЕД.

Липазная активность варьировала в

пределах 1,5-5,0 ЕД. Среди выделенных

изолятов высокая липазная активность

наблюдается у изолятов G13, G15, G17,

G22, G23, G24, G25 (активность липазы

составила 4,0-5,0 ЕД). Изоляты G2, G6,

G5, G8, G12, G29 менее активны (липазная

активность наблюдалась в пределах 1,6-

1,9 ЕД). У остальных изолятов активность

липазы составила 2,0-3,1 ЕД. Среди

коллекционных культур микроорганизмов

высокая липазная активность наблюдается

у B. subtilis 720, B.subtilis ATCC-6633, B.

subtilis 1-304/рmx 45 (содержание липазы в

количестве 3,0-4,4 ЕД).

Итак, основная масса изолятов и

коллекционных штаммов бацилл являются

ферментоактивными по отношению к

изученным нами субстратам.

На основании данного исследования

для дальнейшей работы было отобрано

48 наиболее активных изолятов бацилл.

У них были изучены культуральные,

морфологические и биохимические свой-

ства для оценки видовой принадлежности.

Изучаемые нами объекты грампо-

ложительные, подвижные палочковидные

бактерии, с округлыми концами, распо-

лагаются одиночно, в виде цепочек или

скоплениями. Образуют эллипсовидные или

сферические эндоспоры, расположенные

центрально или терминально.

На исследуемых твердых питательных

средах выделенные бациллы образуют

выпуклые или плоские, блестящие колонии

от беловато-серого до коричневого цвета,

слегка с приподнятой складчатостью, пра-

87Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

вильной круглой формы, края колоний

ровные. Размеры варьируют от точечных

до гигантских (2-10 мм), однородной

структуры.

Все исследуемые изоляты каталазо-

положительны. Изоляты Bacillus sp. Zb 3,

Zb 9, Zb 13, Zb 17, Zb 22, Zb 31, Zb 32, Zb

70, G6, G8, G17 – оксидазоотрицательны,

остальные оксидазоположительны. Глюкозу

усваивают все исследуемые изоляты, за

исключением Bacillus sp. G 2, G 4, G 9, G 20,

26, G 28. Оптимальная температура роста

37-40°С.

Реакция на фенилаланин и тирозин –

отрицательная, желатину не разжижают,

редукция нитратов, дезаминирование фе-

нилаланина не наблюдается. Не обладают

лецитиназной и плазмокоагулазной актив-

ностью. Индол не образуют. Признаки

ферментации фруктозы, ксилозы, маннозы,

сахарозы, дульцита, сорбитола, мальтозы,

лактозы, маннита были вариабельны для

всех изолятов.

На основании полученных результатов

проведен анализ: 17 выделенных изолятов

отнесены к виду Bacillus subtilis, 7 изолятов

– к виду Bacillus licheniformis, 5 изолятов

– к виду Bacillus pumilus. 19 выделенных

изолятов определены как виды с неясным

систематическим положением.

Выводы

В ходе выполнения работы нами было

получено 172 изолята бацилл, выделенные

из различных экологических ниш.

Изучены протеолитическая актив ность,

липолитическая активность по отношению

к твинам, липолитическая активность

по отношению к органическим жирам,

липазная активность, определена родовая

и видовая принадлежность на основе

изучения культурально-морфологических и

физиолого-биохимических свойств.

При изучении протеолитической, ли-

по литической активности и липазной ак-

тивности нами отобраны самые активные

изоляты: Bacillus sp. Zb 17, Zb 45, Zb 80, Zb 22,

Zb 3, Zb 60, Zb 28, Zb 32, Zb 60, Zb 82, Zb 30, Zb

105, Zb 66, Zb 68, Zb 31, G13, G15, G17, G22,

G23, G24, G25. Среди коллекционных культур

микроорганизмов также отобраны штаммы,

обладающие высо кой ферментативной

активностью: B. polymyxa DH, B. thuringiensis

A1, B. subtilis 1-304/pMX 45, B. subtilis АТСС-

6633, B. subtilis 720, B. thuringiensis B12C,

B. subtilis 30, B. thuringiensis BТS-393, B.

thuringiensis Z-52, B. thuringiensis Z-52 v-3, B.

subtilis PR 28.

Таким образом, среди изученных нами

объектов, как выделенных изолятов, так и

коллекционных штаммов РКМ, отобраны

ферментативноактивные культуры. Полу-

ченные результаты и выявленные в ходе

исследования активные объекты: 48 вы-

деленных изолятов и 11 коллекционных

штаммов будут рекомендованы для ис-

пользования в различных сферах науки и

биотехнологической промышленности.

Литература

1. Основные систематические группы бактерий и актиномицетов. Интернет-ресурсы: http://plant.

geoman.ru «Жизнь растений».

2. Heravi K.M., Eftechar F., Yakhchali B., Tabandeh F. Isolation and identication of a lipase producing

Bacillus sp. from soil // Pakistan Journal of Biological Siences. – 2008. - Vol. 11 (5), P. 740-745.

3. Mohan T.S., Palavesam A., Immanvel G. Isolation and characterization of lipase-producing Bacillus

strains from oil mill waste // African journal of biotechnology. - 2008. - Vol. 7 (15), P. 2728-2735.

4. Африкян Э.Г. Аэробные спорообразующие бактерии и их энтомопатогенные свойства:

Автореф. ... докт. биол. наук: 03.00.07. / МГУ. – М., 1970. – 38 с.

5. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М.

Клунова, Е.А. Живухина. – 3-е изд. стер. – М.: Академия, 2006. – С. 73-74.

88 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

6. Патент России (11) 2298032 (13) C2. Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719-продуцент

антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а

также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов / Михайлова Н.А.,

Гатауллин А.Г., опубл. 27.04.2007. – 3 с.

7. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии / Под ред. В.К.

Шильниковой. – 5-е изд., перераб. и доп. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.

8. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / Под ред. А.И.

Нетрусова. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

9. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под редакцией Н.С. Егорова. – М.:

Издательство Московского университета, 1985. - С. 122-128.

10. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. - М.: Мир, 1997.

– В 2 томах. – 800 с.

11. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. Методические рекомендации по выделению и

идентификации бактерий группы B. subtilis-mesentericus из организма. – 150 с.

12. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактериальной группы B.

subtilis-mesentericus из организма человека и животных // Под ред. В.В. Смирнова. – Киев:

Наукова думка, 1982. - С. 3-25.

13. Желдакова Р.А. Выделение и идентификация микроорганизмов: Учебно-методическое пособие

для студентов G 310101 «Биология» специализация - G 310101 – 0206 «Микробиология». -

Минск, 2003. – 20 с.

14. Борисова А.Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. - М.: Медицина,

1979. – С. 58.

15. Бабаева Т.А. Морфолого-культуральные и физиологические свойства спорообразующих

бактерий // Уч. зап. Азерб. ун-та. Серия биол. наук – 1973. - №4. – С. 22-28.

16. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии. - М.: Мир, 1984. - В 3-х т. - Т.3, 261 с.

17. ГОСТ 9.801 - 82 Государственный стандарт Союза ССР Единая система защиты от коррозии и

старения БУМАГА Методы определения грибостойкости Unied system of corrosion and ageing

protection. Paper. Test methods by fungus resistance.

Түйін

Бацилаллар биологиялық белсенді заттардың сонымен қатар ферменттердің белсенді

продуценттерінің бірі болып табылады. Біз түрлі экология бөліктерінен бацелярлы микроағзалар

бөліп алдық. Бөлініп алынған бацилла изоляттары Bacilla sp. әр қилы түріне жатқызылды.

Республикалық микроағзалар коллекциясындағы коллекциялық штаммдар мен изоляттар ішінде

протеолиздік, липолиздік және липазалық белсенділіктері бойынша скрининг жүргізілді. Бацилла

дақылдарының ең белсенді 48 изоляттары және 11 штаммдары таңдалып алынды.

Summary

Bacilli are one of the active producing biological substances, including ferments. We isolated

bacilli microorganisms from different ecological niches. These microorganisms relate to various species

Bacillus sp. We have screened analyses of proteolytical, lipolytical and lipase activity among isolates and

cultural bacilli of Republic collection of microorganisms. 48 of the most active isolates and 11 of cultural

bacilli were selected.

89Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

УДК 665.652.86-047.37:573.6

иЗУчеНие жиЗНеСПОСОБНОСти и НеФтеОКиСЛяЮЩей

аКтиВНОСти КЛетОК УГЛеВОДОрОДОКиСЛяЮЩиХ

МиКрООрГаНиЗМОВ иММОБиЛиЗОВаННыХ На ПрирОДНыХ СОрБеНтаХ

А.У. Туякбаева,

А.У. Чукпарова,

А.К. Саданов

РГП «НЦБ РК» КН МОН РК, г. Астана

РГП «ЦБИ» КН МОН РК, г. Алматы

В работе приведены результаты исследования жизнеспособности и нефтеокисляющей активности клеток

микроорганизмов родов Bacillus, Micrococcus и Rhodococcus, иммобилизованных на природные сорбенты

при хранении их в стерильных условиях и комнатной температуре 26°С в течение пяти месяцев. Отмечено,

что в этих условиях штаммы микроорганизмов, иммобилизованные на керамзит, лучше сохраняют свою

жизнеспособность и углеводородокисляющую активность. Наилучшие показатели по жизнеспособности и

деструкции нефти показали штаммы микроорганизмов Rhodococcus ruber Кл4 и Rhodococcus erythropolis

Кл1, иммобилизованные как на цеолите, так и на керамзите.

Ключевые слова: иммобилизация, углеводородокисляющие микроорганизмы, жизнеспособность клеток,

керамзит, цеолит.

Введение

В настоящее время применение био-

препаратов, содержащих микроорга низмы-

нефтедеструкторы, является наи более

пер спективным и экологически чистым

способом ликвидации нефте загряз нений

окру жающей среды [1, 2].

Использование нативной биомассы

микроорганизмов-нефтедеструкторов или

их суспензий ограничено сроком хра нения,

составляющим, как правило, один месяц.

При длительном хранении в суспензии

неизбежно происходит снижение чис-

ленности микроорганизмов и, как правило,

их нефтеокисляющей активности [3].

Метод адсорбционной иммобилизации

клеток микроорганизмов широко ис-

пользуется в микробиологической био-

технологии. Для иммобилизации клеток

микроорганизмов используют различные

адсорбенты: почву, керамзит, песок, цеолит,

бентонит, уголь, хлопчатобумажные ткани,

волокна, кристаллы и др. [4]. Хорошо

известно защитное действие сорбентов

по отношению к иммобилизованным

клеткам, при этом иммобилизованные

микроорганизмы характеризуются повы-

шенной жизнеспособностью, устойчи-

востью к действию неблагоприятных

факторов внешней среды и высокой

нефтеокисляющей активностью, которая во

многих случаях возрастает в несколько раз

по сравнению со свободными клетками [5].

Карпухина Л.В. с соавторами [6] сооб-

щает, что иммобилизованные на верми-

кулите клетки Azospirillum brasilense 7,

не только оставались жизнеспособными

при хранении 37 суток, но и проявляли

азотфиксирующую активность, в то время

как свободные клетки, находившиеся в

тех же условиях, погибли. Таким обра-

зом, иммобилизация на носителе помогает

микробным клеткам сохранить жизне-

способность, активность и защищает их

от воздействия неблагоприятных внеш-

них условий [7, 8]. В последнее время в

литературе [5, 7] встречаются данные по

при менению для иммо билизации бакте-

рий природных сорбентов, таких как

цеолит и керамзит. Преимущества их при-

ме нения следующие: доступность и деше-

визна, пригодность в качестве источ ника

минерального питания для бактерий и

высокая сорбционная способ ность вслед-

ствие особого строения кристал лов. Осо-

90 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

бенностью структуры цеолитов является

их пористое внутреннее строение, тогда

как керамзит представляет собой по

вещественному составу и микро структуре

глину и относится к группе вспучи ваю-

щихся при добавлении к сырью органи-

ческих добавок. Целью проведенной

рабо ты являлось изучение сохранения

жизне спо собности и угле водоро до кисляю-

щей активности при длительном хранении

в сте рильных условиях и при комнат ной

температуре 26°С штаммов микро орга низ-

мов родов Bacillus, Micrococcus и Rhodo-

coccus, иммобили зован ных на керам зит и

цеолит.

Материалы и методы исследования

В работе использованы 6 штаммов

микро организмов-нефтедеструкторов Bacil-

lus rmus S20, Bacillus subtilis PR28, Micro-

coccus varians PR69, Micrococcus roseus

УД6-4, Rhodococcus erythropolis Кл1 и

Rhodococcus ruber Кл4.

В качестве природных сорбентов ис-

пользовали цеолит Чанканайского место-

рождения (г. Талды-Корган, Алма тинская

область) и керамзит в виде прессованного

гравия с месторождения Мукры–2 (Алма-

тинская область, Коксуский район).

В качестве единственного источ ни-

ка углерода использовали нефть с место-

рождения Каражанбас, имеющую удельный

вес - 0,97 г/см

плотность при 20°С

- 0,949

г/см

. Содержание парафинов - 71,0%;

нафтенов - 15,1%; серы - 1,68%; смолы -

21,6%; асфальтенов - 5,3%. Нефть высоко-

вязкая, высокосернистая.

Сорбционную способность носи телей

по отношению к клеткам углево дородо-

кисляющих микроорганизмов опреде ляли

методом Г.Н. Никовской и др. [9]. Опреде-

ление числа иммобилизованных клеток

проводилось по оптической плотности на

фотоколориметре КФК-56 в стандартных

кюветах, при длине волны 670 нм.

Иммобилизованные на носитель мик-

робные клетки хранили в стерильных

колбах Эрленмейэра, закрытыми ватно-

марлевой пробкой, при комнатной темпе-

ратуре 26°С в течение пяти месяцев.

Жизнеспособность иммоби лизо ванных

клеток микроорганизмов опреде ляли по

истечении 1, 2, 3 и 5 месяцев хранения,

путем посева на поверхность плотной

питательной среды, с последующей инку-

бацией при температуре 28-30°С. Подсчет

жизнеспособных микробных клеток про-

водили по истечении 7 суток.

Для определения нефтеокисляющей

активности иммобилизованные на носитель

углеводородокисляющие микроорганизмы

помещали в жидкую минеральную среду

Ворошиловой-Диановой с добавлением 5%

сырой нефти с месторождения Каражанбас.

Контролем служила минеральная среда

Ворошиловой-Диановой с нефтью без вне-

сения углеводородокисляющих микро ор-

ганизмов. Культивирование проводили в

течение 14 суток при комнатной темпе-

ратуре 26°С на шейкере Biosan PSU-20

(Латвия, 2003) при 180 об./мин.

Остаточное содержание нефти опре де-

ляли гравиметрическим методом [10].

Статистическую обработку полу чен-

ных данных проводили с помощью пакета

прикладных программ Excel, на персо-

нальном компьютере «Pentium-IV».

результаты исследований и их

обсуждение

В работе изучена жизнеспособность

и нефтеокисляющая активность иммоби-

лизованных на керамзит и цеолит клеток

углеводородокисляющих микроорганизмов

хранившихся в течение пяти месяцев.

Исходный титр иммобилизованных на

керамзит и цеолит клеток микроорганизмов

составлял 10

– 10

кл/мл.

Динамика численности жизнеспо соб-

ных иммобилизованных клеток микро-

организмов-нефтедеструкторов пред став-

лена в таблицах 1 и 2.