Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

и ДКГК (3) в клеточном соке (а) и структурных элементах (б) листьев ячменя

- АК - ДАК - ДКГК

Рис. 15. Содержание АК, ДАК и ДКГК в целых листьях ячменя (1), хлоропластах (2)

и митохондриях (3) после 40 часов пребывания в темноте (а) и последующего

24-часового освещения (б) (интенсивность света - 33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

)

В следующей серии опытов проводился одновременный анализ АК, ДАК и

ДКГК в целых листьях, хлоропластах и митохондриях, выделенных из растений,

находящихся в различных условиях освещения (рис. 15), с тем, чтобы

исследовать способность к биосинтезу АК данных клеточных структур,

входящих в состав анализируемой нами фракции "структурные элементы".

Из представленных данных видно, что в

одном грамме хлоропластов,

выделенных из листьев проростков ячменя, находящихся 40 часов в темноте,

содержится больше восстановленной АК, чем в грамме целых листьев, а в

митохондриях - меньше.

Последующее освещение растений, длительное время находившихся в

темноте, увеличило содержание аскорбата в целых листьях и существенным

образом повлияло на распределение АК в структурах: в хлоропластах

уровень

кислоты понизился, а в митохондриях увеличился в 3 раза. Таким образом,

показано светозависимое накопление АК в беспигментных структурах -

митохондриях. Что касается окисленной формы АК, то в структурах, выделенных из

темновых листьев, она практически отсутствовала; ДКГК, напротив,

накапливалась в больших количествах. Эти данные дают возможность

представить направленность обмена исследуемых кислот: в темноте

хлоропластах и митохондриях идет необратимое окисление ДАК до ДКГК.

При освещении в хлоропластах появляется ДАК, а в митохондриях ее

количество увеличивается с 5,3 мкг/г до 33,3 мкг/г. Следовательно, на свету

начинается использование АК с образованием окисленной формы. Последняя в

митохондриях в больших размерах необратимо окисляется до ДКГК, а в

хлоропластах этот процесс идет не так активно, вероятно, за счет того, что часть

ДАК подвергается фотовосстановлению до АК [286].

Способность хлоропластов синтезировать АК в зависимости от освещения

исследовалась и в опытах с изолированными хлоропластами. Последние

выделялись из листьев 7-9-дневного ячменя, находившегося 40 часов без

освещения. В хлоропластах определялся уровень АК, ДАК и ДКГК

, затем часть

их освещалась 2 часа в склянках Тищенко при постоянном продувании через

среду выделения (0,4 М сахароза, 1/15 М фосфатный буфер, 0,01 N NaCl)

воздуха со скоростью 1 л/мин; другая часть находилась в аналогичных условиях

в темноте (табл. 18). За два часа освещения в изолированных хлоропластах

уровень АК увеличился в 4 раза, и только в этом варианте

была обнаружена

ДАК. Количество ДКГК, напротив, в освещенных хлоропластах было ниже, чем

у неосвещенных. Из анализируемых кислот в среде выделения накапливалась

только ДКГК, причем в значительном количестве, не уступающем ее

содержанию в изолированных хлоропластах и хлоропластах целого листа.

По всей видимости, при инкубации изолированных хлоропластов АК,

активно синтезируемая в них, выделяется

в среду. В темноте она разрушается до

ДКГК, на свету этот процесс тормозится, поэтому в среде выделения

обнаруживается ДАК - промежуточный продукт окисления АК до ДКГК.

Таблица 18

Влияние света на накопление АК, ДАК и ДКГК изолированными хлоропластами

листьев ячменя (интенсивность света 15,7 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

; экспозиция 2 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

мкг/г t мкг/г мкг/г t

Хлоропласты листьев ячменя,

находящегося 40 часов в темноте -

(а)

210,2

233,9

+ 2 часа темноты:

изолированные хлоропласты (б)

среда выделения (в)

278,2

= 161,

266,9

225,4

= 082,

= 104,

+ 2 часа света:

изолированные хлоропласты (г)

среда выделения (д)

840,4

19 2

10 3

55,6

228,7

221,4

011

304

= 078,

n =8, t

табл.

= 2,37 для Р ≤ 0,05

Таким образом, субклеточная локализация АК, ДАК и ДКГК в листьях

ячменя в значительной степени определяется условиями освещения.

Светозависимое накопление АК при длительной экспозиции связано с

увеличением ее содержания в клеточном соке и митохондриях. В хлоропластах

на свету также идет новообразование АК за счет или фотовосстановления

предшественника [344], или фотовосстановления окисленной формы [286],

однако наряду с этим имеет место активное использование восстановленной

формы АК в светозависимых процессах, масштаб которого превышает

биосинтез. Поэтому при длительном освещении растений содержание АК в

хлоропластах начинает снижаться. Можно допустить и другое: синтезированная

на свету в хлоропластах АК быстро поступает в клеточный сок, тем самым

определяя высокое содержание в нем

аскорбата. Обмен восстановителем может

идти не только с клеточным соком, но и с митохондриями, и такая возможность

уже обсуждается [56]. Представляется интересным подробнее обсудить возможный механизм

выявленного нами стимулируемого светом накопления АК в митохондриях. В

литературе известны факты светозависимых изменений некоторых процессов в

альбиносных растениях [456], в беспигментных структурах: в клеточных ядрах

[71], в митохондриях, где при включении света резко возрастает НАД ⋅ Н

[267].

Что касается биосинтеза АК, то известно, что ферменты, ответственные за

превращение l-галактоно-γ-лактона в АК, содержатся в митохондриях [282].

Можно предположить, что эта заключительная реакция в биосинтезе АК

является светозависимой. Возможными акцепторами света в митохондриях

могут быть цитохромы, в частности, цитохром С, для которого показано

небольшое ускорение окислительно-восстановительных превращений при

действии “белого” света [63, 65]. К тому же цитохромы имеют поглощение в

зеленой области спектра - довольно активной в биосинтезе АК [104].

Последняя ступень биосинтеза АК у эвглены катализируется l-гулоно-лактон

дегидрогеназой, сосредоточенной преимущественно в цитозоле (86,7%); 11,6%

ее находится в

митохондриях [402]. На свету активность данного фермента

увеличивается [404], что может обусловливать светозависимое накопление АК

не только в цитозоле, но и в митохондриях.

Если же стимуляция светом биосинтеза АК осуществляется на уровне

образования предшественника, то этот процесс должен идти в цитоплазме,

содержащей ферменты, ответственные за восстановление метил-d-галактуроната

l-галактоно-γ-лактон

[307, 327]. Следовательно, помимо субстрата лимитировать

биосинтез АК может и восстановитель -НАДФН+Н

. Источником его в

растениях являются фотосинтез и ОПФЦ, функционирующий в цитоплазме и в

хлоропластах. Поскольку на свету в хлоропластах ОПФЦ полностью

ингибирован, а в цитоплазме ограничен [80], то в светозависимом биосинтезе

АК, скорее всего, используется восстановитель фотосинтетического

происхождения. Тогда возникает вопрос: почему на свету в хлоропластах, где

идет фотосинтез, дающий восстановитель,

количество АК уменьшается, а в

митохондриях - увеличивается? Этот факт можно объяснить лишь рассматривая

масштаб использования АК в данных компартментах. В хлоропластах АК используется в фотосинтезе и в дыхании. На свету

первый источник затрат резко возрастает, а использование в дыхании, наоборот,

уменьшается, следствием чего является снижение общего уровня АК в

хлоропластах и

повышение в митохондриях. Кроме того, увеличение

содержания АК в митохондриях может быть и результатом того, что здесь идет

заключительный этап биосинтеза АК - превращение l-галактоно-γ-лактона в АК.

Способность этиолированных и альбиносных проростков синтезировать АК

говорит о возможном использовании в этом процессе и НАДФН+Н

ОПФЦ.

Наблюдаемая у них стимуляция биосинтеза АК светом также идет за счет

использования восстановителя ОПФЦ, так как для альбиносов, например,

показано, что на свету гликолиз и ОПФЦ не ингибируются, а напротив,

отмечается стимуляция выделения

СО

из равномерно меченой глюкозы [80].

Таким образом, на примере альбиносов видно, что не только субстрат,

необходимый для биосинтеза АК, но и восстановитель может лимитировать ее

новообразование; так, у альбиносов при отсутствии фотосинтеза, дающего

субстрат, биосинтез АК стимулируется светом.

При исследовании участия АК в обмене веществ растений, как правило,

анализируется система кислот

АК↔ДАК. Однако присутствующее количество

ДАК не всегда говорит о масштабе использования АК, так как уровень ДАК

определяется и одновременно идущим процессом восстановления окисленной

формы, и необратимым ее окислением до ДКГК. Поэтому привлечение в

подобных исследованиях данных по содержанию ДКГК дает дополнительную

информацию к решению вопроса о направленности окислительно-

восстановительных процессов в системе АК↔ДАК↔ДКГК.

4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза

аскорбиновой кислоты

Вопрос об акцепторе света, регулирующего накопление АК, пока решается

однозначно. Это может быть фитохром [219, 391, 392] или родственное

соединение [329]. Фоторецепторную функцию он может выполнять в растениях

с различной пигментацией. Так, фитохром обнаружен

в проростках овса,

биосинтез хлорофилла которых ингибировался гербицидом норфлуразоном, и

уровень фитохрома в них мало отличался от такового этиолированных растений

[285]. Г.Мор [89], относя увеличение скорости синтеза АК к фотореакциям

проростков горчицы, также в качестве пигмента, поглощающего эффективный

свет, рассматривает фитохром. По его данным, Ф

ДК

способен быстро индуци-

ровать и терминальную оксидазу АК - аскорбатоксидазу.

В проростках горчицы лаг-фаза изменения скорости накопления АК при

включении дальнего красного света равняется 1,5 часа у 36-часовых проростков

и 3 часам у 72-часовых [219]. В связи с этим повышение содержания АК на

свету, по-видимому, нельзя объяснить только системой фитохрома, так как

лаг-

фаза вызванного фитохромом увеличения содержания АК составляет один час и

более [219, 391], а в наших и других [404] опытах светозависимое образование

АК отмечено и через более короткое время.

Регуляторные возможности фитохрома, вероятно, не так безграничны, как

сейчас принято считать. В частности, уже приводятся данные о том, что

регуляторное действие фитохрома на биогенез

хлоропластов в большей степени

проявляется в этиолированных проростках и при их прозеленении до этапа

образования мембран тилакоидов, а дальше фитохром уже не влияет на состав и

функционирование тилакоидов [232]. В связи с этим, пытаясь объяснить

механизм стимулирующего действия света на биосинтез АК, нам хотелось бы

привлечь внимание исследователей и к другим

фоторецепторам [370], в

частности, поглощающим свет в зеленой области спектра. Даже в случае с

фитохромом высказывается предположение, что зеленый свет фитохром

поглощает не самостоятельно, а через посредство “зеленого фоторецептора”,

который может взаимодействовать с фитохромом и регулировать его

содержание в мембранах [441]. Зеленый свет могут поглощать цитохромы. Основным местом их

локализации являются хлоропласты и

митохондрии. Каждый цитохром имеет

три полосы поглощения

α, β и γ [73] (см. табл. 19). Следовательно, и полосы

поглощения цитохромов ЭТЦ фотосинтеза приходятся на зеленую область

спектра (490 - 570 нм) [50, 131, 438]. Проявивший большую активность в

биосинтезе АК зеленый свет с длиной волны 553 нм (табл. 12) как раз

соответствует поглощению восстановленного цитохрома f [447].

Митохондриальные цитохромы b и с также имеют поглощение в зеленой

области спектра. Оно может несколько

отличаться от вышеприведенного. Так, в

листьях шпината

α-пик цитохрома с обнаружен при 552 нм, b цитохромов - при

560 нм, а цитохромов - при 604 нм. Несколько отличалось поглощение α-пика

цитохромов стеблей шпината: оно приходилось на 549 нм у цитохрома с, 599 нм

у цитохрома а и 554, 557, 567 нм - у цитохромов b [251].

Таблица 19

Поглощение света цитохромами (нм)

Полоса поглощения

Цитохромы

α β γ

Митохондриальные

563

554

550

532

524

521

429

418

412

Хлоропластные f

555

563

559

526

529

422

422-425

B зеленой области спектра поглощают и микросомальные цитохромы в

проростках маша: 559, 560,5, 562,5 нм [277].

Цитохромы обнаружены в нефотосинтезирующих клетках [259, 331],

поэтому они могут выступать в качестве акцепторов зеленого света и в

этиолированных проростках ячменя, пластиды которых содержат цитохромы f, b

(низко потенциальный), цитохром b - 563 нм [349].

Помимо цитохромов в зеленой области спектра поглощают беталаиновые

пигменты

[149], пластоцианин хлоропластов [416] и этиохлоропластов [130],

антоцианы и незаряженные флавиновые радикалы (максимум поглощения 580

нм) [85], возможно, и другие соединения [294]. При исследовании спектра

действия фотоэлектрической реакции фасоли было показано, что он сходен с

таковым фотосинтеза, но имеет еще дополнительный максимум в зеленой

области спектра, наличие которого авторы связывают с фикобилиновыми

пигментами [358].

Каким образом энергия

зеленого света, поглощенного данными

соединениями, может стимулировать биосинтез АК, пока не ясно. Заманчиво

предположить, что энергия света, поглощаемого, например, цитохромом в-559,

функция которого не ясна [234], непосредственно используется в

фотовосстановлении ДАК до АК. Система ДАК/АК имеет более высокий

отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (0,08 В, рН 7,0),

чем цитохромы (0,12 - 0,29 В) [133], и энергия зеленого света

может быть

использована для осуществления переноса электрона от цитохромов в сторону

компонентов с более высоким отрицательным окислительно-восстановительным

потенциалом: ДАК/АК. Механизм участия зеленого света в биосинтезе АК может быть связан и с

активацией ЭТЦ дыхания или фотосинтеза, так как некоторые из указанных

фоторецепторов являются их компонентами. Возможно и другое -

при

облучении зеленым светом, когда меняется скорость ростовых [53, 302, 394, 297]

и ряда обменных процессов [24, 40, 55, 91, 314], уменьшается использование АК,

например, на фотовосстановление пигментов [378] или других соединений, что

также будет способствовать накоплению аскорбата.

Такая возможность проверялась в опытах с альбиносными проростками

ячменя, в которых с помощью салицилальдоксима ингибировалась активность

пластоцианина [175]. Медьсодержащий белок пластоцианин присутствует в

тилакоидных мембранах хлоропластов [216, 132] и функционирует в качестве

переносчика электронов от цитохрома f на Р

700

в ЭТЦ между фотосистемой II и I

[265, 354, 355]. Образование пластоцианина зависит от интенсивности

действующего света, и скорость его биосинтеза в темноте составляла лишь 1/10

от светового варианта [386]. В спектре поглощения окисленного пластоцианина

имеется три максимума - 460, 597 и 775 нм, то есть один из них приходится на

зеленую область спектра (рис. 16). Голубая окраска пластоцианина полностью

исчезает при

его восстановлении АК [416]. АК используется в процессе

восстановления пластоцианина, хотя эта реакция может играть лишь

второстепенную роль, так как в хлоропластах пластоцианин в основном

восстанавливается цитохромом f [422]. Р

700

также восстанавливается АК [41,

263], и этот процесс усиливается в 20-25 раз при добавлении 2,6 моля

пластоцианина на моль Р

700

[301].

Рис. 16. Спектры поглощения цитохрома

с в окисленной (1) и восстановленной (2)

формах. Указаны характерные полосы поглощения восстановленной формы - α, β и γ

(по А.Ленинджеру, 1985)

Пластоцианин присутствует в пигментированных тканях. Наличие его у

альбиносов было показано нами с использованием метода афинной

хроматографии [182]. Для ингибирования пластоцианина использовались

различные концентрации салицилальдоксима (5⋅10

-4

- 5⋅10

-9

М), добавленные к

1%-ной глюкозе, и в их присутствии исследовалось светозависимое накопление

АК альбиносными проростками ячменя (рис. 17). Характер действия

салицилальдоксима зависел от его концентрации: при 5⋅10

-4

- 5⋅10

-5

М отмечено

увеличение содержания АК при снижении ДАК; в присутствии меньших

концентраций (5⋅10

-6

- 5⋅10

-7

М) уровень АК и ДКГК снижался, что

сопровождалось накоплением ДАК.

Рис. 17. Изменение содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных

листьях ячменя, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету

(1 час, 33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) в присутствии различных концентраций

салицилальдоксима (СА) в % к контролю (100%)

Стимулирующее действие салицилальдоксима на накопление АК можно

объяснить тем, что ингибирование пластоцианина влечет за собой уменьшение

использования АК на его восстановление и восстановление Р

700

Салицилальдоксим в концентрации 5⋅10

-6

- 5⋅10

-7

М, вероятно, уже не оказывает

активного ингибирующего действия на пластоцианин, и уменьшение накопления

АК на свету в этом случае может определяться использованием ее на

восстановление пластоцианина, и как результат использования восстановленной

формы АК возрастает ДАК.

Обнаруженный нами эффект стимуляции накопления АК

салицилальдоксимом в альбиносных проростках ячменя на свету проявлялся,

хотя

и в меньшей степени, и в этиолированных проростках. Вероятно,

прозеленение этиолянтов отвлекает часть восстановленной АК, что

подтверждалось данными опытов с более длительной, двухчасовой экспозицией:

процесс прозеленения проростков нарастал, и стимуляция накопления АК

салицилальдоксимом уже отсутствовала. Следовательно, пул АК в проростках

ячменя на свету может зависеть от функционального состояния пластоцианина,

способного самовосстанавливаться и восстанавливаться АК.

Обсуждая приведенный материал по исследованию накопления АК в

проростках ячменя в присутствии салицилальдоксима, вероятно, нужно иметь в

виду и нижеследующее соображение. Механизм ингибирующего действия

салицилальдоксима основан на его влиянии

на ионы меди. Если это не

специфическая реакция, то салицилальдоксим может ингибировать не только

медьсодержащий белок - пластоцианин, но и медьсодержащие ферменты,

окисляющие АК, и тогда наблюдаемое увеличение уровня АК в присутствии

салицилальдоксима будет опосредовано не функциональным состоянием

пластоцианина, а оксидазами АК. Возможность влияния экзогенного цитохрома с (поглощение при 550 и

521 нм

) на светозависимое накопление АК проверялось нами в опытах с 11-

дневными альбиносными проростками ячменя, которые предварительно

выдерживались 40 часов в темноте (табл. 20). Освещение (интенсивность света

33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) листьев на растворе цитохрома с (0,403 мг/мл)

стимулировало накопление восстановленной формы АК и снижало ее дериваты -

ДАК и ДКГК. Можно предположить, что энергия зеленого света, поглощенного

цитохромом с, идет на восстановление ДАК в АК.

Таблица 20

Действие экзогенного цитохрома с на содержание АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) в

11-дневных альбиносных проростках ячменя на свету (33 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

(экспозиция 24 ч; предварительное выдерживание растений в темноте 40 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

На воде

134,4 ± 5,4 92,3 ± 4,7 104,4 ± 7,4

На растворе цитохрома с

(0,403 мг/мл)

268,6 ± 12,9

66,8 ± 2,1

86,8 ± 11,0

Таким образом, физиологическая активность зеленого света, в частности, в

отношении светозависимого накопления АК, может быть связана не только с

функционированием фитохрома, но и с другими фоторецепторами,

поглощающими свет в зеленой области спектра.

Глава 5. АЛЬБИНОСНЫЕ ПРОРОСТКИ КАК МОДЕЛЬ

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОЗАВИСИМЫХ ПРОЦЕССОВ,

НЕ СВЯЗАННЫХ С ФОТОСИНТЕЗОМ

Разработанный нами метод получения альбиносных

проростков ячменя из

обработанных СМ семян (глава 4.3) позволяет получать неограниченное

количество материала, который можно использовать для исследования

светозависимых процессов, не связанных с фотосинтезом, а также для изучения

биогенеза хлоропласта, его функциональной активности. В настоящее время

имеется целый ряд примеров успешного использования подобных объектов для

исследования некоторых физиологических проблем, и в частности для

выяснения механизмов фотосинтеза, его структурной и функциональной

организации [411].

Под

действием СМ ингибируется синтез хлорофилла, развитие структуры

хлоропластов [222, 228]. Детального исследования влияния СМ на биосинтез

белков хлоропласта не проводилось. В связи с этим нами выполнена работа по

изучению действия СМ на состав и активность некоторых белков электрон-

транспортной цепи, ферментов цикла Кальвина, ассимиляцию СО

и продукты

пятиминутного фотосинтеза [182].

В опытах использовались вырезки из зеленых и альбиносных участков

мутантных листьев ячменя. Контролем служили зеленые проростки. Наличие

или отсутствие белков электрон-транспортной цепи контролировали

электрофорезом в ПААГ. Для выделения фракции белков навеску листьев 1,5 г

измельчали в жидком азоте, затем экстрагировали 0,05 М трис-НСl+ 0,1%

тритон Х-100. Белки

осаждали холодным ацетоном (1:1 объем/объем), осадок

экстрагировали вышеуказанным буфером. Нерастворимые белки отделяли

центрифугированием при 10 тыс. g в течение 15 минут. Супернатант

хроматографировали на сефадексе Г-25, белковую фракцию, выходящую из

колонки первой, использовали для электрофореза.

Изоферменты пероксидазы в ПААГ выявляли по Орнстейну [356],

ферредоксин-НАДФ-редуктазу, ферредоксин и пластоцианин по Христину и др.

[164, 165]. Перед

электрофорезом белковые метчики и экстракты листьев

инкубировали 40 минут при 90° С в присутствии додецилсульфата натрия (2%) и

дитиотреитола (0,01%).

Для получения фракции водорастворимых белков листья растирали в трис-

НСl буфере 0,05 М, рН 7,8, содержащим дитиотреитол 0,001 М, MgCl

0,01 М,

ЭДТА 0,0005 M. После разрушения гомогенат центрифугировали (20 тыс.

об/мин) при 0° С в течение 30 минут. Скорость ферментативной реакции

измеряли в свежеприготовленных экстрактах. Активность РДФ-карбоксилазы

определяли радиометрическим методом, рибозо-5-фосфатизомеразы и

фосфорибулокиназы - колориметрическим [129].

Продукты пятиминутного фотосинтеза выявляли в листьях, предварительно

экспонированных в газовой камере с

СO

(конц. 0,033%), фиксацию проводили

кипящим 96%-ным этанолом. Далее листья растирали и экстрагировали

нисходящими концентрациями этанола, сумму спиртоводорастворимых

соединений лиофильно высушивали, растворяли в 1 мл дистиллята,

определенную аликвоту наносили на бумажную хроматограмму. Для разделения

соединений применяли систему растворителей: 1 направление - этанол,