Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

При исследовании этих вопросов наиболее перспективными могут быть

работы с беспигментными мутантами или с растениями, имеющими измененный

пигментный состав, которые можно получить при обработке растений

некоторыми антибиотиками: хлорамфениколом или СМ. Исследование

механизма действия СМ на прокариотные организмы показало его

ингибирующее влияние на функцию рибосом. СМ связывается с 70S-

рибосомами [31, 261], в результате чего

появляются ошибки при считывании

информации с природной матрицы [420]. Наличие 70S-рибосом и у высших

растений объясняет факт подавления в присутствии СМ синтеза хлорофилла,

РНК, развития структуры хлоропластов [222], уменьшение скорости включения

аминокислот в белки пластид [228]. Угнетение биосинтеза хлорофилла и развития хлоропластов под действием

СМ отмечено у этиолированных проростков томатов, турнепса, капусты,

горчицы [319, 320, 321].

Другим исследователям, используя обработку растений

СМ, удалось получить альбиносные особи эвглены [366] и альбиносные

растения пшеницы [6]. По данным Р.С.Бабаяна и др. [6], СМ в концентрации

150-200 мкг/мл вызывает появление альбиносных проростков у пшеницы,

однако эффективные для пшеницы дозы СМ не оказывали существенного

действия на семена ячменя, поэтому в начале своей

работы мы определили

концентрации СМ, вызывающие альбинизм у ячменя. Эти концентрации

примерно в десять раз превосходили активные для пшеницы дозы и равнялись 1-

2,5 мг/мл. Такое большое колебание величины концентрации действия,

вероятно, объясняется тем, что 30S-субъединицы рибосом в зависимости от

температуры могут присоединять одну или две молекулы СМ [31].

Проростки ячменя, выросшие из семян, обработанных стрептомицином

(справа - контроль). Фото Я.Д. Кесельман

Для получения альбиносных проростков семена ячменя, помещенные в

чашки Петри или плоские кюветы, смачивались раствором СМ [181]. Чаще всего

использовалась концентрация 2,5 мг/мл. Через сутки обработка семян раствором

повторялась; через двое-трое суток проклюнувшиеся семена высаживались в

почву. Первый лист проростков, полученных из обработанных СМ семян, на две

трети был альбиносным, верхушка

оставалась пигментированной (см. фото на

с. 57). Зона раздела имела желто-зеленую окраску. В опытах использовались

вырезки из альбиносных участков мутантных листьев. В них определено

содержание пигментов по Нибому [75]. Действие света (люминесцентные лампы

ЛЦЦ-40) на содержание хлорофилла и каротиноидов представлено в таблице 14.

Кроме альбиносного материала исследовались зеленые и этиолированные

проростки.

зеленых листьях ячменя, плавающих на растворе СМ, при освещении

происходит уменьшение количества хлорофиллов и суммы каротиноидов по

сравнению с контрольным вариантом - листьями, плавающими на воде.

Таблица 14

Биосинтез пигментов (мкг/г) листьями ячменя в присутствии СМ на свету

(интенсивность света 15,2 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды

3еленые листья

Исходное содержание

360,2±3,0 295,4±13,0 156,3±9,2

На воде

442,7±20,8 305,9±7,9 212,4±7,4

На воде + СМ

314,2±10,9 233,8±7,1 158,5±5,1

Этиолированные

Исходное содержание 0 0

16,0±0,1

На воде

147,8±2,9 113,2±7,6 94,3±6,5

На воде + СМ

42,0±1,8 41,2±10,4 37,4±1,0

Световые альбиносы

Исходное содержание 0 0

4,1±0,1

На воде 0 0

4,8±0,4

На воде + СМ 0 0

3,2±0,1

Темновые альбиносы

Исходное содержание

0,2±0,3 0,3±0,66 5,0±0,2

На воде

0,9±0,03 1,7±0,1 8,4±0,6

На воде + СМ 0 0

5,5±0,5

В этиолированных проростках в присутствии СМ за 24 часа освещения

синтезируется некоторое количество хлорофилла А, В и каротиноидов, однако в

контроле синтез указанных пигментов был в три раза выше. Можно

предположить, что ингибирование биосинтеза зеленых пигментов СМ не

затрагивает процесс перехода протохлорофиллида в хлорофилл и

синтезированные в этиолированных проростках предшественники хлорофилла

на

свету переходят в хлорофилл даже в присутствии СМ; новообразование

предшественников хлорофилла, вероятно, ингибируется антибиотиком, что и

ведет к меньшему накоплению зеленых пигментов в варианте с СМ.

Вырезки из альбиносных частей листьев ячменя, выращенных на свету (в

таблице - световые альбиносы) и в темноте (темновые альбиносы), или не имели

зеленых пигментов, или содержали их в небольшом количестве, которое

убиралось дальнейшим освещением в

присутствии СМ.

Таким образом, используя обработку семян СМ, удалось получить

растительный материал, практически лишенный зеленых пигментов и

содержащий незначительное количество каротиноидов. Распределение АК, ДАК

и ДКГК по зонам в зеленых и мутантных листьях демонстрирует рис. 12, из

которого видно, что по содержанию восстановленной формы АК опытные и

контрольные зеленые растения отличались

незначительно, в то время как

окисленная форма АК и ДКГК преобладали в верхней зеленой и нижней

альбиносной части мутантных растений.

- листья с альбиносным основанием

- зеленые листья

Рис. 12. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней части (1) и основаниях (2)

зеленых и частично альбиносных листьев ячменя

В дальнейшем исследовалась способность альбиносных листьев

синтезировать АК, ДАК и ДКГК. Поскольку используемый материал не

содержал зеленых пигментов и фотосинтез в нем был блокирован, субстрат для

биосинтеза АК вводился экзогенно: вырезки из листьев помещались на 1%-ный

раствор глюкозы. В связи с этим была проверена способность синтезировать

хлорофилл А, В и каротиноиды

вырезками из листьев ячменя, плавающими на

1%-ном растворе глюкозы (табл. 15). Ингибирующий эффект СМ сохранялся и в

этих условиях, а вырезки из листьев темновых и световых альбиносов

содержали следовые количества зеленых пигментов и через 24 часа освещения,

если они находились на растворе глюкозы с СМ.

Таблица 15

Биосинтез пигментов (мкг/г) вырезками из листьев ячменя,

плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ на свету

(интенсивность света 15,2 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды

Зеленые листья

Исходное содержание

429,1 ± 7,6 336,1 ± 24,1 184,2 ± 17,3

На глюкозе

496,0 ± 20,0 364,0 ± 9,5 211,7 ± 8,8

На глюкозе + СМ

432,7 ± 10,8 356,5 ± 4,5 191,7 ± 6,1

Этиолированные

Исходное содержание

1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,5 ± 0,1

На глюкозе

135,7 ± 13,0 141,6 ± 3,0 70,3 ± 3,0

На глюкозе + СМ

25,6 ± 3,6 12,7 ± 2,3 24,7 ± 1,4

Световые альбиносы

Исходное содержание 0 0

5,8 ± 0,2

На глюкозе

1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,02 6,2 ± 0,1

На глюкозе + СМ

0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,01 3,8 ± 0,5

Темновые альбиносы

Исходное содержание

2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 4,5 ± 0,3

На глюкозе

3,4 ± 0,2 2,3 ± 0,4 8,6 ± 1,0

На глюкозе + СМ

2,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1 5,6 ± 1,0

При исследовании зависимости биосинтеза антоцианов от зеленых

пигментов Манцинелли, Янг и др. [320] использовали этиолированные

проростки, обрабатывая их СМ. Как видно из представленных данных, такие

проростки и в присутствии СМ продолжают синтезировать некоторое

количество хлорофиллов, вырезки же из альбиносов в этом плане представляют

собой лучший материал. Поэтому нами для исследования биосинтеза АК

, ДАК и

ДКГК в зависимости от содержания зеленых пигментов были взяты

альбиносные участки первых листьев проростков ячменя, выращенных на свету,

а в качестве контроля - соответствующие участки зеленых листьев.

В вырезках из зеленых и альбиносных листьев ячменя было определено

исходное содержание всех исследуемых кислот и, как видно из таблицы 16,

альбиносы по количественному содержанию в них АК, ДАК и ДКГК мало

отличались от зеленых проростков.

Таблица 16

Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками

листьев ячменя, плавающими на 1% растворе глюкозы в присутствии

СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

Зеленые участки

Исходное содержание

178,3 ± 10,6 57,3 ± 13,4 39,1 ± 10,9

В темноте

85,7 ± 13,1 40,8 ± 7,7 21,0 ± 4,8

На свету

220,2 ± 15,3 22,7 ± 9,1 69,7 ± 15,8

Альбиносные участки

Исходное содержание

166,4 ± 8,5 44,5 ± 2,2 37,2 ± 6,1

В темноте

91,4 ± 2,0 35,6 ± 7,8 19,1 ± 5,5

На свету

217,5 ± 19,7 13,9 ± 3,3 71,1 ± 17,6

Выдерживание в темноте зеленых проростков в течение 24 часов привело к

уменьшению содержания всех кислот: в большей степени АК и ДКГК, в

меньшей - ДАК. 24-часовое освещение способствовало накоплению АК и

особенно ДКГК, но в три раза уменьшило количество ДАК.

Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК в зависимости от освещения у

альбиносов

имело такой же характер, как и у зеленых проростков, т.е. не

зависело от наличия зеленых пигментов.

Накопление АК и ДКГК в зеленых и альбиносных проростках, плавающих

на 1%-ном растворе глюкозы, наблюдалось только на свету. Необходимо

отметить, что поступление в лист экзогенной глюкозы зависит от условий

освещения: так, в опытах М

.М.Окунцова, Р.А.Карначук, Н.М.Фроловой [106] на

свету в листья овса входило почти в два раза больше

С-глюкозы, чем в

темноте. Следовательно, в нашем опыте проростки, находящиеся на свету,

лучше снабжены субстратом, чем темновые, но это, вероятно, не является

единственной причиной, обусловливающей световой биосинтез АК и ДКГК, так

как если бы он был темновым, мы наблюдали бы накопление кислот и в темноте,

но в меньших масштабах, чем

на свету. На самом же деле в темноте количество

указанных кислот резко снижается. По-видимому, помимо субстрата решающее

значение в процессе накопления АК и ДКГК имеет свет.

Исследована реакция на свет зеленых и альбиносных проростков,

предварительно выдержанных в темноте в течение 45 часов (табл. 17). Такое

длительное пребывание в темноте способствовало снижению

в зеленых

проростках содержания окисленной формы АК и в два раза уменьшило

количество восстановленной АК и ДКГК. Последующее 20-минутное

освещение почти полностью восстановило исходное содержание АК и ДКГК и

резко снизило (в 2,5 раза) количество окисленной формы АК, тогда как в

темноте за это время существенных изменений не произошло.

Таблица 17

Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками

листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ

(экспозиция 20 мин; предварительное выдерживание проростков в темноте 45 ч;

интенсивность света 15,2 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

Зеленые участки

Исходное содержание

299,6 ± 2,3 57,8 ± 2,2 86,5 ± 4,8

45 ч темноты

99,0 ± 5,3 50,8 ± 2,8 42,2 ± 4,3

45 ч темноты + 20 мин темноты

95,2 ± 1,3 47,5 ± 1,8 40,5 ± 1,7

45 ч темноты + 20 мин света

200,8 ± 9,1 19,3 ± 1,2 79,3 ± 5,7

Альбиносные участки

Исходное содержание

177,2 ± 10,1 42,2 ± 2,7 67,9 ± 4,5

45 ч темноты

87,6 ± 6,6 31,1 ± 2,5 13,0 ± 0,1

45 ч темноты + 20 мин темноты

90,0 ± 13,8 31,7 ± 2,0 12,8 ± 3,6

45 ч темноты + 20 мин света

169,7 ± 6,4 8,0 ± 0,0 25,0 ± 1,0

45-часовое пребывание в темноте альбиносов особенно сильно сказалось на

содержании ДКГК, количество которой уменьшилось с 67,9 до 13,0 мкг/г.

Последующее 20-минутное освещение увеличило ее содержание почти в 2 раза,

но оказалось недостаточным для восстановления исходного уровня. Характер

изменений восстановленной и окисленной форм АК у альбиносов был таким же,

как и у зеленых

проростков.

Таким образом, альбиносные участки листьев ячменя на свету при наличии

экзогенного субстрата интенсивно синтезируют АК и ДКГК, следовательно, их

образование не связано с наличием зеленых пигментов и представляет собой не

зависимый от фотосинтеза светозависимый процесс.

Следует отметить, что под действием СМ количество желтых пигментов в

листьях ячменя уменьшается в

десятки раз, но это тоже не оказывает

существенного влияния на накопление АК и ДКГК, хотя нужно учитывать, что

регуляторные функции пигменты могут выполнять и в небольших

концентрациях, когда поглощенная ими световая энергия используется лишь для

переключения метаболических путей [20, 64].

Механизм светоактивации образования АК и ДКГК пока неясен. Однако,

учитывая то, что некоторые

органические кислоты (щавелевая, янтарная, винная,

α-кетоглутаровая) способствуют накоплению АК на свету [110], можно

предположить, что зависящее от света накопление АК (возможно, и ДКГК) в

зеленых, и особенно в альбиносных, проростках связано с функционированием

цикла Кребса, деятельность которого, как теперь известно, продолжается и на

свету [12, 16, 97]. В связи с чем на свету

усиливается поступление

радиоактивного углерода из 1,6-

С-глюкозы в ди- и трикарбоновые кислоты

[97]. О возможности биосинтеза С

-кислот непигментированными клетками уже

сообщалось [18].

Светозависимое накопление АК альбиносными проростками говорит об

отсутствии прямой связи данного процесса с фотосинтезом. Реальнее выглядит

зависимость биосинтеза АК от дыхательного процесса, для которого работами

последних лет показана возможность функционирования на свету не только

ЦТК, но и гликолиза, а также ОПФЦ [5, 13, 16, 80]; тем более, что на свету в

анализируемых альбиносных проростках стимулируется

дыхание в целом и

отдельные его этапы: гликолиз, ОПФЦ, ЦТК [49].

Исследование действия света различного спектрального состава на

биосинтез АК в альбиносных проростках ячменя показало (рис. 13), что

наибольшую активность в этом процессе проявил зеленый свет (480-600 нм) и

далее по мере уменьшения активности - синий (430-520 нм) и красный (620-740

нм).

Рис. 13. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных проростках ячменя

на свету различного спектрального состава в % к количеству кислот в темновом

варианте - 100% (интенсивность света - 2,5 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

; экспозиция - 1 ч)

Таким образом, и в опытах с альбиносными проростками ячменя

подтвердился факт стимулирующего действия зеленого света на накопление АК.

Зеленый свет длительное время рассматривался как малоактивный для растений,

и его обычно использовали для выполнения препаративной работы перед

световым экспериментом и во время фотоморфогенетических исследований.

Работами, выполненными в 60-70-е годы, нам удалось показать

, что на зеленом

свету, а также на желто-зеленом активно синтезируется АК в этиолированных и

зеленых проростках [98, 103, 104]. Далее было установлено, что зеленый свет

оказывает влияние на ростовые процессы [53, 297, 302, 394], на

фотосинтетический аппарат [24, 40, 55, 91, 314] и содержание органического

углерода у растений [79]. Активация некоторых реакций метаболизма зеленым

светом рассматривается рядом авторов как опосредованная фитохромом,

возбуждаемым зеленым светом [54, 120, 146]. Следовательно, зеленый свет

нельзя рассматривать как физиологически инертный, а уточнение механизма его

действия на растения - дело будущих исследований.

4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты

и ее окисленных форм в связи с освещением

Гистохимическое

исследование распределения АК в листьях чистяка

весеннего (Ficaria verna Huds.) показало, что она сосредоточена в хлоропластах,

около ядер и во внешнем слое цитоплазмы. В стебле этого растения

центральный цилиндр и кора богаты АК, которая содержится главным образом в

хлоропластах [195]. Более 30 - 40% АК листьев шпината также находится в

хлоропластах [243]. В клетках корня конских бобов (Vicia faba L.) и лука

репчатого (Allium сера L.) повышенное содержание АК обнаружено в области,

близкой к клеточной стенке, а в клетках меристемы она распределена по всей

цитоплазме равномерно [289]. Много АК и в самой клеточной стенке [225]. В

клетках корня хрена весь аскорбат сосредоточен в больших центральных

вакуолях [262]. Субклеточная локализация АК в большой степени определяется

физиологическим состоянием клетки

и ее структур. В зависимости от

функционального состояния хлоропластов содержание АК в протоплазме может

быть выше, чем в хлоропластах [195]. Делящиеся клетки культивируемых

верхушек корней кукурузы накапливали АК в цитоплазме, но картина

распределения АК менялась после начала элонгации клеток. В полностью

вытянувшихся клетках основная часть АК была связана с клеточной стенкой

[236].

Имеющиеся в литературе фрагментарные данные не дают цельной картины

количественной локализации АК в клетке. Исследование же этого вопроса,

несомненно, имеет большое значение для всесторонней оценки

физиологической роли АК в обмене веществ растений.

Для клеточных структур свойственен постоянный обмен метаболитами,

поэтому, решая вопрос о субклеточной локализации АК, мы провели

одновременный анализ ее

содержания в хлоропластах и митохондриях,

клеточном соке и структурных элементах - фракции целых листьев, оставшейся

после извлечения сока [177, 178]. При этом учитывались условия освещенности,

которые оказывают существенное влияние на содержание АК [181, 275]. Наряду

с анализом восстановленной АК исследовалась ее окисленная форма -

дегидроаскорбиновая кислота и продукт необратимого окисления АК -

дикетогулоновая кислота, практически не исследованная

в растениях [172]. В

опытах использовались 7-9-дневные проростки ячменя сорта Надя. Источник

света - люминесцентные лампы ЛДЦ-40 интенсивностью 33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

Хлоропласты выделяли по методике, описанной в работе Г.А. Могилевой и

др. [87]. Супернатант, полученный при осаждении фракции хлоропластов,

подвергали центрифугированию при 9 тыс. об/мин (ЦЛР-1) в течение 15 минут

для отделения митохондрий. Целостность структур в выделенных фракциях

контролировали микроскопированием соответствующих образцов. Клеточный

сок извлекали центрифугированием (1 мин при 2 тыс. об/мин, ЦЛС-3)

обработанных хлороформом листьев в специальных стеклянных контейнерах

[105].

Расчет количества исследуемых кислот проводился на сухой и сырой вес

хлоропластов, митохондрий и целых листьев. Закономерности изменения

содержания кислот в условиях опытов сохранялись при обеих формах расчета,

поэтому приводим

только данные, полученные при пересчете на сырое вещество

с тем, чтобы была возможность сопоставить содержание кислот в структурах и

клеточном соке.

Одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в клеточном соке и структурных

элементах листьев ячменя (рис. 14) показал, что все исследованные кислоты

количественно преобладают в клеточном соке, превосходя содержание АК в

структурных

элементах почти в 4 раза, а ДАК - более чем в 2 раза.

Длительное выдерживание проростков в темноте (40 ч) привело к

выравниванию содержания кислот в анализируемых фракциях за счет

повышения уровня АК в структурных элементах и одновременного снижения

окисленной формы АК в обеих фракциях.

Последующее 24-часовое освещение, снизив уровень АК в структурных

элементах

и повысив его в клеточном соке, вновь вернуло к исходному

соотношение в них АК (1 : 4). Свет повысил содержание ДАК и ДКГК в

структурных элементах и в клеточном соке, в последнем особенно резко.

Таким образом, основным местом сосредоточения АК, ДАК и ДКГК в

листьях ячменя является клеточный сок. Содержание АК и ДКГК в

нем

довольно стабильно, не меняется даже при длительном пребывании растений в

темноте и увеличивается только при продолжительном освещении [180].

Наиболее существенные изменения содержания кислот в связи с освещением

происходят во фракции "структурные элементы": в темноте резко возрастает

количество АК, что сопровождается снижением ее окисленной формы - ДАК, на

свету характер изменений становится

противоположным. Вероятно, повышение

содержания АК в структурных элементах в темноте является результатом

неиспользования ее в процессе фотосинтеза, где она может идти на поддержание

в восстановленном состоянии хлорофилла [63], пластоцианина [425], возможно,

и других соединений электрон-транспортной цепи [301].

Длительное освещение изменило содержание АК в клеточном соке, увеличив

его на 49% по сравнению с исходным содержанием

. Это увеличение

коррелировало с нарастанием продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Можно

предположить, что в данных условиях увеличивается и светозависимое

использование АК, идущее с накоплением ее окисленной формы и ДКГК,

образующейся при разрыве лактонового кольца ДАК.

Стимулируемое светом накопление АК в клеточном соке может идти или за

счет ее новообразования,

или за счет усиливающихся на свету притоков АК из

клеточных структур. Скорее всего, решающим является второе событие, так как

в обеих анализируемых фракциях на свету увеличивается содержание ДАК,

которое, обладая повышенной по сравнению с АК способностью растворяться в

липидах, довольно легко может проходить через клеточные мембраны и

выполнять роль транспортной формы АК [154].

- свет

- темнота

Рис. 14. Действие света (33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) на содержание АК (1), ДАК (2)