Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Т а б л и ц а 28. Некоторые области практического применения мембранной

фильтрации

Процесс

рабочее давление,

МПа

Микрофильтрация,

0,05

Ультрафильтрация

0,5

Обратный осмос

Проходящие

через мембрану

вещества

Вода,

растворенные

вещества

Вода,

растворенные

неорганические

вещества

Вода,

растворенные

высоко

полярные

низкомолеку-

лярные

вещества

Частицы и

вещества,

задерживающиеся

мембраной

Суспендированные

и коллоидные,

частицы, бактерии

и другие микробы

размером более

0,1 мкм

Бактерии,

коллоидные и

суспендированные

частицы размером

более 10' мкм,

растворенные

органич.

полимеры с ММ

1 кДа

Бактерии, вирусы,

суспендированные

и коллоидные

частицы,

растворенные

неорганические

вещества,

органические

вещества с ММ

0,2 кДа

Области

использования

Стерилизация

растворов в

биотехнологичес-

ких и химико-

фармацевти-

ческих

производствах,

бактериологич.

анализах,

при разделении

веществ

Очистка

растворов

биополимеров,

концентриро-

вание,

фракциони-

рование,

освобождение

от пирогенов

(депироге-

низация)

Концентриро-

вание

растворов в

биотехнологии,

глубокое

обессоливание

воды и т. д.

Любой фильтр, используемый для стерилизующей фильтрации,

не должен качественно и количественно изменять конечный про-

дукт (в том числе и антибиотическую активность культуральных

жидкостей после их стерилизующей фильтрации через батареи

фарфоровых свечей).

255

Качество мембран проверяют обычно биологическим методом,

используя для этого виды из родов Pseudomonas и Serratia.

При всех положительных качествах стерилизующей фильтра-

ции через мембраны нельзя не отметить и недостатки этого

способа, к которым относятся: адгезия частиц к мембранам, нео-

днородность пор по диаметру ("абсолютных" мембран по стерили-

зующей эффективности не существует, но стерильность может

быть достигнута и достигается вследствие наложения других при-

чин, например, адсорбции частиц на мембране), удержание части

стерилизуемой дорогостоящей жидкости на мембране при фильт-

рации малых объемов ее, а также возможная селективная адсор-

бция ионов (чаще — катионов) из небольших объемов растворов,

недостаточная или плохая смачиваемость мембран водой и др. К

тому же по-прежнему актуальной остается проблема вирусного

загрязнения БАВ и очистки БАВ от вирусов. Ситуация, связанная

с очисткой биопродуктов от вирусов, обострилась еще и потому,

что появилось сообщение о контаминации гормона роста человека,

получаемого из гипофиза, "медленным" вирусом болезни Крейтц-

фельда-Якоба, и это на фоне возрастающей роли ретровирусов

(включая ВИЧ). Как следствие — усилилась настороженность к

препаратам из крови, гормонам, экстрагированным из тканей

млекопитающих; рекомбинантным белкам, образуемым культиви-

руемыми клетками животных. Более того, ряд вирусов животных

являются патогенными для человека (зоонозные вирусные инфек-

ции).

Потенциальная контаминация названных выше продуктов воз-

можна из различных источников: от лиц, чьи клетки используются

в биотехнологических процессах; от миеломных клеток, применя-

емых для получения гибридов; из питательных сред для культиви-

рования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для

очистки белковых продуктов, например, моноклональные антите-

ла; наконец, несоблюдение требований GMP.

Принятая проверка инактивации вирусов-контаминантов в био-

продуктах заключается в их температурной или химической обра-

ботке. Однако эти методы не универсальны. К тому же выявление

вирусов базируется не только на дорогостоящих, но и мало чувст-

вительных процедурах. Корпорация "Mfflipore" разработала тех-

нологию так называемой наноселективной фильт-

рации с включением вирусудаляющего модуля (Viresolve/70),

снабженного уникальной запатентованной мембраной. Эта техно-

256

логия значительно отличается от технологий с использованием

ультрафильтрационных мембран, хотя бы, например, тем, что в

модуле не предусматривается применение открытой матриксной

поддерживающей структуры, а поры уникальной мембраны иск-

лючительно малы, благодаря чему проявляются отличные качества

ее по задержке вирусов размерами от 23 нм и выше. За этими

пределами остаются тогавирусы (18 нм) и вироиды (15 нм). К тому

же однообразный матрикс мембраны обеспечивает эффективный

поток жидкости и ее физическую стабильность. Модуль предназ-

начен для фильтрации белковых растворов. Они (модули) выпу-

скаются с мембранами разных размеров, в зависимости от объемов

фильтруемых растворов.

промышленном модуле применена мем-

брана с площадью 0,92 м

для фильтрации нескольких сотен литров.

Воздух, подаваемый в ферментаторы, должен быть чистым и

стерильным. В этих случаях еще используют и другие фильтрую-

щие материалы, которыми заполняются общие и индивидуальные

(для каждого ферментатора) фильтры, например, из перхлорвини-

ла (в фильтрах Петрянова — ФП), стекловаты и др. Профильтро-

ванный воздух сжимается в компрессорах, охлаждается в тепло-

обменнике, поступает в ресивер (от англ. reciever — емкость),

устраняющий пульсации воздуха, из которого через брызгоулав-

ливатель проходит общий и индивидуальный фильтры, и только

после этого поступает через барботер в культуральную жидкость.

Питательная среда перед засевом каким-либо биообъектом

также должна быть стерильной. В таких случаях прибегают к

тепловой стерилизации, заботясь при этом о сохранении стабиль-

ности ингредиентов среды. В микробной биотехнологии обычно

используют методы периодической и непрерывной стерилизации.

Первую из них осуществляют в аппаратах малой емкости непос-

редственно в ферментаторах глухим или острым паром под давле-

нием в течение 30—40 мин. при температуре порядка 134°С

(2,02650x10

Па) после удаления воздуха из аппарата при нагреве

до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик или рубашку

аппарата и засевают тем или иным биообъектом.

Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концен-

трат питательной среды подают насосом через систему конструк-

ций, включающую нагреватель, выдерживатель (собственно сте-

рилизатор) и теплообменник (охладитель, в котором охлаждение

среды происходит до температуры, оптимальной для культивиро-

вания клеток).

9 т. 8524

257

В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред

некоторых других объектов осуществляют

автоклавах. Стерили-

зацию проводят паром

под

давлением, соблюдая необходимые

режимы (табл. 29). В отдельных случаях прибегают

сухожаровой

стерилизации.

Таблица 29. Режимы стерилизации

t°,

"С

121

126

134

140

150

160

170

Паром под давлением

время,

мин.

давление,

Па

(атм.)

1,01»10

П)

1,414»10

(1,4)

2,02»

(2)

Сухим жаром,

время,

мин.

180

150

120

Различные материалы по-разному влияют

на

рост

развитие

биообъектов,

тому

же — не все из них

можно подвергать

автоклавированию (таблица 30).

Таблица 30. Влияние некоторых материалов на рост клеток в культурах и

возможность их стерилизации паром под давлением

(выборочно)

Материал

Стекло (контроль)

Дюралюминий Д1 AT

Оргстекло 40ПБ

Полиэтиленовая трубка

Резина белая (пищевая)

Резина красная

Резина черная

(вакуумная)

Сталь Х18Н10Т

Фторопласт-4

Хлорвиниловая трубка

Эпоксидная смола

полимеризованная

Рост клеток,

% к

контролю

бактерий

метано-

окисля-

ющих-

100

105

102

5,7

6,2

110

102

132

120

других

разных

100

133,8

микро-

водо-

рослей

100

85,9

91,4

184

76,4

112,1

175

в культуре

тканей

расти-

тель-

ных

100

живот-

ных

100

60-80

25-30

100

60-70

Возмо-

жность

авток-

лавиро-

вания

мате-

риала

Да

Нет

Да

д.

Да

Нет

Да

Примечание: (-)

—

данные отсутствуют, (0)

—

клетки не растут.

258

Из приведенных в таблице

данных

видно,

что лишь немногие

перечисленные материалы могут быть использованы в биотехно-

логических процессах-, оставаясь нейтральными в отношении био-

объектов (резина пищевая, с оговорками — фторопласт).

Названные выше методы обеспложивания относят к числу

наиболее распространенных, однако, учитывая необходимость сте-

рилизации весьма широкого ассортимента различных материалов,

приходится прибегать и к другим способам. Этим подтверждается

то положение, что универсальных методов стерилизации не суще-

ствует.

- Термолабильные материалы, например, не могут подвергаться

тепловой стерилизации и тогда можно использовать холодную

химическую стерилизацию, или газовую стерилизацию этиленок-

сидом (температура его кипения + 12,5°С)

Этиленоксид (окись этилена) относится к раз- ru QI_I

ряду химических веществ, неспецифически губи- \ / ^

тельно действующих на различные микроорганиз- О

мы — вегетативные клетки бактерий и грибов,

бактериальные споры и грибные конидии, вирусы. Стерилизуемые

при этом объекты не должны вступать во взаимодействие с

этиленоксидом и должны быть нейтральными, хорошо очищенны-

ми,

при необходимости — продезинфицированными, соответству-

юще упакованными. Не рекомендуется использовать для упаковки

пергаментную бумагу, стеклянную и металлическую тару, шелко-

вые ткани и некоторые другие, не пропускающие этиленоксид.

Упаковка должна обеспечивать диффузию газа и водяных паров к

стерилизуемому объекту. В упаковку вкладывают индикатор (на-

пример, лакмусовую бумагу, изменяющую свой цвет из желтого в

синий при достижении стерильности; это — индикатор типа 1—21

производства "Медикор", Венгрия) и сертификат с указанием

номера серии стерилизации и гарантийный срок хранения (обычно

—

в течение года) в стерильном состоянии, после чего ее помещают

в полиэтиленовый пакет.

После стерилизации этиленоксидом упаковки выдерживают на

предмет испарения газа. Для этого используют проветривание при

температуре не' ниже 20°С в течение 4—5 суток, удаление газа в

рабочей камере циркуляционного парового стерилизатора при

52—55°С в течение 3—4

суток,

удаление газа с помощью проточного

вакуума (остаточное давление 101—101,2 кПа) при 52—55°С в

течение 2-3 суток.

Этиленоксид - токсичный газ, поэтому простерилизованные с

259

его помощью объекты и надлежащим образом проветренные хра-

нят в специальном помещении.

Эффективность такой стерилизации определяется следующи-

ми параметрами: концентрацией окиси этилена, давлением смеси

газов,

влажностью, температурой и временем стерилизации. Сте-

рилизацию проводят в специальных газовых стерилизаторах раз-

личной емкости (например, 20—25 л) с длительностью разовой

стерилизации при этом до 5 часов, поддерживая температуру

50 ± 8°С (323± 8°К) и концентрацию этиленоксида около 750 мг/л

(17,04 моль/м

). Запрещается выводить газовую смесь после стери-

лизации в вентиляционную шахту; она не должна попадать в другие

помещения; ее следует собирать в виде конденсата.

В некоторых случаях применяют для стерили-

СН СН, зации р-пропиолактон, который отличается высо-

| | кой реакционной способностью и, например, лег-

ко взаимодействует с аминами и многими другими

веществами. В малых концентрациях он губитель-

но действует на вирусы, бактерии и грибы, особен-

но — при повышении температуры, однако водные растворы его

быстро инактивируются при комнатной температуре. Р-Пропио-

лактон токсичен для кожи, агрессивен в отношении некоторых

металлов и многих пластмасс, в повышенных концентрациях про-

являет свойства мутагена. Поэтому в биологической технологии

его не следует применять в качестве стерилизующего агента.

В лабораторных и производственных условиях иногда приме-

няют ультразвуковые установки, например, для мойки посуды

(частота звука здесь выше 20000 щ). В случае распространения

звука в воздухе за нулевую отметку принимают порог нормальной

слышимости 1000 гц. Более высокие величины оценивают в деци-

беллах — дц [от франц. decibel — единица акустической (электри-

ческой) мощности, равная 0,1 бела и принятая в электроакустике],

и если этот показатель выше ЮОдц, то звук оценивается вредным

для людей и от такого звука следует экранировать занятых в

соответствующих производствах операторов (особенно — при

длительном воздействии). Ультразвук можно использовать для

выделения некоторых действующих веществ из растений (напри-

мер,

алкалоиды), антигенов из некоторых бактерий.

Тем не менее, ультразвуковые генераторы не нашли широкого;

распространения в биотехнологии, хотя в отдельных исследовани-

ях было показано, что с помощью ультразвука можно стимулиро-

260

вать рост клеток, гасить пенообразование в биореакторах при

ферментациях и т. д.

Для обработки стен некоторых помещений, мебели — можно

использовать катионные поверхностно-активные вещества—ПАВ,

проявляющие губительное действие в отношении широкого спек-

тра микроорганизмов. Растворы ПАВ можно применять не только

для протирания стен и мебели, но, например, в боксированных

помещениях заблаговременно распылять в виде аэрозолей (до

прихода оператора).

Во избежание микробного загрязнения биотехнологических

производств используют и специальные меры, как то медицинский

осмотр персонала работниками медицинской службы предприятия

и СЭС в целях выявления заболевших и носителей патогенной и

условно патогенной микрофлоры и для исключения микробного

загрязнения ими целевых

продуктов;

контроль за водоснабжением,

особенно — на тех производствах, в которых воду забирают из

открытых водоемов; предупреждение попадания микробов в скла-

ды готовой продукции — здесь наиболее эффективен способ

подачи воздуха через приточные вентиляционные устройства, в

которых предусмотрена фильтрация. поступающего воздуха в

складские помещения.

6.4. Биотехнологические процессы в связи с массообменом.

Принято считать, что диффузионные процессы, протекающие в

биореакторах, не накладывают заметных ограничений на макси-

мально проявляющуюся функциональную активность клеток и

клеточных структур; главное при этом — поддержание массооб-

мена (и прежде всего — кислорода в системе "газ-жидкость"

применительно к аэробным организмам) на оптимальном уровне.

При выращивании биообъекта в реакторе образуется сложная

система массопереноса

О2,

а именно

"газ-жидкость-твердое тело",

понимая под твердым телом биообъект. Названная тройная система

легко расчленяется на три самостоятельные системы: "газ-жид-

кость", "жидкость-жидкость" и "жидкость-твердое тело". Это мож-

но продемонстрировать следующим образом (рис. 77).

Перемещение О2 в этих системах неравноценно по интенсив-

ности и зависит от растворимости газа в жидкой фазе, от мощности

барботажа, размера пузырьков, скорости вращения вала и формы

мешалки, химического состава питательной среды, температуры,

толщины невозмущаемых слоев жидкости вокруг газового пузырь-

ка и клетки, от наличия и химического состава калсул, толщины

и особенностей клеточной стенки и клеточной мембраны биообъ-

екта и некоторых других причин.

261

Рис.

77.

Системы, образующиеся в биореакторе

(8)

при массопереносе кислорода

(1) из среды (4) в клетку-продуцент (5); 2 — невозмущаемый слой жидкости, 3 —

пограничная область раздела фаз "газ-жидкость", 6 — пограничная область раздела

фаз "ж"идкость-твердое тело", 7 — условный путь перемещения Ог в системе

"жидкость-жидкость" от (1) до (5), где он расходуется в биохимических реакциях.

Из

рис.

можно сделать

вывод,

что зона

вокруг клетки может

не формироваться в случаях образования ее вокруг пузырька и

клетки одновременно. Тогда и путь перемещения О2 от газового

пузырька в клетку сокращается, а его содержание в жидкой фазе

(4) не будет коррелировать со скоростью поступления его в клетку

для поддержания реакций биологического окисления (в ряде слу-

чаев 02 выступает химическим реагентом, обеспечивающим био-

трансформацию, например, глюкозы в 5-кетоглюконовую кислоту

с помощью уксуснокислых бактерий). Следует иметь в виду, что

при избытке растворенного кислорода проявляется его токсиче-

ское действие на биообъект. Вот почему желателен автоматический

контроль за поддержанием оптимальных концентраций Ог в среде

для соответствующих культур. Теперь известны РО-статы (прибо-

ры для поддержания необходимого уровня растворимого О2),

обеспечивающие подобный контроль.

Если молекула кислорода приобретает дополнительный (экс-

тра-) электрон, то образуются свободные кислородные радикалы:

супероксидный (О?), гидроксильный (НО) и синглетный кислород

('Ог). Эти радикалы — потенциальные деструкторы липидов, бел-

ков,

нуклеиновых кислот. В частности, к ним чувствительны кле-

точные мембраны, в которых первичной мишенью выступают

липиды, протоны которых взаимодействуют с,радикалами и насту-

пает так называемая "липидная пероксидация" с образованием

пероксидов. Свободнорадикальное повреждение мембраны схема-

тично представлено на рис. 78.

262

777¾

Sfv.

ooe"

-^-¾^%¾

ООН

--1^7 СУ \j Рис- '8. Поперечный срез клеточной

^\- —

jjj"' л. мембраны, повреждающейся от свобод-

jjL~

>-tjv /TN ^

J но-радикальных процессов, индуцируе-

j^y-rCC^

Ч_У t^~~y мых супероксидным и гидроксильными

^^jee^w^ ОН ^^'Ч^'я радикалами, синглетным кислородом:

—

ядро,

2 — нарушенные белковые нити, 3

— перекрестное связывание липидов, 4

-^ г*' - \ \ I \ — липидно-протеиновое перекрестное

ч г

/ Чр связывание, 5 — поврежденный мемб-

=" ранный липид.

Известно, что с возрастанием температуры окружающей среды

растворимость кислорода в воде уменьшается. Так, например, при

35°С и давлении кислорода в воде 1,01

•

105 Па его растворимость

составляет 1,09 ммоля/л или в соотношении

1:28600;

при 20°С

растворимость возрастает до 1,38 ммоля/л или в соотношении

1:22640;

при 14°С в воде растворяется 1,5 ммоля/л О2 или в

соотношении

1:21000.

В одномолярном растворе натрия хлорида

при 25°С растворяется 0,89 ммоля Ог/л или в соотношении порядка

1:35000.

Таким образом, для переноса кислорода из одной фазы в другую

(см.

рис. 77) необходимо добиться разницы его концентрации в

разных фазах с преобладанием в направлении слева направо, то

есть от газового пузырька к клетке. Но поскольку растворимость

0-2

в воде и водных растворах мала, постольку необходимо подавать

его в биореактор в несколько повышенных количествах, добиваясь

указанной разницы в фазовых системах. При этом достигается

некая критическая концентрация кислорода в культуральной сре-

де,

когда все аэробные клетки насыщаются О2. Для клеток микро-

организмов показатели таких концентраций приходятся на диапа-

зон 0,003—0,05 ммоля/л (примерно 0,1—10% наибольшей раство-

римости

С>2

в воде) или, применительно к воздуху, от 0,5 до 50%-го

насыщения. Так, для клеток кишечной палочки критическая кон-

центрация растворенного кислорода составляет 0,0082 ммоля/л при

38°С,

для пеницилла

—

продуцента пенициллина при 24°С — около

0,022

ммоля/л, для Saccharomyces cerevisiae при 20°С - 0,0037

ммоля/л.

Для некоторых нитчатых грибов, например, Myxothecium

verrucaria, удельная потребность в кислороде становится наивыс-

шей в начале Log-фазы размножения клеток, хотя плотность

263

клеточной биомассы продолжает нарастать. В то же время общая

потребность в Ог достигает максимума в конце Log-фазы и начале

const-фазы, то есть удельная скорость размножения клеток дости-

гает своего пика раньше, чем скорость использования (¾.

Скорость переноса кислорода (Оог) рассчитывают на единицу

объема биореатора, исходя из отношения произведения плотности

потока и площади поверхности раздела фаз (газ-жидкость) к

« - - л, ^_ Ki(Ci-Ci)A

объему жидкой фазы в реакторе, то есть 0о

= ~ , где Kj

— коэффициент массопередачи, С; — концентрация растворен-

ного вещества в жидкой фазе, находящейся в равновесии с газовой

фазой, А — площадь поверхности раздела фаз "газ-жидкость", V

— объем жидкой фазы. Если весь кислород, поступающий в

жидкую среду, быстро усваивается клетками, тогда Q=0 и мас-

сообмен кислорода здесь максимален.

Средняя объемная скорость поглощения О2 (Q02 моль

•

с/л) в

объеме V выражается уравнением:

Когда гидродинамические условия в биореакторе, концентра-

ция

С>2

и отношение площади поверхности раздела фаз к объему

одинаковы, тогда Qo

равна Qo

Обычно при вполне благоприятном аэрировании среды кон-

центрация клеток в биореакторе может достигать величины 10

/мл.

Исходя из усредненных размеров клеток бактерий по диамет-

ру 1 мкм, дрожжей — 7 мкм, нитчатых грибов » 20 мкм объемы

их в процентах к объему среды составят около 0,005, 1,8 и 2

соответственно, то есть бактериальная масса будет примерно в 400

раз меньше грибной массы. Удельная поверхность раздела всех

клеток будет 3,1 см

/см

- для бактерий, 153 см

/см

- для дрожжей

и 40 см

/см

— для нитчатых грибов. Следовательно, эффективная

поверхность в данных примерах будет больше у дрожжей. Поэтому

адекватная доставка кислорода — как лимитирующего фактора

зависит

от

морфофункциональных особенностей культивируемого

биообъекта и условий его выращивания.

На скорость потребления кислорода биообъектом влияют:

1) возраст культуры (делящиеся, или размножающиеся клетки

потребляют кислорода больше, чем не делящиеся);

2) межклеточная адгезия, когда при выраженной адгезии обра-

264