Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

дение зародышевых клеток; раздражение слизистых оболочек,

кожи и в месте введения вещества; мутагенность, т ератогенность

—

От

греч.

teratos

—

чудовище, урод; цитотоксичность), на безопас-

ность для макроорганизма при введении in vivo (абсорбция, рас-

пределение, скорость выведения, метаболизм); проводят фармако-

логические испытания с оценкой фармакокинетики (действие

изучаемого лекарственного вещества на организм) и фармакоди-

намики (изучение силы действия лекарственного вещества).

В связи с необходимостью проведения названных испытаний

создают специальные группы: общую (в том числе для контроля за

гигиеной и санитарией личного состава), микробиологическую,

метаболизма, общефармакологических испытаний, общих клини-

ческих исследований, патологоанатомическую, проведения экспе-

риментов на животных, обработки данных (с включением управ-

ления ЭВМ), по приготовлению проб, аналитическую, по управле-

нию исследованием

и,

при необходимости,

другие.

Во

главе каждой

группы утверждается руководитель, который не должен совмещать

свои прямые обязанности с работой в группе инспекций.

Соблюдение требований системы GLP должно быть подкреп-

лено совершенством организации всех вспомогательных служб и

достаточным материальным обеспечением. Желательно иметь от-

дельное здание для проведения биологических испытаний, где

экспериментальные животные размещались бы в помещениях

соответствующих классов: для гнотобионтов, зараженных, конт-

рольных, предназначенных для работы с радиоизотопами, для

карантинизации и т. д.

работе с животными должны учитываться все инфекционные

заболевания, которые могут сказаться на результатах эксперимен-

тов.

При этом необходимо иметь в виду и тот факт, что отдельные

возбудители инфекционных заболеваний могут передаваться от

человека к животным и наоборот. К их числу относятся вирусы

бешенства, лимфоцитарногохориоменингита, шигеллы, некоторые

бруцеллы (Brucella

canis),

сальмонеллы, микобактерии туберкулеза,

токсоплазмы (Toxoplazma gondii), дизентерийная амеба.

Одобренный препарат (вещество) после лабораторных пред-

клинических испытаний по системе GLP и последующей клиниче-

ской проверки разрешается к выпуску в условиях промышленного

производства. Для обеспечения изготовления высокого качества

продукта Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) еще в

1968 г. утвердила "Требования для практики качественного произ-

285

водства при изготовлении и контроле качества лекарств и к

специалистам в области фармации". Годом позже эти требования,

вошедшие (с небольшими уточнениями и изменениями) в правила

системы GMP (Good Manufacturing Practice) были рекомендованы

Ассамблеей ВОЗ для международной торговли, а в 1971 г. они были

изданы в качестве приложения ко второму изданию Международ-

ной Фармакопеи.

GMP — это единая система требований пЪ контролю качества

<•

лекарственных средств с начала переработки сырья до производ-

ства готовых препаратов, включая общие требования к помещени-

ям,

оборудованию и персоналу. С

1975

г.

правила GMP расширены,

и они касаются различных химических и биологических веществ

в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых

в животноводстве; исходных материалов для использования в

дозированных формах, если они включены в законодательства

стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации

о безопасности и эффективности перечисленных веществ, мате-

риалов и препаратов.

С учетом издания в 1987 г. руководств Международной Орга-

низации Стандартизации (ISO) серии ISO 9000—9004 по системам

качества возникла необходимость пересмотреть существовавшие

требования GMP.

сентябре 1991 г. на специальной конференции

по GMP в г. Москве представлен пересмотренный проект требо-

ваний GMP, включающий три части:

1) "Управление качеством в промышленном производстве ле-

карственных средств: философия и основные составляющие";

2) "Практика качественного производства и контроль качества";

3) "Дополнительные и вспомогательные направления".

Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации

контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заклю-

чения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления

необходимой документации и др.

Вторая часть содержит два раздела — производство и контроль

качества. Применительно к производству лекарственных средств

указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения

методов ведения технологического процесса согласно норматив-

но-технической документации с целью получения продукта требу-

емого качества и в соответствии с разрешением на его изготовле-

ние и продажу. По возможности избегать любых отклонений от

методик или инструкций. При наличии таких отклонений необхо-

286

димо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначен-

ного ответственного лица, а при необходимости — привлечение

службы отдела контроля качества.

Операции с различными продуктами не должны выполняться

одновременно и последовательно в одном и том же помещении

пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загряз-

нения.

Доступ в производственные помещения должен быть ограничен

лишь определенным кругом лиц, занятых в производстве. Избегать

изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудова-

нии, предназначенных для изготовления фармацевтической про-

дукции. При работе с сухими материалами и продуктами необхо-

димы меры предосторожности для предупреждения возникнове-

ния, накопления и распространения пыли, что может привести к

перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их

микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на

частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при

изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи

работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть пред-

отвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздель-

ных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАВ) или, по

крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспе-

чением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защит-

ной технологической одежды; использованием средств эффектив-

ной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием

"закрытых систем" производства и т. д.

Необходимо проверять правильность и надежность сочленения

трубопроводов и другое оборудование, используемое для транс-

портировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую.

Дистиллированная или деионизированная вода, поступающая по

трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим

нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ре-

монту не должны сказываться на качестве продукции.

Контроль качества продукции касается процесса забора проб,

проведения исследований, документации и пр. Все исследования

должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для

каждого материала или продукта.

Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить

их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказываю-

щемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый

287

материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора.

' Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься

лабораторная документация с подтверждением соответствия ко-

нечного продукта спецификациям.

Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на

хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года,

превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком

количестве, чтобы можно было при необходимости провести как

минимум два повторных исследования.

Третья часть требований GMP включает разделы о стерильных

фармацевтических продуктах и практике качественного производ-

ства основной массы лекарственных субстанций.

Необходимо помнить

том,

что лица, обладающие повышенной

чувствительностью к конкретному веществу

—

действующему или

вспомогательному, не должны включаться в группу исполнителей.

Для них допустима работа в отделении или цехе упаковки, где

исключен контакт с аллергеном.

В 1991 г. правила GMP утверждены.в нашей стране примени-

тельно к производству и контролю качества лекарственных

средств. Эти правила соответствуют Международной Системе

GMP и включают следующие разделы: введение, терминология,

персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производ-

ства, отдел технического контроля, аттестация и контроль произ-

водства; выделены требования к стерильным лекарственным сред-

ствам и описаны особенности их производства.

Соблюдение правил GMP обеспечивает выпуск качественных

продуктов и гарантирует благополучие потребителей.

В 1995

г.

ВСЗЗ

планирует утвердить GPP (Good Pharmacy Practice) по предложе-

нию Международной Фармацевтической Федерации (FIP).

Глава 7.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ВООРУЖЕННОСТЬ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

В большинстве случаев биотехнологические процессы

рассчитаны на использование живых клеток и тканей различного

происхождения, и даже в инженерной энзимологии применение

молеклул ферментов сопряжено с рядом ограничений, присущих

288

живым клеткам или тканям. К их числу относят поддержание

оптимальных температуры (достаточно низкой), рН, стерильности,

концентрации растворенного кислорода (в случаях эксплуатации

биообъектов

—

аэрофилов). Микробные клетки, за редким исклю-

чением (например, микоплазмы), и клетки растений имеют кле-

точную стенку , которой не обладают клетки животных организ-

мов;

вирусы как организованные частицы реплицируются и пара-

зитируют на живых культурах клеток или в тканях, поэтому

отмеченные выше ограничения относятся больше к этим послед-

ним, а не к вирусным частицам. Наличие клеточной стенки у

биообъекта заведомо обеспечивает ему более высокую устойчи-

вость в различных условиях существования, чем биообъектам,

лишенным клеточной стенки. Даже при большой густоте, напри-

мер,

бактерий, они активно размножаются, если им обеспечива-

ются достаточные пищевые потребности.

Вирусам

—

как облигатным паразитам

—

присуща еще и весьма

высокая специфичность применительно к организмам-хозяевам

(вирусы бактерий, грибов, растений, животных) и, даже тканям

(вирусы бешенства и полиомиелита

—

в отношении нервной ткани,

вирус оспы — в отношении кожи, аденовирусы — в отношении

железистой ткани).

Таким образом, особенности биообъектов обусловливают сле-

дующие принципы технического оснащения -биопроизводств:

конструкционное совершенство и относительная универсаль-

ность биореакторов;

инертность, или коррозионная стойкость материалов биоре-

акторов и другого технологического оборудования, вмещающих

биообъект или контактирующих с ним или продуктами его мета-

болизма;

эксплуатационная надежность технологического оборудова-

ния;

доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены,

смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами

узлов и соответствующих частей оборудования.

Эти принципы рассматриваются более подробно в самостоя-

тельной научной дисциплине "Процессы и аппараты биотехноло-

гии", или "Биоинженерия". В настоящем учебнике они изложены

в объеме, необходимом для целостного восприятия общих и спе-

циальных разделов биотехнологии, и данная глава, в основном,

посвящена биореакторам.

Шт. 8524 289

Согласно первому принципу желательно конструировать такие

биореакторы, которые можно использовать для реализации био-

технологических процессов, основанных на использовании разных

биообъектов (бактерий, грибов, клеток растений и млекопитаю-

щих).

Под совершенством и относительной универсальностью

следует понимать возможность создания оптимальных условий

культивирования разных биообъектов в одном и том же биореак-

торе с автоматическим регулированием заданных параметров.

Многоцелевые реакторы высоких стандартов изготавливает нидер-

ладская фирма ADI (Applikon Dependable Instruments). Они при-

годны для флокулирующих организмов, иммобилизованных клеток

(микробных, растительных, животных) в целях повышения выхода

биомассы и достижения их выраженной продуктивности.

Чтобы обеспечить биореакторы компьютерным контролем,

фирма ADI выпускает биопроцессор, с помощью которого обеспе-

чивается полное регулирование заданных параметров в течение

роста биообъекта (рис. 85).

Рис.

85. Многоцелевой биопроцессор ADI 1020 Рис.

86.

Циклонный колон-

с компьютерным контролем различных параметров ный ферментатор (схема).

во время культивирования биообъектов.

Заманчивой представляется конструкция ферментатора в виде

циклонной колонны (рис. 86), создающей возможность проведения

периодических, непрерывных и фазовых ферментации, и обеспе-

290

чивающей новые подходы к оценке клеточных циклов и поведению

самих клеток.

Поддержание заданных параметров — дело не простое, когда

непрерывно изменяются условия культивирования биообъекта

вследствие многокомпонентности исходной питательной среды и

культуральной жидкости на заключительной стадии ферментации,

изменения рН в процессе роста, размножения и развития биообъ-

екта, сложности регуляторных механизмов при биосинтезе целе-

вых продуктов, к тому же возможно — нестабильных, различный

уровень структурно-функциональной дифференцировки акариот,

прокариот и эукариот, и пр. Лишь при эксплуатации в колоннах

иммобилизованных ферментов аппаратурное оформление техно-

логических процессов существенно отличается от оформления

процессов, когда используют, прежде всего, специальные биоре-

акторы.

Второй принцип технического оснащения касается инертности

материалов, используемых для изготовления биореакторов и дру-

гого технологического оборудования. Это означает, что в процессе

культивирования биообъекта как будто не будет происходить его

взаимодействия (равно как и продуктов метаболизма) с металли-

ческими и неметаллическими конструкциями, постоянно или вре-

менно находящимися в контакте с ним.

Реально при выборе конструкционных материалов фермента-

торов необходимо учитьшатьтот факт, что эти аппараты в процессе

работы подвергаются механическим, химическим и физическим

(тепловым) воздействиям. Стерилизацию ферментаторов осущест-

вляют острым паром при 127—130°С с последующим охлаждением

до 24—28°С. В результате непрерывной аэрации культуральной

жидкости внутренние поверхности аппаратов испытывают посто-

янное окисляющее действие кислорода; кроме того, развитие

продуцента сопровождается выделением в среду агрессивных ме-

таболитов (например, органических кислот).

Весьма существенно также влияние на стенки аппарата интен-

сивных газожидкостных потоков, кавитации, вибрации; содержа-

ние в среде абразивных примесей—частиц масла и муки

—

создает

дополнительный истирающий эффект.

Для обеспечения стерильности необходима систематическая

обработка аппарата моющими средствами и антисептиками (рас-

творами триполифосфата, хлорамина, формалина).

Материалы, идущие на изготовление ферментационного обо-

291

рудования, должны быть химически стойкими и не подвергаться

коррозии в течение длительного времени эксплуатации. Корро-

зия (от лат. corrosion

—

разъедание) — это процесс молекулярного

разрушения материала (ограниченного — локального или распро-

страненного) под воздействием внешних факторов. Коррозионные

процессы можно подразделить на 3 большие группы: химическая,

физическая (электрохимическая) и биологическая коррозии. Хи-

мическая коррозия индуцируется сухими газами и жидкостями,

неспособными проводить электрический

ток.

Физическая— (элек-

трохимическая) коррозия имеет место в случаях возникновения

местных электрических токов — гальванокоррозия, например, в

конструкциях, где контактируют несколько металлов с разными

электродными потенциалами (электролиты здесь особенно благо-

приятны для протекания электрохимической коррозии). Возник-

новение такой коррозии возможно даже при неоднородности

одного и того же металла в случае его неравноценной обработки

на отдельных участках.

Биологическая коррозия обусловливается биологическими

объектами (бактериями, микромицетами и другими организмами).

По.

механизму развития биокоррозию можно отнести к химиче-

ской. Однако наличие биообъекта в среде и на объекте коррозии

привносит дополнительный фактор — клеточную биомассу (фак-

тор обрастания или/и зарастания). Поэтому биокоррозия нередко

сопрягается с биоповреждением. Биоповреждение — понятие

более широкое, чем биокоррозия;

. биоповреждение

биокоррозия механическое

(химическая (физическое)

молекулярная повреждение

деструкция конструкции (аппарата,

материала) прибора, сооружения)

биообъектом

Коррозии подразделяют еще по средам, где они протекают:

атмосферная, почвенная.водная; по распространенности

— ограниченная и распространенная

(поверхностные, сквозные); по локализации: ножевая (по

сварным швам), межкристаллитна я, послойная.

Интенсивность коррозионных процессов оценивают в так на-

зываемых массовом (К

) и глубинном (D) показателях. Первый из

292

i них рассчитывают в случаях неравномерной коррозии, исходя из

I уменьшения массы материала, в кг на 1 м

поверхности за 1 час:

-~sT~'

i где М — масса материала до (Mi) и после (Nfe) коррозии, S —

поверхность материала (м

), t — длительность коррозии в часах.

I Глубинный показатель оценивают при равномерной коррозии

I по уменьшению толщины металл в мм за год:

1 Kin-24-365-1000 • -

ТЛ

D 5 ( р плотность металла, кг/м ). Исходя из

оценочных показателей К

и D, выделяют группы стойкости

металлов. Например, D более 10, металл оценивают баллом 9 и

относят к разряду нестойких (группа VI); D менее

0,001,

металл

оценивают баллом 0 и относят к совершенно стойким (группа 1).

Весьма стойкие и просто стойкие металлы характеризуются соот-

ветственно следующими показателями:

= 0,001 —0,005 (1 балл)

и 0,005 — 0,01 (2 балла) — II группа;

= 0,01—0,05 (3 балла) и

0,05—0,1 (4 балла) — III группа. Очевидно, что в различных средах

стойкость одного и того же материала к коррозии различна.

В биотехнологии, где среды чаще не агрессивны, применяют

обычные углеродистые стали с повышенной прочностью и выра-

женной упругостью. Нержавеющая сталь сохраняет большую стой-

кость в условиях атмосферной коррозии.

Крупнейшие отечественные заводы антибиотиков были осна-

щены ферментаторами из углеродистой стали марки

Ст-3.

Однако

по отношению к углеродистой стали культуральные жидкости

оказались агрессивными. По данным ВНИИА скорость коррозии

стали марки Ст-3 достигает 0,2—0,4 мм/год; по стандартной клас-

сификации такой показатель соответствует 6 баллам, т. е. харак-

теризует материал пониженной стойкости. При этом происходит

не только уменьшение толщины стенок аппаратов, но возможно

также появление раковин и каверн. Железо, попадая в среду,

подавляет активность ферментов продуцента, угнетает биосинтез,

инактивирует некоторые антибиотики.

Несмотря на коррозию, возможность использовать стальные

ферментаторы обусловлена образованием на внутренних поверх-

ностях аппаратов пассивирующей пленки, которая состоит из

окислов железа и веществ, выделившихся из среды. Эта пленка

замедляет коррозию.

Хорошо удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к

293

материалам для ферментационной аппаратуры, хромоникелевая

нержавеющая сталь марки Х18Н10Т, которая содержит 0,01%

углерода,

18%

хрома, 10% никеля и менее 1% титана. Аппараты из

этой стали долговечны, удобны в эксплуатации, "универсальны",

то есть пригодны для производства любых антибиотиков, витами-

нов,

ферментов и других БАВ. Однако высоколегированная сталь

очень дорога, поэтому ферментаторы вместимостью 32 м

и более

изготовляют из двухслойной стали: корпус — из

Ст-3,

внутренний

тонкий слой — из хромо-никелевой стали.

Обычно кислотоустойчивые и нержавеющие стали — это спла-

вы железа с хромом и легированные в целях улучшения их

сопротивляемости молибденом, никелем, титаном, марганцем и

другими элементами. Содержание углерода в них порядка 0,15%.

Жаропрочные стали включают железо, хром, никель; их исполь-

зуют для изготовления арматуры печей, муфелей, воздухоподогре-

вателей. Вольфрам и молибден используют в качестве легирующих

веществ.

В биотехнологии также широко применяют чугун, из которого

делают компрессоры, поршневые кольца, рамы фильтрпрессов и

др.;

некоторые чугунные аппараты покрывают эмалью. Хром,

никель, молибден — как легирующие элементы повышают жаро-

стойкость и химическую стойкость чугуна. Такой чугун полезен,

например, для изготовления отдельных частей барабанных суши-

лок, работающих при повышенных температурах.

Различные конструкции, используемые во многих аппаратах,

состоят из алюминия (или включают его). Этот металл быстро

подвергается электрохимической коррозии, но вследствие легко

образующейся окисной защитной

пленки,

дальнейшее разрушение

алюминия прекращается. Продукты его коррозии неядовиты.

Стекло, полиэтилен, "пищевая" резина и другие полимерные

материалы также широко используют в биотехнологических про-

цессах.

Защиту материалов от коррозионных процессов осуществляют

различными способами: применяют специальные ингибиторы хи-

мической и биологической коррозии, катодную и протекторную

защиту- от электрохимической коррозии.

Третий принцип технического оснащения биопроизводств ка-

сается эксплуатационной надежности технологического оборудо-

вания. Эта надежность обеспечивается соответствием аппаратов,

приборов и другого оборудования целевому назначению, в част-

ности, по конструкционному совершенству, полностью обеспечи-

294