Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

приведение в порядок, устройство, nomos — закон) являются

достаточно устоявшимися, однако предлагаемые разными автора-

ми классификационные схемы весьма многочисленны и, порой, во

многом

различны.

этой связи целесообразно и научно оправданно

придерживаться следующей схемы. Царство грибов включает два

отдела — Myxomycota и Eumycota, то есть грибы-слизевики (от

греч. туха — слизь) и настоящие грибы (от греч. ей — хорошо, в

смысле — типичный, хорошо развитый). Первые из них немного-

численны и представлены "голой" плазменной массой — плазмо-

дием. Они претерпевают своеобразный цикл развития и образуют

половые аттрактанты (от лат. attractio — притяжение, тяготение).

Отдел эумицетов включает 7 классов: Chytridiomycetes,

Hyphochytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes,

Basidiomycetes и Deuteromycetes. К хитридиевым (от греч.

chytridion — капелька, что отражает содержание капли жира в

зооспорах) относится более 500 видов грибов, в основном пред-

ставленных плазмодиальными образованиями, то есть у них пол-

ностью отсутствует мицелий, а если он есть, то находится лишь в

зачаточном состоянии. Зооспоры и планогаметы (клетки размно-

жения) располагают только одним задним бичевидным (плетевид-

ным) жгутиком, что имеет определенное таксономическое значе-

ние.

Гифохитридиевые имеют зооспоры с одним передним биче-

видным жгутиком, нити их не имеют перегородок, класс представ-

лен немногими видами.

Оомицеты также включают свыше 500 видов. Это водные

грибы, объединяемые на основании оогамии

—

полового процесса.

Бесполые зооспоры их обладают двумя разными жгутиками, один

из которых передний сверкающий (блестковидный, перистый),

другой — задний бичевидный.

Зигомицеты, включающие свыше 500 видов, полностью утра-

тили подвижные стадии в циклах развития. Половой процесс у них

— зигогамия. Мицелий, как правило, хорошо развит

и,

в основном,

без перегородок.

Нередко, в отечественной и зарубежной учебной и научной

литературе все, преимущественно водные, грибы (включая и "вы-

шедших на сушу" зигомицетов) объединяют в один класс

Phycomycetes (от греч. phycos — водоросль). Все водные грибы

либо лишены мицелия, либо он в зачаточном или развитом состо-

янии, но не имеет перегородок (септ) или они редкие — такие

грибы относят к низшим. Нитчатые грибы с перегородками в

2 т. 8524 33

мицелии относят к высшим. Не путать эти понятия с понятиями

совершенные и несовершенные грибы, из коих первые обладают

половым процессом размножения, вторые — не обладают им.

Например, Mucor rouxii является НИЗШИМ совершенным грибом, а,

например, Stilbella aurantica является высшим несовершенным

грибом.

Следовательно, к высшим грибам относят аскомицеты, или

сумчатые грибы; базидиомицеты, или базидиальные грибы и дей-

теромицеты, или несовершенные грибы (Fungi imperfecti).

Сумчатые грибы — наиболее обширный класс, включающий

свыше 15 000 видов самых различных строения, формы и место-

обитания. Отличительным признаком их являются сумки, образу-

ющиеся на аскогенных гифах в результате полового процесса. В

сумках формируются половые споры, с помощью которых они

размножаются. Чаще образуется 8 спор, хотя нередки и исключе-

ния из этого правила. Мицелий у них септированный (от

лат.

septum

— перегородка), в септах имеются центральные поры, обеспечи-

вающие сообщения между клетками и обмен клеточным содержи-

мым.

Сформировавшиеся сумки образуют плодовые тела, которые

могут быть закрытыми (клейстотеции, или клейстокарпии, от лат.

cleistos — могущий закрываться, смыкающийся; teke — капсула,

покрышка, мешок; carpos — плод), грушевидными с круглой по-

рой-остиолой наверху —перитеции (от греч. peri — вокруг) и

открытыми блюдцевидными или чашевидными апотециями (от

греч. приставки аро — со значением удаления или отделения,

обратности или возвращения и др.). Для сумчатых грибов харак-

терно и бесполое размножение с помощью конидий, образующих-

ся на гаплоидном мицелии. Следовательно, в цикле развития

аскомицетов имеются половые и бесполые стадии (рис. 2).

Базидиальные грибы. Насчитывается свыше 30 000 видов ба-

зидиомицетов (от греч. basis — основание), различающихся боль-

шим разнообразием по строению, форме и размерам.-Для базиди-

омицетов так же характерны половая и бесполая стадии развития.

Первая завершается формированием базидии — репродуктивного

органа, на котором образуются, как правило, по 4 споры (базиди-

оспоры), сидящих на стеригмах. Бесполая стадия кратковременна

— она представлена прорастающими трубками спор и позже —

дикариотическим мицелием. Из этого последнего возникает пло-

довое тело — базидиокарп, на котором затем образуются базидии.

Для многих базидиомицетов характерны пряжки (рис. 3), об-

разующиеся на мицелии и участвующие в синхронном процессе

деления ядер, а в мицелиальных септах — долипоры (см. рис. 32).

Антеридий

(+)

Аскоспоры

Рис.

2. Цикл развития аскомицетов на примере Pyionema species:

1-мицелий,

2-ко-

нидии, образующиеся на гиплоидном мицелии, 3-( +

)

и (-) типы спаривания (соот-

ветственно мужские и женские клетки), 4-аскогенные гифы (а-д),

5-сумки

со спо-

рами, 6-аскоспоры.

Дейтеромицеты (от греч.

deiteros — второй) — сбор-

ный класс грибов, поскольку

в него включены все те пред-

ставители микромицетов, у

которых не обнаружен поло-

вой процесс развития. Если

же половая стадия выявляет-

ся,

то такой гриб сразу же

переносят в соответствую-

щий ему класс.

Насчитывают многие тысячи видов несовершенных грибов. Им

присущ хорошо развитый септированныи мицелий и конидиальное

(бесполое) спороношение. У несовершенных грибов могут иметь

место гетерокариоз и парасексуальный цикл.

Лишайники (от лат. Lichenes) — это естественные симбионты

грибов (микобионтов) и водорослей (фикобионтов) или грибов и

цианобактерий (бактериобионтов). Лишайники выделяют в само-

стоятельную группу организмов, изучаемую в специальной науч-

Рис.

3. Пряжки у базидиальных грибов.

ной дисциплине—лихенология.

настоящее время известно около

30 000 видов лишайников. Микобионтами у них выступают пре-

имущественно аскомицеты (исключительно редко — базидиоми-

цеты),

фикобионтами и бактериобионтами — зеленые и желто-зе-

леные водоросли, цианобактерии. Называют лишайники по мико-

бионту. Лишайники подразделяют по форме на листоватые (в том

числе — кочующие), кустистые и корковые (накипные). Размно-

жаются они бесполым (кусочками, конидиями) и половым путем

за счет микобионта (рис. 4).

Рис.

4. Лишайники: корковый или накипной - 1, листоватый - 2, кустистый - 3,

кочующий - 4.

Из сказанного можно составить представление о том, что

потенциальных биообъектов для использования в производстве

самых различных веществ обильное множество и большинство из

них лежит пока нетронутым кладом для будущих поколений кла-

доискателей.

2.4 Растения. Царство растений Plantae включает подцарства

багрянок (Rhodophyta), водорослей (Phycophyta) и высших расте-

ний (Embryophyta). У первых двух нет дифференциации тела на

органы и ткани — они представляются слоевищем (thallus) и

обитают главным образом в воде. Тело высших растений расчле-

нено на органы и ткани. К настоящему времени насчи-

тывают сотни тысяч видов растений, многие из которых исполь-

зуют в различных отраслях народного хозяйства.

Для растений характерны: способность к фотосинтезу, наличие

целлюлозы, биосинтез крахмала.

2.4.1.

Водоросли. К водорослям относятся: багрянки,

пиррофитовые, золотистые, желто-зеленые, эвгленовые и харовые.

Как правило, водоросли являются водными организмами, их на-

считывают около 100 000 видов. Все они пигментированы за счет

хлорофилла, каротиноидов, ксантофиллов, фикобилинов. Водорос-

ли — важный источник различных полисахаридов и других био-

логически активных веществ. Размножаются они вегетативно,

бесполым и половым путями. Как биообъекты используются недо-

статочно, хотя, например, ламинария под названием морской

капусты производится промышленностью различных стран. Хоро-

шо известны агар-агар и альгинаты, получаемые из водорослей.

2.4.2.

Клетки высших растений. Высшие растения

(порядка 300 000 видов) — это дифференцированные многоклеточ-

ные,

преимущественно наземные организмы. Способы их беспо-

лого и полового размножения хорошо описаны в учебниках бота-

ники. В процессе дифференциации и специализации клетки рас-

тений группировались в ткани (простые — из однотипных клеток,

и сложные — из разных типов клеток). Ткани, в зависимости от

функции, подразделяют на образовательные, или меристемные (от

греч. meristos

—

делимый),

покровные, проводящие, механические,

основные, секреторные (выделительные). Из всех тканей лишь

меристематические способны к делению и за их счет образуются

все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем

должны быть включены в биотехнологический процесс (см. спе-

циальную часть),

Клетки меристемы, задерживающиеся на эм-

бриональной стадии развития в течение всей

жизни растения, называются инициальными,

другие постепенно дифференцируются и превра-

щаются в клетки различных постоянных тканей

— конечные клетки.

В зависимости от топологии в растении мери-

стемы подразделяют на верхушечные, или апи-

кальные (отлат. apex — верхушка), боковые, или

латеральные (от лат. lateralis — боковой) и про-

межуточные, или интеркалярные (от лат.

intercalaris — промежуточный, вставной) (рис. 5).

В 1902

г.

Г. Хаберландт впервые сделал попыт-

ки культивировать клетки растений. В середине

текущего столетия промышленное производство

декоративных и плодоовощных культур в ряде

стран мира базировалось преимущественно на

Рис.

5. Меристемы

растительные: вер-

хушечные — 1,бо-

ковые — 2, проме-

жуточные — 3.

методе культур тканей и органов растений — были получены линии

с заданными характеристиками. Здесь следует отметить, что Г.

Хаберландт впервые выдвинул гипотезу о тотипотент-

н о с т и любой живой клетки растения. Тотипотентность — это

свойство соматических клеток растений полностью реализовать

свой потенциал развития вплоть до образования целого растения.

Любой вид растения может дать в соответствующих условиях

неорганизованную массу делящихся клеток — каллус (от лат. callus

— мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных

гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регене-

рацией побегов пригодно для крупномасштабного производства

растений. Вообще каллус представляет собой основной тип куль-

тивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная

ткань из любого растения может длительно рекультивироваться.

При этом первоначальные растения (в том числе и меристемати-

ческие), дедифференцируются и деспециализируются, но индуци-

руются к делению, формируя первичный каллус.

Кроме выращивания каллусов удается культивировать клетки

некоторых растений в суспензионных культурах.

Важными биообъектами представляются также и протопласты

растительных клеток. Методы их получения принципиально сход-

ны с методами получения бактериальных и грибных протопластов.

Последующие клеточно-инженерные эксперименты с ними заман-

чивы по возможным ценным результатам.

2.5.

Клетки животных. Из царства Ariimalia биообъектами

могут быть простейшие организмы — Protozoa и высшие животные.

И если сегодня о биотехнологии Protozoa мало что-либо известно,

то применительно к биотехнологии животных имеются внедрен-

ные развитые технологические процессы, написаны соответству-

ющие монографии в нашей стране и за рубежом. Тем не менее,

высокие дифференциация и специализация эукариотических кле-

ток животНых объясняют те трудности, с которыми приходится

сталкиваться исследователям и практическим работникам, имея

дело с подобным материалом.

Простейшие (Protozoa) — это одноклеточные микроскопиче-

ские животные. В данном отделе различают классы жгутиковых

(Flagellata, или Mastigofora, от лат. flagellum — бич, жгут, masticatus

— жевательный, от греч. foros — нести), саркодовые (Sarcodina, от

греч. sarcos — мясо), споровики (Sporozoa) и реснитчатые (Ciliofora,

или Ciliata). Простейшие широко распространены в природе,

некоторые из них обитают и в теле человека. По своему строению

клетки их напоминают клетки животных и содержат все основные

структурные элементы (органоиды и включения). Многие протозоа

активно передвигаются с помощью ложноножек, жгутиков и ре-

сничек. По типу питания они являются гетеротрофами, обладаю-

щими специальными структурами для захвата пищи или поглощают

ее посредством фагоцитоза.

Культивирование протозоа in vitro не простое, однако доступно

при необходимом усердии, а препарат "круцин" из Trypanosoma

kruzi является свидетельством удачного использования этого орга-

низма в биотехнологии.

В начале XX в. Р. Гаррисон и А. Каррель установили факт

возможного культивирования клеток животных in vitro, то есть они

доказали способность животных клеток к независимой жизни в

питательной среде вне живого организма.

С учетом всех особенностей животных клеток (в отличие,

например, от растительных и бактериальных) порой невозможно

отказаться от них во избежание каких-то чрезвычайных затрудне-

ний, так как лишь только с их помощью можно получить какой-то

особый продукт (вещество). Для примера назовем моноклональные

антитела, получение трансгенных животных и т. д.

Для реализации биотехнологических процессов важными па-

раметрами биообъектов являются: чистота, скорость размноже-

ния клеток и репродукции вирусных частиц, активность и ста-

бильность биомолекул или биосистем.

Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий

для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия-могут

оказаться благоприятными, например, и для микробов — контами-

нантов, или загрязнителей (от лат. contaminatio — заражение,

загрязнение). Представителями контаминирующей микрофлоры

оказываются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах

растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-кон-

таминанты выступают вредителями производств в биотехнологии.

При использовании ферментов в качестве биокатализаторов воз-

никает необходимость предохранения их в изолированном или

иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофит-

ной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть

в сферу биотехнологического процесса извне вследствие несте-

рильности системы, например, из-за негерметичности в каком-ли-

бо узле.

Скорости размножения клеток и репродукции вирусных час-

тиц прямо пропорционально сказываются на возрастании клеточ-

ной массы и образовании метаболитов или, применительно к

фагам, на возрастании массы лизирующихся клеток.

этом смысле

подавляющее большинство микроорганизмов выгодно отличается

от клеток растений и животных. Однако не следует упускать из

виду важность конечного продукта. Например, уже упомянутые

моноклональные антитела можно получить лишь с помощью жи-

вотных клеток, когда длительность культивирования их не приоб-

ретает самодовлеющего значения.

Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов

—

одни из важнейших показателей их пригодности для длительного

использования в биотехнологии.

Таким образом, независимо от систематического положения

биообъекта, на практике используют либо природные организо-

ванные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генети-

ческой информацией, либо клетки с искусственно заданной гене-

тической информацией, то есть в любом случае используют клетки,

будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для

примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита

на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против

Рис.

6. Биореактор фир-

мы Inceltech для выращи- p„

C- 7

Биореактор для

вания бактерий и грибов растений (общий вид),

(общий вид).

этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в

накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках живо-

тного организма. Другой пример с ферментами, которые будут

использованы в иммобилизованном состоянии. Источником фер-

ментов также являются изолированные клетки или специализиро-

ванные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют

нужные биокатализаторы.

Биотехнологии присущи свои специфические методы — это

крупномасштабное глубинное культивирование биообъектов в пе-

риодическом, полунепрерывном или непрерывном режиме; выра-

щивание клеток растительных и животных тканей в особых усло-

виях. Биотехнологические методы культивирования биообъектов

выполняются в специальном оборудовании, например, в фермен-

таторах выращивают бактерии и грибы при получении антибио-

тиков, ферментов, органических кислот, некоторых витаминов

(рис.

6);

в подобных же ферментаторах выращивают некоторые клетки

человека (бласты) для получения белка

—

интерферона. Раститель-

ные клетки чаще выращивают в стационарных условиях на среде

с уплотненной (например, агаризованной) подложкой в стеклян-

ных или полиэтиленовых емкостях, хотя некоторые виды расти-

тельных клеток можно культивировать в специальных фермента-

торах (рис. 7). .

В стеклянных роллерах культивируют и большинство живо-

тных клеток или, например, в куриных эмбрионах.

Другие методы, используемые в биотехнологии, являются об-

щими, например, с методами в микробиологии, биохимии, биоин-

женерии, органической химии и других науках.

Тем не менее, следует особо выделить методы клеточной и

генной инженерии, когда в экспериментальных условиях удается

создавать клетки с заведомо известными свойствами. Так осуще-

ствлены соматическая гибридизация клеток картофеля и томата

(гибрид назван "помато"), перенос генетической информации о

синтезе человеческого или животного гормона инсулина в бакте-

риальные клетки (кишечной палочки), способных затем продуци-

ровать полипептидные цепи инсулина.

Эти методы и, прежде всего, генно-инженерные легли в основу

современной биотехнологии. Более того, некоторые ученые стре-

мятся отождествить генную инженерию и биотехнологию, а это

неправильно, поскольку генная инженерия представляет методи-

ческую сущность биотехнологии. Наука не может быть наукой,

если в ее определении отсутствуют специфичные, только ей при-

сущие, объекты и методы.

Однако даже в случае реализации генно-инженерных разрабо-

ток измененная наследственная информация на уровне молекул

инкорпорируется затем в клетках, с которыми и приходится иметь

дело в биотехнологическом процессе. Из этого можно вывести

представление об уровнях биотехнологии: клеточном и молеку-

лярном. Тот и другой определяются биообъектами.

первом случае

дело имеют с клетками, например, актиномицетов при получении

антибиотиков, микромицетов при получении лимонной кислоты,

животных при изготовлении вирусных вакцин, человека при из-

готовлении интерферона. Во втором случае дело имеют с молеку-

лами, например, с нуклеиновыми кислотами в так называемой"ре-

комбинантной ДНК-биотехнологии" (рДНК-биотехнология), бази-

рующейся на генной инженерии и составляющей сущность пред-

мета "Молекулярная биотехнология"; или на использовании отдель-

ных ферментов (ферментных систем), например, протеаз в мою-

щих средствах, липаз для модификации вкуса молочных продуктов

и т. д. Однако необходимо помнить, что в начальной или конечной

стадии молекулярный уровень трансформируется в клеточный.

Так, ферменты продуцируются клетками, а при генно-инженерных

разработках реципиентом новой генетической информации стано-

вится также клетка.

Особенность методов, используемых в биотехнологии, заклю-

чается в том, что они должны выполняться, как правило, в асеп-

тических условиях (от греч. а — не, septicos — гнилостный), то

есть при исключении возможности попадания в среду культиви-

рования биообъекта болезнетворных (патогенных) и неболезнет-

ворных (сапрофитных) микроорганизмов. Патогенные виды пред-

ставляют непосредственную опасность для занятых в производстве

людей и

для

потребителей конечных продуктов; сапрофитные виды

могут выступать конкурентами за питательные субстраты, антаго-

нистами, продуцентами токсических веществ, включая пирогены.