Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

специфического субстрата, при которой конкретный фермент

обеспечивает скорость реакции, равную половине V

ax- До насто-

ящего времени анализ кинетики всех ферментативных реакций

проводят на основе следующего математического уровнения Ми-

хаэлиса—Ментен:

„ _ Ушах [5]

° K

+[S\

где V

— начальная скорость при концентрации S, Vmax —

максимальная скорость и К

— константа Михаэлиса—Ментен для

данного фермента, соответствующая определенному субстрату.

Нередко прибегают к преобразованиям уравнения Михаэли-

са—Ментен для получения каких-либо преимуществ при изучению

кинетики ферментативных реакций. В частности, к таким преоб-

разованиям относится уравнение Лайнуивера-Бэрка:

1 _К

1 1

~ Vmax [S]

V-

max

Согласно этому уравнению, по графику, построенному в двой-

ных обратных координатах, можно более точно определить V

(рис.

15).

На основании взаимодействия фер-

ментов и специфичных им субстратов, а

также учитывая множество фермента-

тивных реакций в клетке или в организ-

ме,

и, наконец, принимая во внимание

другие взаимодействия в биосистемах

(антигены-антитела, токсины и их рецеп-

торы и т. д.), можно говорить о компле-

ментарное™ как основе биологической

специфичности. В большинстве случаев

имеет место молекулярная комплемен-

тарность. Такие взаимодействия проте-

кают согласно законам термодинамики.

Однако известны взаимодействия фер-

ментов с другими веществами, кото-

рые сопровождаются снижением i л

полным подавлением активности био-

катализаторов. Вещества, подавляю-

щие ферментативные реакции, назы-

вают ингибиторами (от англ. inhibit —

препятствовать, сдерживать). Они из-

бирательно взаимодействуют с фер-

ментами, например, ЦИанИДЫ, ОКСИД Ри

. 15. График двойных обрат

углерода, азИД натрия ИНГИбируЮТ ОП- ных координат.

Рис.

14. Зависимость скорости

(V) ферментативной реакции

от концентрации субстрата

(S).

ределенные окислительно-восстановительные ферменты; иодаце-

тамид, ртутные и мышьяковистые соли блокируют тиоловые фер-

менты; амины, гидразиды и др. взаимодействуют с карбонильной

группой ферментов и, как следствие, ингибируют их активность.

Очевидно, что в живой клетке на принципе "активация-ингибиро-

вание" проявляется и требуемая клетке функциональная актив-

ность в соответствующих условиях существования.

Все ингибиторы подразделяют на обратимые и необратимые:

среди обратимых выделяют конкурентные и некон-

курентны е. Обратимые ингибиторы образуют непрочные

комплексы с ферментами [EI], которые способны распадаться на

исходные компоненты.

Е+ Ю EI

Мерой ингибирования является та концентрация ингибитора,

которая вызывает угнетение фермента наполовину (Iso). Отсюда,

чем меньше величина I, тем сильнее ингибитор, а чем больше I,

тем слабее. В случае взаимодействия необратимых ингибиторов

комплексы [EI] не распадаются и реакция протекает лишь вправо

Е + I -• EI

Конкурентный ингибитор связывается с активным центром

фермента и далее, в отличие от фермент-субстратного комплекса,

не подвергается ферментативной трансформации. Следовательно,

конкурентный ингибитор выступает конкурентом субстрату за

связывание с активным центром. Изменяя концентрации субстра-

та, можно вытеснить из комплекса ингибитор. Примером конку-

рентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы является малонат (в

норме — субстратом выступает сукцинат).

Неконкурентный ингибитор связывается где-то в другом месте

фермента, а не с активным центром. При этом изменяется кон-

формация всей молекулы фермента, сопровождающаяся обрати-

мой инактивацией его каталитического центра. Неконкурентные

ингибиторы взаимодействуют и со свободным ферментом и его

фермент-субстратным комплексом:

E + I~EI , ES+I«*ESI

Комплексы EI и ESI становятся неактивными.

Из сказанного можно сделать вывод о том, что в работу

ферментов может вмешиваться множество различных веществ, с

помощью которых регулируется их биосинтез и активность. Био-

синтез ферментов будет рассмотрен позднее в этой главе. Что же

касается регуляции активности биокатализаторов, то, наряду с

большим накопленным материалом в этом направлении, открыва-

ются новые пути обмена, в регуляции которых участвуют фермен-

ты,

и познание которых становится насущно необходимым; давно

возникла потребность полнее изучить

взаимодействие между известными ме-

таболическими циклами с определением

роли и механизмов энзиматического ре-

гулирования такого взаимодействия, а

также исследовать глубину участия раз-

личных ферментов в поддержании гоме-

остаза организмов (от греч. oemoios —

подобный, одинаковый, stasis — состоя-

ние,

неподвижность), то есть устойчи-

вость их внутренней среды.

Любая живая клетка представляется

устойчивой системой, поддерживаю-

щейся однонаправленным потоком ме-

таболитов (рис. 16).

В зрелых клетках концентрации ме-

таболитов относительно постоянны.

Гибкость устойчивой системы, каковой

является зрелая клетка, подтверждается

слабыми изменениями и уравновешива-

нием сдвигов, благодаря чему организм

поддерживает постоянство внутренней среды вопреки широкому

разнообразию питательных веществ, качества воды, внешней тем-

пературы и т. д.

При переходе от одноклеточных организмов к многоклеточным

регуляторные механизмы ферментативных процессов существен-

но усложняются, хотя основные концепции приложимы к сущест-

вам любой организации.

В лабораторных или производственных условиях трудно или

невозможно увязать изменение ферментативной активности в

клетке (ткани) с каким-либо одним (из двух) процессом — возра-

станием количества фермента или возросшей эффективностью

биокатализатора. Более определенно можно говорить о повышении

или понижении активности в тех случаях, когда имеют дело с

ферментом в системе (-ах) in vitro, тем более, что большинство

результатов по оценке регуляции их активности получены в таких

системах.

В механизмах регуляции ферментативной активности у эука-

риотических клеток (в отличие от прокариот) существенна роль

физического разграничения (компартментализация) внутреннего

отходы

Рис.

16. Идеализированная

клетка в устойчивом состоянии

(ПВ — питательные вещества).

содержимого (протопласта). Организация набора ферментов, ка-

тализирующих соответствующую последовательность метаболиче-

ских реакций, в виде макромолекулярного комплекса координи-

рует ферменты и "канализует" интермедиаты (промежуточные

продукты) по данному метаболическому пути. Более того, конфор-

мационные изменения в одном компоненте комплекса может

передаться благодаря белок-белковому взаимодействию другим

ферментам комплекса. Вследствие этого возможно приумножение

регуляторных эффектов.

Велика роль ионов металлов в металлоферментах и металлоак-

тивированных ферментах, в которых аденозин-трифосфат (АТФ)

выступает субстратом. Когда комплекс "АТФ-ион металла" оказы-

вается субстратом реакции, то обычно максимальная активность

наблюдается при молярном соотношении АТФ и металла близким

к единице. При избытке того или иного из этих ингредиентов

отмечается ингибиторный эффект. Поскольку нуклеозидди- и три-

фосфаты образуют стабильные комплексы с дивалентными кати-

онами, постольку внутриклеточные концентрации нуклеотидов

могут влиять на внутриклеточное содержание свободных ионов

металлов и, как следствие, на активность определенных ферментов.

Например, конфигурация глутаматсинтетазы кишечной палочки в

отсутствие ионов металлов релаксирует ("расслабляется") и стано-

вится каталитически неактивной; добавление Мо

или Мп

вос-

станавливает активность фермента.

Каталитическая активность и регуляция активности ферментов

могут протекать в форме мгновенного обратимого ингибирования

по типу обратной связи (Feedback inhibition) с использованием

аллостерических эффекторов небольшой молекулярной массы, не

имеющих структурного сходства с субстратами или коферментами

и связывающимися с аллостерическими сайтами (не активными

центрами) ферментов.

. Ф1

Ф2 _ ФЗ

Ф4 .

А >Б *В >Г >Д

Это — механизм грубого контроля регуляции активности фер-

ментов. В указанной схеме продукт Д способен связываться с

первым ферментом (Ф1) или ингибировать его. Следовательно, Д

— это отрицательный аллостерический эффектор или Feedback-

ингибитор Ф1 и таким образом может регулироваться синтез Д. В

качестве примера такой регуляции можно назвать ингибирование

триптофаном антранилат-синтетазы у микроорганизмов на пути

синтеза триптофана, где промежуточным продуктом является ан-

траниловая кислота.

Различают кумулятивную, мультивалентную (согласованную)

и кооперативную Feedback-ингибиции. В первом случае два или

более конечных продукта ингибируют строго аддитивно один

регуляторный фермент; во втором — два и более конечных про-

дукта находятся в избытке и только при этом условии происходит

полная ингибиция реакции; при кооперативной ингибиции един-

ственный конечный продукт, присутствующий в избытке, тормо-

зит действие регуляторного фермента, но когда, при наличии двух

и более конечных продуктов, торможение заметно превышает

аддитивные эффекты кумулятивной Feedback-ингибиции.

В отличие от Feedback-ингибиции Feedback-репрессия заклю-

чается в том, что производное (дериват) конечного продукта (ре-

прессор) подавляет образование ферментов (а не влияет на

их активность) в данном метаболическом пути:

_У_,е V ,

-fcL

уЦ (конечный ..

продукт)

- репрессор

аминокислоты

Регуляторную роль в каталитической активности может играть

так называемая ковалентная модификация, когда к ферменту

присоединяется фосфатная группа (обычно у эукариот) или нук-

леотид (обычно у прокариот). Ферменты, подвергающиеся кова-

лентной модификации, сопровождаю-

щейся модуляцией их активности, на-

зываются интерконвертирующими.

Они существуют в двух активных со-

стояниях — высокой и низкой катали-

тической активности (рис. 17).

В ряде случаев конечный или про-

межуточный продукт используется в ка-

честве активатора какого-либо фермен-

та — это аллостерическая активация

или Feedback-активация.

Наряду с грубой регуляцией актив-

ности ферментов по механизму

Feedback-ингибиции известен тонкий

контроль, в котором ферменты — алло-

стерические белки имеют не только ка-

талитические центры для связывания с

субстратом, но и близко расположен-

ные другие места (одно или более), с

Ф-Е НМФ-Е

Рис. 17. Регуляция фермента-

тивной активности ковалент-

ной модификацией (Е-фермент;

НТФ,

НДФ и НМФ-соответст-

венно нуклеозидтри-, ди- и мо-

нофосфаты, ФФн-неорганиче-

ский пирофосфат).

которыми связываются небольшие молекулы — эффекторы. При-

соединяясь к своему

месту,

эффектор вызывает конформационное

изменение в ферменте. При этом родство каталитического центра

фермента к субстрату либо уменьшается — наступает аллостери-

ческая ингибиция, либо, напротив, возрастает — наступае*т алло-

стерическая активация (рис. 18).

Рис.

18. Схематичное изображение модификации активного центра (АЦ) фермента

(Ф) с помощью эффектора (Э), взаимодействующего на аллостерическом сайте (А);

S-субстрат,

(а)—аллостерическая ингибиция, (б)—аллостерическая активация.

При реализации инженерно-энзимологических процессов важ-

но знать и, следовательно, применять эффекторы на практике.

Вследствие компартментализации клеточных процессов у эукариот

остаются неизвестными концентрации эффекторов (а нередко —

и сами эффекторы) в клетках. Ярким примером здесь служит

фосфофруктокиназа - давно и хорошо изученный фермент глико-

лиза. Оказалось, что она имеет эффектор — фруктоз6-2,6-дифос-

фат, открытый лишь 10 лет назад X. Г. Херсом, Л. Хью и Е. Ван

Шафтин геном.

Очевидно, что во всех рассмотренных примерах регуляции

активности ферментов важное значение имеет чувствительность

биокатализаторов к регуляции, то есть нередко усиление (ампли-

фикация) "сигнала" может оказать решающее влияние на включе-

ние—выключение каскада реакций.

Глава 4

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ОБЛАСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Чтобы с максимальной продуктивностью использовать биообъ-

ект в биотехнологическом процессе, необходимо знать и учитывать

его структурно-функциональные особенности применительно к

конкретным условиям производства. В большинстве случаев каче-

ство и количество целевого продукта в значительной степени

находятся в прямо пропорциональной зависимости от качества и

количества продуцента. Совершенно очевидно, что подходы здесь

к акариотам, прокариотам и эукариотам должны быть различными,

поскольку первые, например, являются облигатными паразитами

и могут развиваться лишь в живых клетках (тканях); бактерии

структурно менее дифференцированы, чем эукариоты и поэтому

они в большинстве своем менее требовательны к условиям обита-

ния, чем грибные, растительные и животные организмы.

4.1.

Акариоты. Ряд бактериофагов, вирусов растений и млеко-

питающих широко используют в биотехнологии, особенно — в

рДНК-биотехнологии (см. ). У них наследственный материал уст-

роен наиболее просто и работа с ним по этой причине несколько

облегчается, хотя понятно, что она на самом деле "ювелирная".

Как уже было сказано в главе 2, вирион представляет собой

нуклеокапсид и архитектоника вирусных частиц не одинаковая

(см.

рис. 1а и 226). Многие вирусы животных представляют собой

"голые" нуклеокапсиды (аденовирусы), тогда как другие (вирусы

герпеса и оспы) имеют дополнительную оболочку (суперкапсид),

нередко приобретаемую во время освобождения нуклеокапсида из

клетки организма-хозяина. "Голый" спиральный нуклеокапсид ви-

руса табачной мозаики — ВТМ (вирион) имеет молекулярную

массу (ММ) 39»10

дальтон (Да), а его единственная молекула РНК

— 2,06»

Да. Некоторые вирусы имеют двухнитевую РНК, на-

пример, реовирусы, ММ которой равна 9«10

Да.

У большинства вирусов, содержащих ДНК, нуклеиновая кис-

лота является двухнитевой (равно как и у многих бактериофагов).

В качестве исключения можно назвать парвовирусы и соИ-фаг

фХ

174,

имеющих однонитевую ДНК. Молекулярные массы ДНК

различны и достигают следующих величин: у coli-фага фХ174 —

1,7»10

Да, у четных бактериофагов Т2, ТА И Тб —

1,2»10

Да, у

герпесвирусов — 1»10

Да, у вируса оспы —

1,5»10

Да и т. д.

Капсид любого вируса построен из 5—6 белковых субъединиц

— капсомёров; это - морфологические единицы, расположенные,

как правило, строго регуляр-

но,

благодаря чему капсид

приобретает специфический

тип молекулярной

симметрии — спи-

ральный или куби-

ческий. Например, вирус

табачной мозаики имеет спи-

ральный тип симметрии. Его

спиралевидная РНК упакова-

Рис. 19. Схема строения вируса мозаики

на в винтооб

аз

но располо-

табака: А — вид сбоку, В — вид сверху; 1

- одноцепочечная РНК, 2 - Белковые женные капсомеры И, В целом,

субъединицы. вирион представляется палоч-

ковидным (рис 19). Спираль-

ный тип симметрии характерен также для вирусов: бешенства,

гриппа, желтухи свеклы, кори, ложной чумы кур, парагриппа,

паротита, сендай, чумы рогатого скота, чумы собак и др.

Кубический тип симметрии является наиболее распространен-

ным среди большинства известных ныне вирусов. Из трех типов

Рис. 20. Икосаэдр с тремя осями симметрии (а, б, в).

фигур с кубической симметрией: тетраэдр (оси симметрии 2:3,

минимальное число структурных единиц 12), октаэдр (оси симмет-

рии 4:3:2, число структурных единиц 24) и икосаэдр, или правиль-

ный многогранник (оси симметрии 5:3:2, число структурных еди-

ниц 60) последний наиболее част у вирусов. Это объясняется тем,

что в случае икосаэдра минимальное число структурных единиц

оказывается наибольшим, и, следовательно, данный тип симметрии

пространственно наиболее экономичен (не требуется изготовления

крупных молекул при сборке вибриона). На рис. 20 изображен

икосаэдр с тремя осями симметрии (5:3:2). В правильном икосаэдре

имеется 6 осей симметрии пятого порядка, проходящие через

вершины (а), 10 осей симметрии третьего порядка, проходящие

через центры треугольных граней (б) и 15 осей симметрии второго

порядка, соединяющих середины ребер (в). Икосаэдр обладает 12

вершинами, 20 гранями и 30 ребрами.

Капсиды некоторых вирусов "осложнены" дополнительными

структурами. Так, например, у аденовируса капсид формируется

в виде икосаэдра с 6 капсомерами вдоль каждого ребра; всего в

капсиде 252 капсомера, из которых 240 имеют сферическую форму

и располагаются вдоль ребер и на гранях икосаэдра. Каждый

капсомер соседствует с 6 другими капсомерами, поэтому они

называются гексамерами, или гексонами (в

рассматриваемом примере их 240). Остальные 12 капсомеров

располагаются на 12 вершинах икосаэдра и соседствуют с 5

капсомерами (п е н т а м е р, или п е н т о н). Эти 12 капсомеров

(пентонов) состоят из сферического основания и длинной нити,

которая может обеспечивать прикрепление вириона к клетке (рис.

21).

Рис.

21. Схематичная модель аденовируса с внутрен-

ним ДНК-протеиновым кором и внешним капсидом

— икосаэдром (П-гексон — 120000 Да; Ш-пентоновое

основание — 85000 Да; Ша, VI-, VIII и 1Х-белки,

ассоциированные с гексоном, имеющие ММ соответ-

ственно 66000 Да, 24000 Да, 13000 Да и 12000 Да;

IV-белковая "нить" — 62000 Да, V и VII-протеины кора

с ММ 48000 Да и 18000 Да).

Сложные капсиды присущи и бактери-

офагам, например, Т-четным coli-фагам

(см.

рис. 1а), у которых имеется икосаэд-

рическая головка и гексагональный отро-

сток. В таблице 6 приведен перечень неко-

торых вирусов прокариотических и эукариотических организмов

с различными типами симметрии капсидов.

Необходимо подчеркнуть, что вирусы не размножаются, а

репродуцируются, или воспроизводятся, то есть правильнее гово-

рить не об их потомстве, а их "копиях" (братьях и сестрах).

Репродукция происходит только в живых клетках (тканях) и поэ-

тому биотехнологические процессы, основанные на использовании

вирусов, исключительно дорогостоящи. Достаточно сравнить, на-

пример, кишечную палочку и вирус гриппа. Первая растет на

мясопептонном бульоне, второму необходимы куриные эмбрионы;

чтобы проконтролировать рост кишечной палочки и увидеть ее в

среде, необходим обычный "световой" микроскоп, а чтобы увидеть

вирусные частицы, нужен электронный микроскоп, стоимость

которого во много раз превосходит стоимость

светового.

Подобные

сравнения можно продолжать и далее, и в этом смысле выгоды

будут складываться в пользу бактерий. Однако создание противо-

гриппозных биопрепаратов (вакцин) сегодня более насущная за-

дача, чем борьба с заболеваниями, вызванными энтеропатогенны-

ми кишечными палочками и родственными ей бактериями. Кроме

того,

решение многих фундаментальных проблем в области моле-

кулярной биологии нередко возможно исключительно на вирусных

Таблица 6 Общая характеристика некоторых вирусов

Вирусы

Бактерий

(бактериофаги)

Колифаг

<рХ174

Колифаг Я

Колифаг Т2

Колифаг

MS = 2

Растений

!. Мозаики табака

(ВТМ)

Желтой

мозаики турнепса

Животных

Восточного

энцефаломиелита

лошадей

Обезьян SV-40

Человека

Аденовирусных

инфекций

Гриппа"

Полиомиелита"

Наличие (+) или

отсутствие (-) и

ММ (Да) хЮ

ДНК

( +

)

1,6

( + )33

( +

)

130

(-)

( + )3,2

( + )23

(-)

РНК

(-)

(+)1

( + )2,1

( + )1,7

( + )2

(-)

( + -)4

( + )2,2

Супер-

капсид

Отсут-

ствует

Име-

ется

Отсут-

ствует

Имеет-

ся

Тип

симмет-

рии

Вирион

ММ (Да)

хЮ

6,2

100

300

3,6

177

300

6,8

Средний

размер,

нм

(100x50)

х(80х95-

100)

~ 25

15-17

хЗОО

50-70

40-50

70-90

80-120

Примечание: + — одноцепочечная нуклеиновая кислота, К — кубический (у фа-

гов в головке), 0 — с отростком(-ами), С — спиральный