Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ШЕСТАЯ

196

ГИО и его гибридов по сравнению с интактным реципиентным организмом при раз-

множении, рассеивании и выживании. Для ГИМ важны данные о способности к пере-

носу генетической информации. Оценивают как вероятность переноса трансгенов от

ГИО к организмам, населяющим потенциальную принимающую среду обитания, так

и вероятность переноса трансгенов от этих организмов к ГИО.

1 Этап анализа:

вероятность миграции трансгена (могут ли образовываться жизнеспособные фертильные гибриды от

скрещивания трансгенной культуры с ее диким или сорным сородичем)*.

А) Является ли основным типом размножения половой тип?

Да или информация недостаточна,

переход к вопросу В

Нет

(основной тип размножения – вегетативный)

Риск низкий, конец анализа

В) Является ли трансгенная культура перекрестноопыляемой или частично перекрестноопыляемой

Да или информация недостаточна,

переход к вопросу С

Нет

(самоопылитель или процент перекрестного опыления низкий)

Риск низкий, конец анализа

С) Имеет ли ГИО родственные виды в регионе высвобождения (в агросреде и природной среде)

Да или информация недостаточна,

переход к вопросу D

Нет

Риск низкий, конец анализа

D) Может ли скрещиваться с родственным видом в принципе и ведет ли скрещивание к образованию

фертильного потомства (возможна ли миграция генов между популяциями трансгенной культуры и родственного вида)

Да или информация недостаточна,

переходим к вопросу Е

Нет

(гибриды не образуются или они стерильны).

Риск низкий, конец анализа

Е) Является ли время цветения культурного (ГИО) и родственных видов совпадающим или близким по времени

(с учетом срока жизнеспособности пыльцы и количества образующейся фертильной пыльцы)

Да или информация недостаточна,

переход к вопросу F

Нет

(сроки цветения не совпадают).

Риск низкий, конец анализа

F) Используют ли культурный вид (ГИО) и родственный вид одинаковую систему опыления (ветер, насекомые)

Да или информация недостаточна,

переход к вопросу G

Нет.

Риск низкий, конец анализа

F) Могут ли культурный вид (ГИО) и его родственные виды перекрестно опыляться в природе и формировать

семена, способные к последующему размножению в природных (полевых) условиях

Да или информация недостаточна,

переход ко 2 этапу анализа

Нет.

Риск низкий, конец анализа

2 Этап анализа:

Изменение в экологическом поведении популяции диких видов в связи с интрогрессией трансгена от ГИО**.

А) Оценка изменений в экологическом поведении диких видов, родственных ГИО, связанных с передачей им

трансгенного признака

Да

Риск высок

Пересмотр возможности коммерциализации

или переход к В

Нет

Риск низкий

Конец анализа

В) Возрастает ли инвазивная (как сорняка) опасность дикого вида в связи с интрогрессией

трансгенного признака

Да

Риск высок

Пересмотр возможности коммерциализации

Нет

Риск низкий

Конец анализа

Рис. 6.5. Экспериментальная оценка вероятности миграции трансгена и изменения характеристик при-

родных популяций в связи с его интрогрессией (модифицированная схема J. Rissler, M. Mellon [1993])

* Источник информации: уже имеющиеся сведения о трансгенном организме (базы данных) и результа-

ты специальных экспериментов по выявлению миграции генов.

** Источник информации: данные эксперимента по замещению популяции и сохранению банка семян

гибридов (беккроссных поколений) от скрещивания ГИО и дикого родственного вида.

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

197

На решение эксперта о возможности высвобождения и коммерческого использо-

вания ГИО может повлиять информация о высвобождении, мониторинге, контроле, очи-

стке территории от остатков ГИО. Даже при наличии природных факторов, способст-

вующих миграции трансгенов, грамотные действия по контролю за рассеиванием ге-

нетического материала и очистке территорий от остатков ГИО и их нежелательного

потомства способны полностью нейтрализовать влияние нежелательных природных

факторов.

Учитывают предполагаемое количество высвобождаемых ГИО, расстояние от уча-

стка до посадок растений диких и культурных родственных видов, способных к гибри-

дизации с ГИО (изоляцию животных ГИО от контактов с родственным видом), меры,

которые намечается использовать для предотвращения рассеивания генетического ма-

териала ГИО. Для ГИМ также важна информация об обработке участка после высво-

бождения и методах очистки почвы от ГИМ после окончания их использования.

Важная роль уделяется вопросам, связанным с мониторингом возможной мигра-

ции трансгена. В частности, рассматривается наличие методов выявления переноса

трансгенов другим организмам и возможности идентификации ГИО и их потомства в

популяциях-реципиентах.

При экспериментальном изучении рассеивания генетического материала и ин-

трогрессии гена в природные популяции большую помощь окажут современные мо-

лекулярно-биологические методы. Молекулярные маркеры могут дать точную ин-

формацию о наличии чужеродного генетического материала у организма-реципиента,

даже если он не ведет к изменению фенотипических или биохимических показателей

у нового носителя и тем самым не проявляет себя. Кроме ставших уже классическими

методов фингерпринтинга, в настоящее время все более широкое распространение

получает метод включения в конструкцию для трансгеноза специальных репортерных

генов, продукт которых позволяет проследить судьбу трансгена в онтогенезе ГИО и

зафиксировать наличие трансгена в его потомстве. Один из таких генов, выделенный

из медузы Aequorea Victoria, кодирует белок, получивший название GFP (Green

fluorescent protein – белок зеленого флюоресцентного свечения). Этот белок способен

светиться в живых объектах в ультрафиолетовом (360– 400 нм) или синем (440–480 нм)

свете, что дает возможность фиксировать его наличие в живых организмах в режиме

реального времени. Использование GFP-метода позволяет при наличии ручного ульт-

рафиолетового излучателя выявлять трансгенные растения в популяциях живых рас-

тений в полевых условиях по зеленой окраске (нетрансгенные растения имеют в ульт-

рафиолетовом свете красную окраску за счет специфической в этом свете красной ав-

тофлюоресценции хлорофилла) [Stewart, 1999; Halfhill et al., 2001]. GFP-ген, помещен-

ный под специфический промотор, активизирующий его действие в пыльце, напри-

мер промотор LAT59 из томата, позволяет успешно изучать и контролировать рассеи-

вание в окружающей среде пыльцы трансгенных растений, что важно не только при

изучении миграции трансгенов, но и при оценке воздействия трансгена через пыльцу

на организмы-немишени [Hudson et al., 2001].

На втором этапе изучения миграции трансгена, т.е. при выявлении стабильной

интрогрессии трансгена в популяцию реципиентного вида, также используют фено-

типические, биохимические и молекулярные маркеры. Изменение характеристик

природной популяции, ее выживаемость и инвазивные возможности в связи с интрог-

рессией в нее трансгенного признака оценивают при помощи описанных ранее экспе-

риментальных методов (оценка замещения популяции, сохранность банка семян), на-

блюдения за проявлениями агрессивности реципиентов в отношении других видов

растений (см. рис. 6.2 и 6.5).

ГЛАВА ШЕСТАЯ

198

6.9. Воздействие продуктов трансгенов на организмы,

не являющиеся мишенью их запланированного действия

Одним из наиболее значимых неблагоприятных эффектов ГИО считается отри-

цательное влияние продуктов трансгена на организмы, не являющиеся мишенью

трансгенного признака. Организмами-немишенями называют все организмы, на кото-

рые непосредственно не нацелено воздействие трансгенного организма, связанное с

генно-инженерной модификацией. Возникновение эффекта в первую очередь может

быть вызвано использованием растений, обладающих пестицидными свойствами в ре-

зультате генно-инженерных модификаций, вызывающих у них синтез, например, Bt-

протеинов. В настоящее время ведутся работы по расширению спектра эндотоксинов,

которые можно привнести в сельскохозяйственные растения с помощью генно-

инженерных модификаций, однако Bt-протеины по ряду причин пока что остаются

вне конкуренции [Shuler et al., 1998; Stewart, 1999; Cohen et al., 2000].

С точки зрения биобезопасности наиболее важной из этих причин является высо-

кая токсичность Bt-протеинов и специфичность (целенаправленность) их действия в

отношении определенных групп насекомых-вредителей. Эндотоксин, кодируемый

конкретным геном cry, имеет поражающее действие на конкретную систематическую

группу насекомых, например на представителей только чешуекрылых (Lepidoptera) или

только жесткокрылых (Coleoptera) (табл. 6.3). При этом Bt-протеины абсолютно безвред-

ны для человека и теплокровных животных.

Несмотря на высокую специфичность действия Bt-протеинов, невозможно полно-

стью исключить вероятность их неблагоприятного воздействия на непаразитарных

представителей из тех же семейств, что и насекомые-мишени. Например, к семейству

Lepidoptera наряду с серьезными вредителями сельскохозяйственных культур, такими

как капустная моль (Plutella xylostella), кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis), яблонная

плодожорка (Cydia pomonella), коробочный червь хлопка (Helicoverpa armigera) и другие,

принадлежат насекомые, не представляющие угрозы сельскохозяйственным культурам

(большинство бабочек), а также насекомые, полезные в качестве опылителей или на-

прямую используемые человеком (шелковичные черви Antheraea perngicuerin [Antheraea

pernyi] и Bombyx mori). Такие нейтральные или полезные насекомые не всегда потреб-

ляют Bt-протеин с кормом, однако могут подвергнуться его действию при попадании

эндотоксина на их кормовую базу.

Известно побочное нежелательное действие Bt-токсинов на организмы-немишени

в связи с использованием распыляемых бактериальных препаратов на основе Bacillus

thuringiensis. Возможно также «распыление» Bt и других токсинов трансгенного проис-

хождения на кормовую базу нейтральных и полезных насекомых и других беспозво-

ночных животных. Во-первых, в случае, если ген токсичности экспрессируется в пыль-

це, то токсин может распространяться с пыльцой сельскохозяйственных генно-

инженерных растений. Во-вторых, возможно попадание Bt-протеинов в почву с остат-

ками трансгенных растений или выделениями их корней. В данном случае могут по-

страдать беспозвоночные животные почвы и ризосферы растений, обеспечивающие

минерализацию почвы и ее плодородие. Например,

возможно негативное действие Bt-

токсинов на земляных червей и ногохвосток. Несмотря на довольно быстрое разложе-

ние Bt-протеинов в почве (период полураспада от 2 до 10 дней в зависимости от поч-

венных условий [Palm et al., 1993]), они, подобно ДНК, могут довольно долго сохранять

активность в связанном состоянии, образуя конгломерат с глиной или гуминовыми ки-

слотами. Так, в почвах, содержащих каолин, Bt-протеины сохраняют уровень токсич-

ности, достаточный для уничтожения рогатой гусеницы табака (Manduca sexta), в тече-

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

199

ние шести месяцев. Этот период увеличивается при повышении кислотности почв

[Тарр, Stotzky, 1998].

Таблица 6.3

Основные источники токсичности к насекомым-вредителям, используемые при трансгенозе

сельскохозяйственных и древесных растений (по Schuler et al., 1998)

Источник токсичности

Насекомые-

мишени

Трансформированные растения

Кристаллопротеины от Bacillus thuringiensis

Cry1Aa Lepidoptera Брюква, клюква*, тополь

Cry1Ab » Ель белая, клевер белый, кукуруза,

катофель, рис, табак, томат, тополь,

хлопчатник, яблоня*

Cry 1 Ac » Арахис, брокколи, виноград*, грецкий

орех, капуста белокочанная, рапс

масличный, рис, соя, табак, томат*,

хлопчатник, яблоня

Cry1Ba » Клевер белый

Cry1Ca » Арабидопсис, люцерна, табак

Cry1H » Кукуруза

Cry1F » »

Cry2Aa » Хлопчатник

СrуЗА Coleoptera Баклажан, картофель, табак

Сrу6А » Люцерна

Cry9C Lepidoptera Кукуруза

Bt (неспецифического действия) Боярышник, ирга, груша, сахарный

тростник

Ингибиторы протеиназ

С-II (соевый ингибитор серино-протеиназы) Coleoptera,

Lepidoptera

Картофель, рапс масличный, табак,

тополь

СМе (ингибитор трипсина из ячменя) Lepidoptera Табак

CMTI (ингибитор трипсина из кабачка) »

CpTI (вигновый ингибитор трипсина) Coleoptera,

Lepidoptera

Батат, земляника, картофель,

подсолнечник*, рапс масличный, рис,

салат-латук, табак, томат, яблоня

14K-CI (бифункциональный ингибитор

серино-протеиназы и α-амилазы из

пшеницы)

Табак

MTI-2 (ингибитор серино-протеиназы из

горчицы)

Lepidoptera Арабидопсис, табак

ОС-1 (рисовый ингибитор цистеино-

протеиназы)

Coleoptera,

Homoptera

Рапс масличный, табак, тополь

PI-IV (соевый ингибитор серино-

протеиназы)

Lepidoptera Картофель, табак

Pot PI-I (картофельный ингибитор

протеиназы I)

Lepidoptera,

Orthoptera

Петунья, табак

Pot PT-II (картофельный ингибитор

протеиназы II)

Lepidoptera,

Orthoptera

Береза, рис, салат-латук, табак

Ингибитор протеиназ I (неспецифический) Lepidoptera Рапс масличный

KTi

, SKTI (соевый ингибитор трипсина

Кунитца)

» Картофель, табак

Ингибитор протеиназы томата I » Люцерна, паслен, табак, томат

Ингибитор протеиназы томата II » Табак, томат

Другие гены устойчивости к насекомым растительного происхождения,

встроенные в сельскохозяйственные культуры

Ингибиторы α -амилазы

αAI-Pv (ингибитор α-амилазы фасоли) Coleoptera Горох, табак

WMAI-1 (ингибитор α–амилазы зерновых) Lepidoptera Табак

14K-CI (бифункциональный ингибитор

α-амилазы и протеиназ серина )

ГЛАВА ШЕСТАЯ

200

Источник токсичности

Насекомые-

мишени

Трансформированные растения

Лектины

GNA (лектин Galantus nevalis) Homoptera,

Lepidoptera

Батат, виноград, картофель,

подсолнечник*, рапс масличный, рис,

сахарный тростник, табак, томат

Р-lec (лектин гороха) To же Картофель, табак

WGA (агглютинин зародышей пшеницы) Coleoptera,

Lepidoptera

Кукуруза

Лектин риса To же »

Другие

ВСН (хитиназа бобов) Homoptera,

Lepidoptera

Картофель

Анионактивная пероксидаза табака Coleoptera,

Lepidoptera

Табак, томат

Хитиназа томатов Homoptera Рапс масличный

TDC (триптофан декарбоксилаза, ген

выделен из Catharanthus roseus)

» Табак

Гены устойчивости к насекомым животного происхождения,

экспрессирующиеся у сельскохозяйственных растений

Ингибиторы протеиназ

Антихимотрипсин, ген выделен из Manduca

sexta

Homoptera Табак, хлопчатник

Антиэластаза, ген выделен из Manduca sexta » Люцерна, табак, хлопчатник

AT (А-антитрипсин) Lepidoptera Картофель

Антитрипсин, ген выделен из Manduca sexta Homoptera Табак, хлопчатник

BPTI (бычий панкреатический ингибитор

трипсина)

Lepidoptera,

Orthoptera

Картофель, клевер белый, петунья, салат-

латук, табак

SI (ингибитор из селезенки) Lepidoptera Картофель

Хитиназы

Хитиназа, ген выделен из Manduca sexta » Табак

* Трансгенные растения занесены в базу данных выдачи разрешений на генно-инженерные организмы

USDA/APHIS (http://www.aphis.usda.gov/bbep/bp/).

Кроме прямого ненаправленного действия токсина, связанного с его непосредст-

венным потреблением полезными и нейтральными животными, возможно опосредо-

ванное нежелательное действие токсина через взаимоотношения хищничества или па-

разитарности. Опасения, касающиеся возможности такого негативного воздействия

токсинов трансгенных растений на популяции полезных насекомых, питающихся на-

секомыми – мишенями трансгенного признака и позволяющих контролировать чис-

ленность вредителей биологическими методами, например на популяции златоглазки

(Chrysoperla carnea) и божьей коровки (Hippodamia convergent), неоднократно высказыва-

лись научной общественностью [Hilbeck et al., 1998; Sharma, Ortiz, 2000; Levidow, 2003 и

др.].

Беспокойства по поводу нецелевого ущерба, наносимого Bt-токсинами, основаны,

как правило, на данных лабораторных тестов, далеких от реальных условий существо-

вания и поведения насекомых. Например, хищным насекомым (Chrysoperla carnea) не

предоставляют возможности выбора жертвы и тем самым искусственно вынуждают их

питаться вредителями, которыми в природе они не только не питаются, но и редко

сталкиваются с ними, как это случилось при искусственном скармливании личинок

кукурузного мотылька златоглазке [Hilbeck et al., 1998]. Или непреднамеренно искусст-

венно завышают концентрацию токсина, которую реально может потребить насеко-

мое, путем нанесения избыточного количества неочищенной от растительных остатков

пыльцы на листья, скармливаемые растительноядным насекомым, как это случилось в

опыте, проведенном J.E. Losey с соавторами (1999) по скармливанию гусеницам бабоч-

продолжение таблицы 6.3

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

201

ки-данаиды (Danaus plexippus) листьев ваточника с искусственно нанесенной пыльцой

трансгенной кукурузы Bt11. Несмотря на относительность результатов и слабое соот-

ношение моделируемых в лабораторном тесте условий с реальными событиями, про-

исходящими в природе, такой тест является основой для выявления наличия фактора

риска, связанного с токсичностью и другими нецелевыми воздействиями продукта

трансгена, или полного исключения вероятности его возникновения.

Уменьшению нецелевого пестицидного действия трансгенных растений может

способствовать использование специальных промоторов, позволяющих генам токсич-

ности экспрессироваться только в частях растений, повреждаемых вредителями, и не

экспрессироваться в пыльце, а также встраивание генов токсинов, которые быстро раз-

рушаются в почве.

В последнее время в связи с развитием направления генной инженерии, связанно-

го с приданием растениям функций биореакторов (синтез растениями вакцин, алка-

лоидов, витаминов, гормонов и других физиологически активных и фармацевтаческих

веществ), спектр организмов-немишеней может расшириться за счет теплокровных

животных, случайно потребивших такие растения. Опасность нецелевого действия

трансгена возрастает, если он попадает в результате миграции в популяции свободно-

живущих растений за пределы охраняемых от нежелательного посещения животными

территорий или при переопылении других сортов не биофармацевтического назначе-

ния этой же сельскохозяйственной культуры, что превращает в организмы-немишени

человека и сельскохозяйственных животных. Неслучайно к посадкам подобных расте-

ний предъявляются особые требования по изоляции и предотвращению возможности

переопыления с посадками растений пищевого или кормового назначения. Например,

такая перекрестноопыляющаяся культура, как кукуруза, чаще других используемая

для производства биофармацевтических средств в США, согласно требованиям депар-

тамента США по вопросам сельского хозяйства, должна быть изолирована от посадок

пищевой кукурузы расстоянием не менее 400 метров [информация BINAS. biotech-

info.net].

Еще одно нецелевое воздействие на организмы-немишени может быть связано с

использованием генно-инженерных бактерий ризосферы растений (бактерии группы

Rhizobia), а также трансгенных микориз, работы по созданию которых ведутся в на-

стоящее время. Неблагоприятное воздействие на окружающую среду может быть след-

ствием смены азотфиксирующими бактериями или полезными микоризами первона-

чального хозяина-носителя на нового симбионта. Такая смена хозяина может вызвать

резкое усиление

конкурентных возможностей нового носителя-симбионта, которое

может негативно сказаться на сложившихся взаимоотношениях внутри биоценоза. По-

теря симбионтной бактерии или микоризы в свою очередь может стать причиной уг-

нетения организма – мишени действия трансгенных ГИМ.

К сожалению, исследования воздействий, производимых природными микориза-

ми и природными или генно-инженерными Rhizobia, в большинстве своем касаются

только конкретного растения-хозяина и не предусматривают изучения изменений в

растительных сообществах и сообществах ризосферы растений при смене хозяина, по-

этому научные данные по этому вопросу практически отсутствуют [Hall, 1995]. Можно

предположить незначительность действия этого фактора в природных, особенно в

лесных, сообществах, где такой нецелевой эффект может проявить себя скорее всего.

Природные сообщества изначально разнообразны по своему видовому составу и весь-

ма стабильны, что может послужить защитным фактором от неожиданного и быстрого

изменения в почвенных и растительных сообществах. Однако интерес, который био-

технологи проявляют в настоящее время к трансгенозу микориз, требует более внима-

ГЛАВА ШЕСТАЯ

202

тельного изучения проблем экологических взаимоотношений с участием эндо- и экто-

микориз и бактерий ризосферы.

6. 10. Оценка вероятности возникновения прямого или

опосредованного действия продуктов трансгена

на организмы-немишени

С точки зрения выявления и оценки потенциальных последствий риск, связанный

с нецелевым воздействием продукта трансгена, является, пожалуй, одним из наиболее

сложных. С одной стороны, трудно учесть и выявить всех участников пищевой цепоч-

ки, которые могут подвергнуться действию токсина, включая все возможные взаимоот-

ношения хищничества и паразитизма. С другой стороны, множество факторов биоти-

ческого и абиотического свойства, которые практически невозможно воссоздать в ла-

боратории и даже в условиях ограниченного полевого эксперимента, могут повлиять

на вероятность, интенсивность и специфику проявления токсического эффекта. При

проявлении отдаленных эффектов, связанных с участием нескольких посредников ме-

жду первоначальным действием токсина и конечной непредвиденной мишенью, мо-

жет пройти несколько лет и генераций организмов, подверженных действию селек-

тивного фактора в той или иной степени. Поэтому окончательное суждение о нецеле-

вом действии токсина и его последствиях может быть составлено только после дли-

тельного мониторинга за объектом наблюдений или рядом связанных между собой

объектов в условиях широкомасштабного эксперимента в различных условиях окру-

жающей среды, отражающих в максимально возможном объеме условия известных

мест обитания организмов-немишеней.

Наиболее важная информация, необходимая для оценки нецелевого воздействия

ГИО на организмы-немишени, касается описания мест естественного произрастания

организма – реципиента трансгенного признака, его потенциально значимых взаимо-

действий с животными или другими организмами типичного для него биоценоза

(биологические особенности реципиентного или родительского организма). Выявле-

нию возможной токсичности и характера токсичного действия поможет информация о

характере генно-инженерной модификации: название донорного организма – источ-

ника трансгена, описание регуляторных и других элементов, влияющих на функцио-

нирование трансгенов. При описании биологических особенностей ГИО надо учиты-

вать активность и свойства протеина, кодируемого трансгеном, уровень экспрессии

трансгена, части растения, в которых трансгены экспрессируются (например, только в

зеленых частях растения или также в пыльце). При анализе информации о потенци-

альной принимающей среде и взаимодействии ГИО с окружающей средой наиболее

важны сведения, касающиеся идентификации и описания организмов-мишеней и ор-

ганизмов-немишеней, которые могут быть подвержены влиянию ГИО, а также пред-

полагаемого механизма и результата взаимодействия ГИО с организмами-мишенями.

При планируемом использовании ГИО в качестве биореакторов при оценке сведений,

касающихся условий высвобождения ГИО, следует уделить особое внимание мерам,

предохраняющим территорию посадок ГИО от нежелательного посещения ее живот-

ными.

Стройная система оценки нецелевого действия факторов, вызванных действием

трансгена, разработана в США Агентством по защите окружающей среды (US EPA).

Она представлена трехступенчатой схемой (рис. 6.6). На первом этапе устанавливают

наличие фактора риска, т.е. токсичности (происхождение токсина, характер его дейст-

вия), и уровень токсичности, который может привести к возникновению неблагопри-

ятных последствий (особенности экспрессии гена), а также выявляют круг предпола-

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

203

гаемых организмов-немишеней. Наличие токсических эффектов определяют на осно-

вании лабораторных тестов по скармливанию продукта трансгена, например опреде-

ленного типа Bt-протеина, кодируемого встроенным геном, ряду организмов, которые

могут оказаться в числе организмов-немишеней (более подробно методика оценки

токсичности рассматривается в разделе 5.3). Следуя принципу принятия мер предос-

торожности, в лабораторном остром эксперименте, как правило, используют повы-

шенные дозы предполагаемого токсина, употребляемого в виде очищенного вещества.

Если обнаружен поражающий эффект очищенного токсина, проводят лабораторные и

полевые тесты с применением посредника – медиатора действия токсина, например

пыльцы, которая может быть его переносчиком, или зараженных токсином личинок

либо яиц организма – мишени действия трансгенного признака. Определяют леталь-

ную дозу токсина (LD

) и дозу, вызывающую ингибирование роста и развития орга-

низма (сублетальный эффект ЕС

Предварительная оценка риска.

Лабораторный и полевой тест на

токсичность

(I этап анализа)

Характеристика

фактора стресса

(

этап анализа

)

Характеристика

объекта

/экосистемы

потенциального

риска

(II этап анализа)

Экологические

условия

воздействия

(II этап анализа)

Экологические

условия

воздействия

фактора

стресса

(II этап

анализа)

Предварительная

оценка риска с

учетом

экологических

условий

(вероятность

возникновения

риска)

(III этап

анализа)

Оценка степени

риска

воздействия

фактора риска

(ГИО) на объект

риска (организм

не- мишень)

1) поражающий

эффект

2) факторы

неопределенно

сти

3) возможность

использования

фактора риска

(ГИО)

(III этап анализа)

Рис. 6.6. Схема оценки экологического риска воздействия ГИО на организмы-немишени,

используемая Агентством по охране окружающей среды США (US ЕРА) (по Sears et al, 2001)

Поскольку наибольшую сложность вызывает определение круга возможных орга-

низмов-немишеней, для оценки новых видов токсинов биологического происхождения

US EPA предлагает использовать стандартные наборы организмов. Для Bt-токсинов это

птицы (несмотря на отсутствие подтвержденных сведений о Bt-токсичности в отноше-

нии теплокровных животных); водные животные (рыбы, обитающие на рисовых план-

тациях, или способные контактировать с пыльцой и другими частями Bt-растений и

Bt-микроорганизмами, водные беспозвоночные, например дафнии (Daphnia)), почвен-

ные животные – черви и ногохвостки (Collembola) и полезные насекомые. Среди тести-

руемых полезных насекомых должны быть обязательно представлены насекомые-

опылители на примере медоносной пчелы (Apis mellifera L.) (тест проводят на личинках

и взрослых особях) и еще три вида насекомых, принадлежащих к различным отрядам,

в которых встречаются виды-паразиты или хищники, питающиеся насекомыми-

вредителями. Это представители следующих групп: паразитарные двукрылые и гиме-

новые (например, Brachymeria intermedia – паразит домашней мухи), хищные жестко-

крылые (обычно божьи коровки Hippodamia convergent, Adalia bipunctata или Coccinella

septempunctata), полужесткокрылые, сетчатокрылые (обычно златоглазки), а также хищ-

ные клещи.

ГЛАВА ШЕСТАЯ

204

На втором этапе выявляют экологические факторы, в которых действует фактор

риска и которые определяют вероятность возникновения неблагоприятных последст-

вий, связанных с использованием ГИО. Эти факторы касаются биологии и экологии

самих ГИО (характеристика фактора риска), организмов-немишеней (характеристика

объекта потенциального риска) и среды их обитания (экологические факторы воздей-

ствия, такие как база питания организма-немишени и др.).

На третьем этапе проводят предварительную оценку степени риска с учетом всех

экологических условий действия фактора риска и окончательную оценку возможности

использования ГИО с учетом поражающего эффекта фактора риска, факторов неоп-

ределенности и условий предполагаемого регулирования риска.

Одним из примеров наиболее полного и последовательного изучения нецелевого

влияния трансгенных сельскохозяйственных растений на организмы-немишени слу-

жит оценка влияния выращивания Bt-кукурузы на численность популяции бабочки

Монарх (Donaus plexippus L., отряд Lepidoptera), проведенная группой ученых из США и

Канады. Поводом для исследования явились разногласия в среде научной обществен-

ности вокруг истинных причин существенного сокращения численности этого вида

насекомых, популяции которого населяют регионы так называемого «кукурузного

пояса» США, а также южную часть Канады и Мексику [Niiler, 1999].

В статье американских энтомологов [Losey et al., 1999] сообщалось о выявленном

токсическом эффекте пыльцы трансгенной кукурузы на рост и развитие гусениц упо-

мянутой бабочки. Выводы делались на основании данных лабораторного теста на ток-

сичность с использованием ручного напыления пыльцы трансгенной кукурузы клона

Bt11 (ген Cry1Ab) на листья одного из видов ваточника, которым в природе питается

бабочка. Это сообщение сразу же взяли на вооружение противники выращивания

трансгенных культур. Однако в ответ на статью были высказаны обоснованные сомне-

ния по поводу правильности постановки самого эксперимента, а также правильности

выводов о негативном влиянии Bt-кукурузы на численность бабочки, сделанных при

отсутствии каких-либо данных экологических исследований. Учитывая возникшие

разногласия, US EPA выделило грант на изучение проблемы и создало группу из спе-

циалистов-биологов различного профиля для исследования всех аспектов проблемы

согласно принципам и методам, применяемым этим учреждением. Схема эксперимен-

та представлена на рисунке 6.7.

На первом этапе анализа применили методику острого эксперимента по скарм-

ливанию гусеницам бабочки искусственного питания с добавлением очищенного кри-

сталлического токсина четырех типов (CrylAb, CrylAc, Cry9C и Cry1F); листьев ваточ-

ника (Asclepias ssp.), опыленных чистой пыльцой, ряда гибридов Bt-кукурузы (Bt11, 176

и Моn 810, вырабатывающих токсин CrylAb; Cbh351, вырабатывающего токсин Сгу9С,

и Dbt418, вырабатывающего токсин Cry 1F) и листьев ваточника, опыленных пыльцой,

загрязненной остатками вегетативных тканей кукурузы. Учитывали летальный

и суб-

летальный эффекты на разных стадиях развития гусеницы.

В эксперименте с добавлением чистого токсина было показано полное отсутствие

неблагоприятных эффектов при использовании токсинов Сгу9С и CrylF. Действитель-

ный токсический эффект при скармливании листьев, опыленных чистой пыльцой,

был выявлен только в случае трансгенной формы 176. Причем эффект проявлялся при

малых дозах нанесения

пыльцы, сопоставимых с реально возможными при переносе

пыльцы с кукурузы на растения ваточника в природе. В других случаях использования

Сrу1Ab-гена (Bt11 и Моn810) токсический эффект наблюдали только при загрязнении

пыльцы остатками вегетативных тканей растения, чего, как правило, не происходит

при естественном распространении пыльцы [Helmich et al., 2001]. На основании ре-

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

205

зультатов проведенного исследования было сделано заключение о возможном токсиче-

ском эффекте для гусениц бабочки в природных условиях только гибридов кукурузы,

происходящих от линии 176. К 2001 году этой кукурузой было засеяно менее 2% пло-

щадей, занятых всей трансгенной кукурузой США, и перерегистрация ее для даль-

нейшего использования не предполагалась.

Вегетативные органы – ген Cry1A – LD

–

3.3 ng/ml; EC

-0.76 ng/ml

Пыльца – ген Cry1A(b) – токсичность

зависит от использованного промотора

Bt176 – ингибирование роста (EC

) при 5-10

зернах на см

(лабораторный эксперимент) и

23 (полевой эксперимент)

Bt11(Cry1Ab), Mon810 проявление

ингибирования роста возможно только при

>1000 зерен на см

Dbt18 (Cry1Ac), Cbh351 (Cry9C), Tc1507

Токсический эффект

пыльцы Bt-кукурузы на

гусениц

(летальный LD50,

сублетальный EC50 эффекты)

Гибриды Bt-кукурузы

1) экспрессия Bt-гена

2) занимаемые площади

3) распределение по регионам

4) фенология

Бабочка (гусеница бабочки)

1) частота встречаемости

2) места обитания: регионы,

ландшафты (экосистемы),

предпочтения в пределах

ландшафта

3) фенология

Заросли ваточника

1) частота встречаемости

2) места обитания:

ландшафты

(экосистемы), частота

встречаемости на полях

и вокруг полей

Экологические

условия

воздействия

фактора стресса

(взаимодействие

факторов

• Гибриды Bt-

кукурузы

• Бабочка

• Заросли

ваточника

Предварительная

оценка риска с

учетом

экологических

условий

(вероятность

возникновения

риска)

Оценка степени риска

использования

различных гибридов

кукурузы со

встроенным геном Bt-

токсина на динамику

популяций бабочки

Монарх

1) поражающий эффект

2) факторы

неопределенности

3) возможность

использования

ГИО

4) условия менеджмента

ГИО

Выводы экспертизы: С учетом экологии вида бабочки

Монарх выращивание Bt-кукурузы не оказывает

заметного влияния на изменение численности вида.

Основное вредное влияние – использование химических

пестицидов и сокращение популяции ваточника в св

зи с

применением традиционных интенсивных технологий

возделывания и увеличением площадей под

сельскохозяйственным п

оизводством

Плотность осаждения пыльцы

в полевых условиях на 95%

листьев менее 600 зерен/см

Рис. 6.7. Схема оценки экологического риска токсического воздействия различных гибридов Bt-кукурузы

на выживаемость и численность популяции бабочки Монарх (Donaus plexippus)

Эксперимент выявил ряд сложностей, с которыми может быть связана реальная

оценка токсичности пыльцы на основе только лабораторного теста, и показал необхо-

димость проведения экологических полевых экспериментов для оценки реальных по-

следствий воздействия пыльцы Bt-кукурузы на развитие гусеницы и численность ба-

бочки.

Полевой эксперимент проводили на различных участках в разных штатах США и

Канады, отражающих наиболее типичные места обитания бабочки в различных кли-

матических зонах. Кроме токсического эффекта изучали плотность оседания пыльцы

на растениях ваточника, растущих внутри кукурузных полей и по их краям, влияние

климатических факторов (ветер, дождь) на распространение и сохранность пыльцы на