Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ШЕСТАЯ

206

листьях, предпочтения гусениц в питании в пределах растения [Pleasants et al., 2001;

Stanley-Horn et al., 2002].

В ходе эксперимента были подтверждены токсический сублетальный эффект

пыльцы гибрида кукурузы, происходившего от линии 176, и отсутствие эффектов для

гибридов, бравших начало от кукурузы Bt11 и Моn810. В случае гибрида от линии 176

установлена худшая выживаемость и развитие личинок, которые питались на растени-

ях ваточника, растущих внутри кукурузных полей, по сравнению с выживаемостью

тех, что кормились за пределами поля. Это объяснялось большей плотностью оседания

пыльцы на ваточнике внутри полей. Средняя плотность оседания пыльцы для всех

гибридов кукурузы оказалась примерно одинаковой и составляла 127 пыльцевых зерен

на 1 см

листа. Токсический эффект для линии 176 был заметен при плотности пыльцы

около 67 зерен на 1 см

. Как показали лабораторные тесты, для того чтобы выявить ток-

сичность Bt11 и Моn810, плотность пыльцы должна превышать 1000 зерен на 1 см

лис-

та, что в природных условиях практически нереально (на 95% листьев ваточника плот-

ность пыльцы не превышала 600 зерен на 1 см

). Количество пыльцы на сорных расте-

ниях резко уменьшалось при выпадении дождей. Обнаружено, что личинки предпо-

читают кормиться на верхушечных листьях ваточника, тогда как максимальное коли-

чество пыльцы наблюдалось на среднем ярусе листьев этих растений. Даже в случае

питания гусениц на полях кукурузы линии 176 сублетальный эффект был ниже, чем

для гусениц, питавшихся на полях нетрансгенной кукурузы, обработанных инсекти-

цидом λ-цихалотрином. Таким образом, в полевом эксперименте подтверждена полная

безопасность большинства используемых ныне гибридов CrylAb Bt-кукурузы. Даже ес-

ли токсический эффект проявлялся, он был ниже того, который наблюдался при вы-

ращивании нетрансгенной кукурузы, обрабатываемой химическими инсектицидами.

На втором этапе полевых исследований изучали экологические условия воздейст-

вия стрессового фактора. Были установлены численность и плотность популяций ба-

бочки в различных регионах «кукурузного пояса» (штаты Миннесота, Айова, Мэри-

ленд, Висконсин в США и Онтарио в Канаде), зависимость численности бабочки от

количества зарослей ваточника. Определены предпочтения бабочек в откладывании

яиц между растениями, растущими внутри и снаружи кукурузных

полей, характер

распределения популяций ваточника и их численность в разных регионах выращива-

ния кукурузы. Кроме этого проведена оценка вероятности перекрывания во времени в

разных климатических регионах двух важных с точки зрения интенсивности токсиче-

ского действия кукурузы фенологических событий – периода откладывания яиц и раз-

вития гусениц бабочки и максимума пыления кукурузы [Oberhauser et al., 2001].

Было

выяснено, что бабочка привязана к растениям ваточника, расположенным

внутри или вокруг полей кукурузы, весь период своего развития. Численность бабочек

на одно растение ваточника практически одинакова как в агросреде, так и в неокуль-

туренных (природных) местах произрастания ваточника. В регионах с большой плот-

ностью кукурузных полей и редко встречающимися природными зонами бабочки от-

дают явное предпочтение агросреде, поскольку это основные места произрастания ва-

точника, являющегося кормовой базой бабочек и их личинок. В менее освоенных ре-

гионах явного предпочтения не наблюдалось. Обитающие в агросреде бабочки пред-

почитали растения ваточника, растущие внутри полей, что, очевидно, объяснялось

меньшей конкуренцией бабочек с другими видами насекомых и животных.

При изучении перекрывания по времени максимального пыления кукурузы (мак-

симального увеличения плотности пыльцы) и периодов развития бабочки оказалось,

что в южных штатах, где бабочка чаще селится внутри кукурузных полей, основная

часть особей успевает пройти стадию личинки и развиться до взрослого состояния до

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

207

начала интенсивного пыления кукурузы. В северных регионах периоды пыления ку-

курузы и личиночной стадии бабочки совпадали, но именно в этих регионах у бабочек

больше возможностей селиться за пределами агросреды. Таким образом, было показа-

но, что основное влияние на численность бабочек оказывает кормовая база, т.е. нали-

чие зарослей ваточника, а оно в свою очередь в наибольшей степени определяется ис-

пользуемыми в том или ином регионе методами ведения сельскохозяйственного про-

изводства (применение вспашки, гербицидов, выбор основной сельскохозяйственной

культуры).

В результате проведенных исследований экспертная группа сделала следующие

обобщенные выводы:

1. Экспрессия Bt-токсинов в пыльце большинства коммерческих гибридов куку-

рузы очень мала. Поэтому лабораторный и полевой тесты показывают отсутствие ток-

сических эффектов при плотности пыльцы, обычной при пылении кукурузы.

2. Только часть бабочек использует заросли ваточника внутри и возле кукуруз-

ных полей. При этом наблюдается различное и ограниченное перекрывание периода

основного пыления кукурузы и активного периода размножения и развития бабочек.

Поэтому токсичность пыльцы не может радикальным образом повлиять на числен-

ность вида бабочки.

3. С учетом площадей, занимаемых трансгенной Bt-кукурузой, уровня токсично-

сти и экспозиции действия токсина (плотность и время действия пыльцы) риск воздей-

ствия трансгенной кукурузы на численность популяции бабочки Монарх можно при-

знать крайне незначительным. По расчетам экспертов, при существовавшем в 2000–

2001 годах уровне использования гибридов на основе линии 176 риску токсического

действия пыльцы этих гибридов могли подвергнуться не более 0,8% популяции бабоч-

ки, обитающей в регионе «кукурузного пояса» [Sears et al., 2001]. Это еще раз говорит о

незначительности нецелевого действия трансгена (даже если оно присутствует) на

численность вида-немишени.

4. Основной причиной сокращения численности бабочки Монарх в США следу-

ет признать сужение ее природного ареала в связи с интенсивным сельскохозяйствен-

ным производством и связанным с ним сокращением численности ваточника, на кото-

ром бабочка кормится и размножается.

6.11. Появление живых организмов,

резистентных или толерантных к продуктам трансгенов

6.11.1. Живые организмы, резистентные и толерантные к продуктам трансге-

нов. Насекомые-вредители, сорняки и болезни являются основными причинами по-

терь в сельскохозяйственном производстве во всем мире. Поэтому селекция на рези-

стентность или толерантность к болезням и вредителям во все времена являлась одним

из основных направлений селекции сельскохозяйственных культур. Одновременно

разрабатывались и

продолжают разрабатываться различные искусственные средства

защиты растений, в первую очередь химические (инсектициды, гербициды, фунгици-

ды), использование которых обусловливает появление массы новых проблем. Кроме

негативного влияния на здоровье людей и проникновения в продукты питания, про-

исходит накопление остатков пестицидов, прежде всего гербицидов, в почве, загрязне-

ние грунтовых и поверхностных вод, снижение биологического

разнообразия вследст-

вие нецелевого отравляющего влияния на полезных и нейтральных насекомых и жи-

вотных, включая млекопитающих, птиц и рыб. С использованием химикатов связыва-

ют и появление устойчивости к ним вредителей. Создание трансгенных сельскохозяй-

ственных растений с пестицидными свойствами и устойчивостью к гербицидам позво-

ГЛАВА ШЕСТАЯ

208

ляет одновременно повысить урожай и его сохранность и решить, хотя бы частично,

проблемы, связанные с химизацией сельского и лесного хозяйства.

Практика показывает, что появление устойчивых к вредителям и патогенам но-

вых сортов и использование новых химических препаратов защиты растений сопрово-

ждается обратным процессом адаптации к ним патогенов. Адаптация основана на ге-

нетических изменениях в популяции под действием факторов окружающей среды,

главным из которых является воздействие пестицида или растения с пестицидными

свойствами. В результате такой адаптации популяция патогена может выживать, не-

смотря на селекционный прессинг, вызываемый пестицидом или устойчивостью рас-

тения к патогену. Как правило, контроль численности таких обретших резистентность

популяций патогена проводить гораздо сложнее, и обходится он дороже, чем контроль

исходных популяций. В худших случаях вредители могут совершенно выйти из-под

контроля.

Существование в настоящее время большого числа различных резистентных к

пестицидам вредителей связано с активным использованием химикатов, создавших не-

обычайный селекционный прессинг, ускоривший эволюционный процесс развития

устойчивости. Этот процесс продолжается и носит глобальный характер. Так, первый

случай устойчивости к гербициду был зафиксирован в 60-х годах прошлого века. А в

90-х было уже известно 84 случая устойчивости сорняков по крайней мере к одному из

гербицидов и описаны случаи комплексной устойчивости к широкому спектру герби-

цидов среди сорняков пшеничных полей в Австралии.

С 60-х годов прошлого века отмечено появление устойчивости к фунгицидам сре-

ди патогенных грибов. В 80-х годах было известно уже о более ста видах патогенных

грибов, развивших устойчивость к одному и более фунгицидам.

На примере насекомых-вредителей наиболее ярко прослеживается процесс при-

обретения и развития признака устойчивости к пестицидам. За последние несколько

десятков лет различные формы устойчивости приобрели более 530 видов насекомых

[Whalon, Norris, 1999]. Объясняется это тем, что насекомые используют разнообразные

адаптационные стратегии развития устойчивости. Они могут приспосабливать свое

пищеварение к безопасному перевариванию вторичных токсичных метаболитов рас-

тений-хозяев или развить механизм детоксикации или нейтрализации токсина. У них

может появиться новое пищевое поведение, они могут сменить свои пищевые пред-

почтения или полностью перейти на питание новым видом растения.

Использование трансгенных растений имеет более короткую историю по сравне-

нию с химизацией сельского хозяйства. Массовое коммерческое использование транс-

генных растений, устойчивых к гербицидам или несущих Bt-устойчивость к насеко-

мым-вредителям, приходится на начало 90-х годов прошлого века. Но мы уже имеем

пример приобретения комплексной устойчивости к гербицидам у трансгенного рапса

и передачу такой устойчивости нетрансгенным сортам [Hall et al., 2000; Orson, 2002 и

др.]. Как растение предшествующей культуры рапс с комплексной устойчивостью к

гербицидам сам может представлять немалую проблему для контроля над сорняками

при выращивании последующей за ним культуры. Однако вероятность интрогрессии

генов гербицидоустойчивости к его диким сорным сородичам усугубляет проблему

развития устойчивости к гербицидам при участии этой трансгенной культуры.

Этот пример показывает один из путей появления у диких сорных или культур-

ных растений устойчивости к гербицидам – миграцию генов. Второй путь – эволюци-

онная адаптация популяций сорняков на фоне загрязнения их мест обитания герби-

цидами. Предполагается, что выращивание трансгенных растений, устойчивых к гер-

бицидам, может привести к эффекту «неполного расхода реагента». Присутствующий

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

209

в почве в малых концентрациях гербицид, в целом продолжая подавлять популяцию

сорных растений, может не препятствовать выживанию генотипов, обладающих час-

тичной толерантностью к гербициду, и тем самым послужить фактором отбора на ус-

тойчивость к этому препарату.

Пока что не зафиксировано случаев приобретения насекомыми устойчивости к

коммерческим сортам Bt-растений. Однако известен случай приобретения устойчиво-

сти к распыляемому препарату на основе Bacillus thuringiensis одним из основных вре-

дителей крестоцветных культур – капустной молью (Plutella xylostella L.) [Tabashnik et

al., 1990]. В лабораторном эксперименте было показано, что устойчивые к Bt-токсину

популяции P. xylostella могут нормально развиваться и на Bt-трансгенных растениях

рапса [Ramachandran et al., 1998a].

В отличие от быстро разрушающихся на свету бактериальных препаратов Bt-

протеина постоянно действующие

в течение сезона летальные или полулетальные до-

зы Bt-токсинов трансгенных растений обеспечивают более длительный и сильный се-

лекционный прессинг на популяцию вредителя, что может стать источником ускоре-

ния процесса приобретения или закрепления у него устойчивости. В настоящее время

известны пятнадцать видов насекомых, развивших устойчивость к бактериальным рас-

пыляемым препаратам Bt-токсинов [Whalon, Norris, 1999].

Поэтому уже сейчас стоит

подумать о мерах, которые могут уменьшить потенциальную адаптацию вредителей к

трансгенным растениям с Bt-устойчивостью.

Развитие резистентности у вредителей (насекомых, сорняков, болезнетворных

грибов и микроорганизмов) к новым токсинам имеет генетическую основу и происхо-

дит под влиянием селективного фактора действия пестицида и других условий окру-

жающей среды, которые, как правило, известны исходя из данных об организме – ре-

ципиенте трансгенного признака, характера модификации, особенностей ГИО и усло-

вий принимающей среды. Все это дает основание рассматривать управление этим

фактором риска как вполне реальный и осуществимый процесс. Под управлением

фактором риска «развитие резистентности», или, как принято называть этот процесс в

мире, «менеджментом резистентности», понимают процесс приведения развития рези-

стентности в популяциях вредителя в допустимое русло.

Как показывает история использования пестицидов и множество научных иссле-

дований в области менеджмента резистентности, полностью исключить постепенную

адаптацию к пестицидам практически невозможно. Поэтому вопрос стоит не об абсо-

лютном предотвращении процесса адаптации, а о его максимальном замедлении и

уменьшении вредоносного эффекта. Основные усилия направляются на регулирова-

ние факторов, которые могут оказывать влияние на развитие резистентности. В на-

стоящее время в мире используются пять ключевых стратегий, на которых в той или

иной степени основаны все предлагаемые программы менеджмента развития рези-

стентности [McGaughey, Whalon, 1992; Snow, Palma, 1997; Whalon, Norris, 1996, 1999]

(табл. 6.4).

Первая стратегия получила название стратегии гена. Она нацелена на уничтоже-

ние гетерозиготных особей, появившихся в результате скрещивания чувствительных и

резистентных особей из популяции вредителя. Согласно теории полурецессивного ха-

рактера резистентности насекомых, устойчивость особей варьирует в зависимости от

количества аллелей резистентности у каждого из индивидуумов. В соответствии с этой

моделью гетерозиготные резистентные особи, получившиеся от скрещивания чувстви-

тельных и резистентных, имеют промежуточный характер устойчивости и могут вы-

жить только при минимальной экспозиции токсина [Levidov, 2003]. Увеличение токси-

ческого эффекта до критической отметки, убивающей всех гетерозиготных особей,

ГЛАВА ШЕСТАЯ

210

способно радикальным образом снижать вероятность возникновения резистентной

популяции. На сегодняшний день наиболее надежным средством реализации этой

стратегии является получение трансгенных растений, в которых экспрессия Bt-генов

была бы достаточной для уничтожения гетерозиготных особей на протяжении всего

периода вегетации растения. Другие стратегии гена включают совместное или каскад-

ное действие разных генов Bt-токсичности либо использование разных механизмов

достижения летальности вредителя в одном растении. В настоящее время большинство

коммерческих сортов Bt-трансгенных растений пока что экспрессируют только один

ген токсичности.

Таблица 6.4

Основные стратегии использования генно-инженерных модификаций токсичности, препятствующие

развитию резистентности к ним патогена-мишени (по McGaughey, Whalon, 1992)

Область

применения

Возможная тактика использования

модификации

Решаемая задача

Альтернативный

выбор гена

Использование одного гена токсичности

Использование нескольких генов ток-

сичности

Использование химерных генов (генети-

чески отличных от оригинального гена ток-

сичности)

Активация одного или нескольких

агентов контроля патогена (инсекти-

цидный протеин, регуляторы роста

патогена, ингибиторы протеиназ и

т.д.) в одном растении. Происходит

смена селективного фактора, что

сказывается

на снижении развития

резистентности у патогена

Использование

разных промоторов

Конститутивный промотор (постоянная

доза токсина во всех тканях растения)

Тканеспецифическая экспрессия гена (в

определенных частях растения, например

только в плодах, только в корнях, только в

пыльце и т.д.)

Индуцибельный промотор (действует

только при определенных обстоятельствах,

например при опрыскивании химическим

препаратом или при физическом поврежде-

нии растения)

Контроль дозы токсина на протяже-

нии всей жизни растения и/ или в

определенных частях растения

Особенности

экспрессии гена

Высокая

Низкая

Смешанная

Контроль дозы токсина в результате

генной регуляции количества и/или

качества токсина, экспрессируемого в

тканях растения

Тактика

использования гена

(тактика полевого

использования

источника

токсичности)

Однородное использование одного гена

Использование смеси генов (смесь семян)

Ротация гена или очередность использо-

вания генов (временное разделение дейст-

вия генов)

Мозаичные посадки (смена участков или

регионов посадок)

«Островки безопасности» (пространст-

венные или временные участки отсутствия

действия гена

токсичности)

Регуляция дозы токсина посредст-

вом манипуляции размещения транс-

генных растений на поле

Вторая стратегия заключается в периодической или полной замене источника токсич-

ности или комбинировании источников токсичности (смена фактора эволюционного

прессинга). Очевидно, что смертность в популяции, вызванная различными причина-

ми (в результате одновременного действия разных механизмов воздействия токсинов),

будет препятствовать адаптации. Комбинация таких причин может быть достигнута

разными способами, которые используют как

при традиционных способах обработки

пестицидами, так и при выращивании трансгенных растений.

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

211

Первый способ – использование комбинации двух или более токсинов по очереди

или одновременно. В настоящее время кроме 11 генно-инженерных модификаций Bt-

токсичности, которые уже сами по себе предоставляют возможность для комбинирова-

ния, предлагается ряд других источников токсичности различного происхождения (см.

табл. 6.3). Эффект может достигаться как смешением при посадке семян, принадлежа-

щих различным генетическим линиям, экспрессирующим различные токсины, или

сменой линий в севобороте, так и генно-инженерным созданием линий с одновремен-

ным (или один за другим) действием нескольких разных генов токсичности (стратегия

гена). В настоящее время при разработке мульти-локусных модификаций устойчиво-

сти отдают предпочтение комбинированию Bt-генов как наиболее целенаправленных

по действию в отношении мишени и, следовательно, наиболее безопасных с точки

зрения нецелевого влияния на организмы-немишени. Однако в ближайшем будущем,

очевидно, Bt-гены будут комбинироваться с другими источниками токсичности более

широкого спектра действия в выборе мишени, но обладающими иными механизмами

обеспечения токсического действия. Связано это с тем, что некоторые насекомые-

вредители, например капустная моль (Plutella xylostella) или табачная листовертка-

почкоед (Heliothis virescens), могут приобретать резистентность сразу к нескольким Bt-

токсинам.

Исходя из теории полурецессивного характера резистентности насекомых, пред-

полагается наличие у некоторых видов вредителей по крайней мере двух независимых

рецессивных локусов разного характера действия, обеспечивающих выживание гетеро-

зиготных особей в популяции и адаптацию популяции к новому токсину [Snow, Palma,

1997; Stewart et al., 2000]. Высказываются опасения, что устойчивость к Bt-токсинам мо-

жет иметь и доминантный характер, что может обусловливать более быстрое распро-

странение аллелей резистентности и развитие адаптивности популяций, имеющих та-

кие аллели [Levidov, 2003]. По мнению М. Whalon и L. Norris (1999), сочетание Bt-генов

с другими источниками токсичности является самой лучшей стратегией поддержания

успешности широкого и эффективного использования Bt-растений.

Третья стратегия – поддержание чувствительности популяции к определенному типу

токсина (уменьшение действия селективного прессинга). Идея этой стратегии состоит

не в стопроцентном уничтожении особей в популяции вредителя, а в сохранении и

поддержании в популяции определенного количества чувствительных к токсину осо-

бей (т. е. гомозиготных по гену чувствительности к токсину). Эти особи могут передать

потомству гены чувствительности и таким образом препятствовать отбору на рези-

стентность.

Сохранение чувствительных особей осуществляется путем создания так называе-

мых «островков безопасности» – растений, не несущих гены токсичности. Островки

безопасности могут создаваться за счет мозаичных посадок трансгенных и нетрансген-

ных форм в коммерческих посевах в пропорции, позволяющей не снижать урожай-

ность культуры за счет поражения вредителем и в то же время сохранять популяцию

чувствительных особей вредителя. Например, чтобы контролировать чувствительность

к Bt-токсину большинства вредителей рапса, достаточно добавить к посадкам транс-

генных растений 10% нетрансгенных [Hokkanen, Wearing, 1995]. Для большинства

культур рекомендуется пропорция 80% трансгенных и 20% нетрансгенных растений

[Whalon, Norris, 1996]. Тканеспецифическая экспрессия гена и экспрессия гена на оп-

ределенных этапах развития растений (временное лимитирование действия гена ток-

сичности) также могут нести функции островков безопасности.

Мозаичность достигается разными способами: смесью семян, высеваемых на од-

ном поле; посадкой блоками в пределах одного поля или чередованием трансгенных и

ГЛАВА ШЕСТАЯ

212

нетрансгенных полей; чередованием посадки трансгенных и нетрансгенных растений

по годам. Выбор типа мозаичности может зависеть от типа трансгенной культуры, ус-

ловий окружающей среды, применяемой сельскохозяйственной технологии и других

факторов. Однако решающее значение здесь играет учет поведенческих характеристик

вредителя, в первую очередь подвижность взрослых особей и личинок. Чаще всего в

качестве наиболее эффективного способа предлагается посадка блока или нескольких

блоков нетрансгенных растений внутри поля трансгенной культуры [Ramachandran et

al., 1998a, b; Hoy, 1999; Shelton et al., 2000 и др.].

Четвертая стратегия – прогнозирование появления и мониторинг за развитием рези-

стентности. Предварительная оценка популяций вредителя на вероятность развития

ими резистентности и изучение процесса адаптации к токсину должны помочь вы-

явить появление резистентности популяций на ранних этапах и таким образом упро-

стить дальнейший контроль над этим нежелательным явлением. Основные положения

и подходы, предлагаемые этой стратегией, наиболее полно изложены в «Меморандуме

ЕРА и USDA по менеджменту резистентности Bt-трансгенных культур» [ЕРА and

USDA Position Paper on Insect Resistance Management in Bt Crops, 1999]. Согласно Мемо-

рандуму, разработка плана мониторинга и менеджмента резистентности является обя-

зательным условием при регистрации Bt-трансгенных культур. Мониторинг преду-

сматривает периодический отбор проб особей из популяций вредителя и их изучение

с помощью недорогих диагностических средств или в специальных лабораториях с бо-

лее сложным оборудованием. Для взятия проб предлагается всемерное привлечение

сельскохозяйственных производителей, которые выращивают Bt-кулыуры.

К сожалению, этот подход, хорошо зарекомендовавший себя в развитых странах с

достаточно большим опытом выращивания трансгенных растений, пока мало досту-

пен развивающимся странам из-за своей высокой стоимости и необходимости создания

специальных структур для осуществления мониторинга. Но именно развивающиеся

страны рассматриваются как основное поле деятельности будущего маркетинга Bt-

токсичных культур.

И наконец, пятая стратегия – неукоснительное выполнение соответствующих условий

эксплуатации в каждом конкретном случае использования

трансгенных растений. Эта стра-

тегия имеет самое широкое применение и действует одновременно со всеми другими.

Основная идея этой стратегии – использование трансгенных растений с устойчивостью

к вредителям должно осуществляться на основании предварительной оценки риска

возникновения резистентности и с учетом всех требований по всемерному предотвра-

щению этого риска. Оценка производится по принципу индивидуального

подхода в

соответствии с условиями конкретного региона использования ГИО и с учетом опыта

более ранних случаев появления резистентности патогенов к подобного рода пестици-

дам (токсинам). Сравнительный подход требует глубокого и полного изучения как ус-

ловий окружающей среды, так и условий сельскохозяйственного производства, прису-

щих данному региону, а также биологии и экологии растения-хозяина и организма-

мишени и их взаимодействия.

Основные элементы, которые требуется учитывать при оценке вероятности раз-

вития резистентности к токсину: 1) особенности культуры, которые могут оказать

влияние на развитие адаптации к токсину у организма-мишени; 2) особенности биоло-

гии вредителя-мишени: количество видов растений-хозяев вредителя, способность ви-

да-вредителя к развитию резистентности к токсину; 3) возможность и выгодность ис-

пользования подходящих генно-инженерных технологий в свете полученных данных о

характере культуры и ее вредителя. По результатам оценки определяют, может ли

быть использована та или иная генно-инженерная модификация для решения про-

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

213

блемы устойчивости данной культуры в данном регионе, выбирается стратегия под-

держания чувствительности популяций патогена к токсину.

6.11.2. Трансгенные вирусные ДНК (РНК). История трансгенных растений, устой-

чивых к вирусам, берет начало с 1986 года, когда P. Powell-Abel с соавторами создали

растение табака, устойчивое к вирусу табачной мозаики (TMV) [Powell-Abel et al., 1986].

С тех пор увидело свет множество трансгенных культур, устойчивых к широкому спек-

тру вирусов. Эти растения являются примером использования патоген-зависимой ре-

зистентности – резистентности, определяемой действием патогена (вирусными гена-

ми). Среди агентов резистентности вирусного происхождения, инкорпорируемых в

растительный геном, можно назвать гены, кодирующие капсидный белок (СР-белки –

от английского словосочетания coat proteins); дефектные гены белков, обеспечиваю-

щих движение вирусов и их проникновение в клетку; гены репликаз, протеиназ и их

вспомогательных компонентов [Sanford, Johnston, 1985; Lomonossoff, 1995]. Однако ча-

ще всего для развития резистентности растений к вирусам используют трансгеноз СР-

генов. К настоящему времени использование СР-системы позволило добиться рези-

стентности растений к 23 различным видам, принадлежащим по крайней мере к 13

группам РНК-содержащих вирусов [Gramet, 1995].

Устойчивость к вирусным заболеваниям – одно из наиболее ценных достижений

современной генно-инженерной биотехнологии. Однако, несмотря на неоспоримые

преимущества при использовании, трансгенные вирусоустойчивые растения могут

представлять собой и определенный фактор экологического риска. Фактор риска свя-

зан с предполагаемой вероятностью взаимодействия продуктов вирусного трансгена

(РНК или вирусного протеина) с природными вирусами по типу синергизма, транс-

капсидации или рекомбинации. Эти взаимодействия теоретически могут привести к

повышению активности вирусов, выражающейся как в усилении их поражающего дей-

ствия, так и расширении первоначального видового состава их потенциальных носи-

телей. В качестве фактора риска в отношении некоторых групп растений рассматрива-

ется также вероятность миграции гена вирусоустойчивости к представителям диких

родственных видов (появление резистентности или толерантности к вирусам может

стать фактором неконтролируемого увеличения их численности).

Повышение активности вирусов может быть вызвано фенотипическими измене-

ниями во взаимодействии вирусов между собой и их кумулятивным действием на рас-

тение-носитель (при синергизме вирусов и транскапсидации) или иметь в своей основе

генетические изменения вирусной РНК при ее рекомбинации с РНК трансгенного ус-

тойчивого к вирусам растения.

При синергизме два или более различных вируса могут одновременно заражать

растение. При этом комбинированное действие этих вирусов имеет больший пора-

жающий эффект, чем тот, который был бы при поражении каждым из вирусов в от-

дельности. В случае взаимодействия вирусов с трансгенным

растением существует ве-

роятность эффекта синергизма при взаимодействии РНК или протеинов, являющихся

продуктами трансгена, с вирусом другого типа (не родственного трансгену), зара-

жающего трансгенное растение. До настоящего времени не было зафиксировано ни

одного случая синергизма у трансгенных растений, однако такие взаимодействия ме-

жду вирусами, одновременно заражающими одно растение, неоднократно наблюда-

лись у нетрансгенных растений. Впервые замечен и наиболее полно изучен эффект

синергизма при одновременном заражении картофеля вирусами картофеля X (PVX) и

Y (PVY) [Agbios, 2001]. Механизмы, лежащие в основе проявления эффектов синергиз-

ма, еще мало изучены. Однако было установлено, что значимую роль для их возникно-

вения в случае взаимодействия PVX и PVY играет 5’-терминальная последовательность

ГЛАВА ШЕСТАЯ

214

PVY-генома размером в 3544 нуклеотида, кодирующая протеазу-1 (Р1), компонент-

помощник протеазы (НС-Pro) и протеин-3 (РЗ) [Vance et al., 1995].

В научной литературе, посвященной экологическим проблемам биобезопасности,

неоднократно поднимался вопрос о потенциальной опасности другого типа взаимо-

действия вирусов – транскапсидации (иначе гетерокапсидации). При транскапсидации

происходит замена капсидной белковой оболочки одного типа вируса на капсидную

оболочку другого. Если первый вирус мог распространяться от растения к растению

посредством растительноядных насекомых (например, тлей (Aphis), колорадского жука

(Lepidoptera decemneliata) и многих других), то передача его капсидной оболочки второ-

му вирусу, не имевшему такой способности, приводит у второго вируса к ее появле-

нию. Таким образом, транскапсидация рассматривается как способ расширения числа

потенциальных носителей вирусов, которые раньше были ограничены в выборе хо-

зяина из-за невозможности переноса растительноядными насекомыми. В случае с

трансгенными вирусоустойчивыми растениями РНК вируса, заражающего трансген-

ное растение, может приобрести новую белковую оболочку (энкапсидироваться), ко-

дируемую СР-трансгеном этого растения.

В модельных системах (с искусственно созданными оптимальными для протека-

ния процесса условиями) возможность транскапсидации была продемонстрирована

для нескольких типов вируса, например для вируса желтой карликовости ячменя

(группа luteovirus), представителей группы вирусов, к которым также принадлежит

PVY (группа potyvirus) [Bourdin, Lecoq, 1991], и вируса кустистой карликовости томатов

(группа tombusvirus) [Dalmay et al., 1992]. Также была продемонстрирована возмож-

ность транскапсидации с участием вирусного СР-белка трансгенных растений [Dalmay

et al., 1992; Lecoq et al., 1993]. Например, Н. Lecoq с соавторами (1993) наблюдали зара-

жение трансгенных растений кабачка со встроенным СР-геном от переносимого тлями

вируса желтой мозаики кабачка (potyvirus) вирусными штаммами, которые тлей пере-

носиться не могут (имеют дефектный трансмиссионный фактор в СР-гене). Однако в

природных условиях явление транскапсидации наблюдается исключительно редко,

хотя известны многочисленные случаи совместного сосуществования нескольких виру-

сов в разных сельскохозяйственных

и древесных растениях [Falk et al., 1995].

Таким образом, несмотря на теоретическую возможность транскапсидации и си-

нергизма при участии вирусных генов трансгенных растений, осуществление этих со-

бытий в естественных условиях представляется маловероятным. Кроме того, синергизм

и транскапсидация у сельскохозяйственных культур могут иметь только кратковре-

менный фенотипический эффект, который прекращается вместе с окончанием вегета-

ции

трансгенного растения. По мнению С.М. Henry с соавторами (1995), транскапси-

дацию вообще не стоит рассматривать как проблему, поскольку трансмиссия капсид-

ного белка представляет собой единичные случаи, и даже если вирусы приобретают

такой белок, они быстро возвращаются к использованию своего собственного.

В целом вероятность неблагоприятных последствий для сельскохозяйственных

культур и окружающей среды транскапсидации и синергизма с участием устойчивых

к вирусам трансгенных растений можно оценить как очень низкую. А эффекты, кото-

рые могут последовать для трансгенных растений от реализации синергизма или

транскапсидации, не могут превышать тех, что имеют место при заражении вирусами

нетрансгенных вирусочувствительных растений.

Рекомбинация вирусной РНК со встроенными участками генома растений вирус-

ного происхождения гораздо чаще по сравнению с двумя предыдущими явлениями

рассматривается в качестве реального источника неблагоприятных последствий для

окружающей среды в литературе, касающейся безопасности использования растений с

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

215

трансгенным признаком устойчивости к вирусам. Как известно, эти последствия будут

определяться вероятностью события (фактора риска) и его возможным поражающим

эффектом. Насколько вероятна рекомбинация генов между РНК двух вирусов или

РНК вирусов и вирусными генами трансгенных растений?

Впервые рекомбинацию вирусных РНК обнаружил G.K. Hirst (1962) при совмест-

ном заражении животных разными штаммами полиовируса. С тех пор был опублико-

ван ряд сообщений о рекомбинации РНК животных и растительных вирусов. В качест-

ве доказательства существования рекомбинации между вирусными РНК приводятся

данные лабораторных экспериментов с использованием штаммов вирусов с функцио-

нальными дефектами. В результате взаимодействия в совместно инфицированных

растениях дефектных вирусов с полноценными функции первых восстанавливались,

что служит подтверждением наличия рекомбинации РНК дефектных и полноценных

вирусов [Agbios, 2001]. Однако до сих пор нет ни одной публикации по поводу реком-

бинации между совместно инфицированными дикими типами вирусов. Возможно, это

связано со сложностью учета частоты рекомбинации РНК между бездефектными ди-

кими штаммами вирусов. Ведь даже если рекомбинация имеет место, это событие от-

носится к разряду крайне редких. Для рекомбинации необходимо совпадение по

крайней мере двух событий: два вируса должны одновременно находиться в состоянии

репликации РНК и в непосредственной близости в клеточном пространстве.

Та же система с использованием дефектных функциональных генов применяется

для обнаружения рекомбинации между РНК растительных вирусов и РНК инфици-

руемых трансгенных растений. Была выявлена возможность рекомбинации между

РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и РНК трансгенных растений со встро-

енными генами вирусов хлорозной пятнистости вигны (CCMV) и кустистой карлико-

вости томата (TBSV) [Borja et al., 1999]. Показано также восстановление двигательной

функции белка у дефектного по этому признаку штамма CaMV после его инокуляции

в трансгенные растения рапса с экспрессией гена CaMV ORFVI, кодирующего двига-

тельный протеин, необходимый для систематического заражения растений вирусом

мозаики цветной капусты [Gal et al., 1992]. Таким же образом А.Е. Green и R.F. Allison

(1996) удалось продемонстрировать рекомбинацию РНК растения с трансгеном, коди-

рующим З’-терминальную часть капсидного протеина CCMV и РНК изолята CCMV, в

котором гены, кодирующие этот участок протеина, отсутствовали. Таким образом,

нельзя исключить вероятность случаев рекомбинации как между РНК вирусов, при-

надлежащих к одной или разным группам, так и вероятность рекомбинации РНК ви-

русов с участками РНК, являющихся продуктами транскрипции встроенных генов ви-

русного происхождения трансгенных растений.

Если такая рекомбинация возможна, возникает второй вопрос: может ли реком-

бинация между РНК трансгенного происхождения и РНК инфицирующего вируса

стать причиной возникновения новых штаммов вируса с более сильными, чем у ис-

ходного штамма, поражающими свойствами? К настоящему времени нет ни одного

экспериментального подтверждения такого увеличения патогенности. В ряде экспе-

риментов, изучавших поражения, вызываемые у растения рекомбинантным вирусом,

было показано появление новых случайных симптомов, однако они не увеличивали

поражающего эффекта, производимого

дикой формой вируса при совместном зара-

жении [Allison et al., 1999; Agbios, 2001]. К сожалению, в этих экспериментах не прово-

дилось сравнение отдельно действующих поражающих эффектов рекомбинантного и

исходных диких типов вируса. Можно предположить, однако, что рекомбинантные

вирусы по своему действию на трансгенное растение-хозяин или при совместном с ис-

ходными формами заражении растений не будут сильно отличаться от диких штам-