Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Ферритин

303

щие железо, могут быть почти полностью отделены от белка обра-

боткой растворами сильных щелочей [28], 5%-ным гипохлоритом

натрия [29], перекисью водорода [30], додецилсульфатом натрия

(SDS) [31] или уксусной кислотой [32]. При такой обработке

мицеллы теряют большую часть содержащегося в них фосфата

[28] и агрегируют, образуя темный красно-коричневый осадок. Под

>ис. 8.2. Электронная микрофотография ферритина, полученная методом нега-

тивного контрастирования с помощью натриевой соли фосфорномолибденовой

ислоты, любезно предоставленная Д. X. Хаггисом. Железосодержащие ядра

эерритина окружены белковыми оболочками, которые кажутся светлыми на фоне

негативной окраски (X 500 ООО).

лектронным микроскопом они выглядят как непроницаемые для

лектронов частицы диаметром 55—60 А [33]. Каждая такая «ми-

,елла» образует центральное ядро внутри белковой оболочки. Это

ыло показано методом электронной микроскопии с негативным

онтрастированием препаратов [34] (рис. 8.2), посредством рас-

еяния электронов под малыми углами на молекулах ферритина

растворе [26] и методом дифракции рентгеновских лучей на

ристаллах ферритина и апоферритина [35, 36] и денатурирован-

эго ферритина [37]. Диаметр ядра, определенный рентгенострук-

/рным методом, составляет 73 А [26, 36, 37].

3. УДАЛЕНИЕ ЖЕЛЕЗА ИЗ ФЕРРИТИНА; ПОЛУЧЕНИЕ

U СВОЙСТВА НЕ СОДЕРЖАЩЕГО ЖЕЛЕЗА БЕЛКА — АПОФЕРРИТИНА

Методы, используемые для выделения железосодержащих ядер,

!Зрушают белок. Для получения интактных частиц белка железо

?жно удалять действием восстанавливающих агентов.

304

i лава 2

Апоферритин удобно получать, используя дитионит натрия

в ацетатном буфере при рН 4,6—5,0 [38]. Белок можно отделить

от Fe(II), либо превращая последнее в хелат с а,а'-дипиридилом

[38], либо осаждением белка сульфатом аммония [39], либо гель-

фильтрацией [22]. Восстановление дитионитом проходит медленно

в течение нескольких часов и особенно медленно при рН 7,0.

Подобно ферритину, апоферритин может быть очищен пере-

кристаллизацией из 5%-ного раствора CdSO

. Белок с очень

низким содержанием железа можно отделить от препаратов фср-

ритина центрифугированием с высокой скоростью.

Установлено, что молекулярная масса апоферритина лошади

изменяется от 430 000 до 480 000 [25, 36, 40—42]. Рентгенострук-

турные исследования кристаллов и растворов показали, что моле-

кула апоферритина имеет вид ровной сферической оболочки, сред-

ний внутренний диаметр которой составляет 73 А, а внешний —

122 А ['26, 36, 40]. Внутренний диаметр точно равен диаметр;

ядра.

Из симметрии дифрактограммы рентгеновских лучей [35, 36

получены доказательства существования субъединиц в апоферри

тине. Эти данные были подтверждены разрушением агрегатов д<

приблизительно 2S субъединиц [32, 43]. Молекулярная масс;

субъединиц, определенная рядом методов, равна приблизительш

23 000, что соответствует 20 субъединицам на молекулу [42, 44

45]. Самая последняя оценка молекулярной массы методом миг

рации в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфа

натрия, дала значение только 18 000+1100, что соответствуе

24 субъединицам при молекулярной массе 450 000 [47]. Имеющие

ся химические данные заставляют предположить, что субъединищ

идентичны [2, 48]. Аминокислотный состав апоферритина из се

лезенки лошади был определен в нескольких работах [22, А'

48—50] и приведен в табл. 8.1.

Эта довольно простая картина осложняется неоднородность]

в содержании как белка, так и железа. Содержащиеся в небол!

ших количествах компоненты, обнаруживаемые при ультрацен-

рифугировании [22, 23, 25] и при гель-электрофорезе [51—53

были идентифицированы как мономер, димер, тример и т. д., npi

чем содержание мономера составляло 80—90% от массы Bcei

препарата [22, 23, 41, 49]. Биологическое значение этого полимер

не выяснено. Неоднородность ферритина и апоферритина набл*

дали также посредством изоэлектрического фокусирования [5

55]. По-видимому, она не связана с содержанием железа или п>

лимера, а, возможно, обусловлена изменениями в ацетильно

амидной, ионизированной карбоксильной или других присоедине

ных группах или ионах. Средняя изоэлектрическая точка феррит

на лошади 4,4. Кроме того, недавно было показано, что ферр

тины из различных органов одного и того же животного име?

Ферритин

305

Таблица 8.1

Аминокислотный состав апоферритина из селезенки лошади

Аминокислота

Число остатков в расчете

на молекулярную массу 22 500

Аминокислота

по данным

работы [48]

по данным

работы [49]

Цистеин

2,39

Аспарагиновая кислота

21,05

21,03

Треонин

6,67

6,70

Серии 10,91

11,55

Глутаминовая кислота 29,01

29,19

Пролин

3,43

2,51

Глицин

12,01

11,92

Алании

16,99 17,26

Валин

8,43

8,59

Метионин

3,36

3,59

Изолейцин

4,25

4,56

Лейцин

30,35

30,52

Тирозин

6,07

6,33

Фенилаланин

8,92

8,87

Гистидин

7,03

7,14

Лизин

10,62

10,90

Аргинин

11,49

11,98

Триптофан

1,066

0,98

Не определено.

® Данные работы [45].

Данные работы [44].

различную электрофоретическую подвижность [56—58] и амино-

кислотный состав [59]. Ферритины из канцерогенных и неканцеро-

генных тканей также имеют различные электрофоретические под-

вижности [52, 54].

4. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА АПОФЕРРИТИНА

Структура ферритина формально аналогична структуре неболь-

ших сферических вирусов; молекулы обоих состоят из большого

числа белковых субъединиц, внутри которых содержится непротеи-

20—2451

306

i лава 2

новое «ядро», хотя ферритин гораздо меньше по размеру, чем лю-

бой вирус, и имеет в своем составе меньше белковых субъединиц.

Тем не менее можно ожидать, что его основные структурные свой-

Рис. 8.3. Возможные варианты моделей четвертичной структуры апоферритина,.

а — 20 субъединиц расположены по вершинам пентагонального додекаэдра; 6 — 24 субъеди-

ницы расположены по вершинам искаженного куба. Субъединицы изображены в виде ма-

леньких соприкасающихся сфер. Отметим, что в обеих моделях имеется пространство между

субъединицами, благодаря которому центральное пространство молекулы доступно для ато-

мов железа. Размерь;! этих пространств в центре молекулы будут зависеть от истинной фор-

мы субъединиц, которая вряд ли является точно сферической.

Ферритин лошади был получен в двух основных кристалличе-

ских формах — кубической и орторомбической, а апоферритин -

в кубической и тетрагональной формах [35, 36]. Кубические фор-

мы, имеющие форму октаэдра, изоморфны. Это дает возможность

прямо наблюдать влияние железа на дифрактограмму. Молекулы

плотно упакованы, межмолекулярные расстояния составляют 130 А.

Пространственная группа F432 формально указывает на то, что

каждая молекула содержит 24п идентичных субъединиц, но их

расположение в кристаллах орторомбической структуры свидетель-

ствует о более низкой молекулярной симметрии. Дифрактограммы

как кубических, так и орторомбических кристаллов показывают,

что молекулы могут иметь псевдоикосаэдральную симметрию. Чет-

вертичная структура, предложенная для объяснения этой симмет-

рии и большинства химических данных, состоит из 20 белковых

субъединиц, занимающих 20 граней икосаэдра [36, 60]. Эта струк-

тура изображена на рис. 8,3, а. Если такое расположение коррект-

но, симметрия кубических кристаллов должна статистически воз-

никать из нескольких молекулярных ориентаций. Предложенная

ранее модель [35] с октаэдрической, а не с икосаэдральной сим-

метрией показана на рис. 8.3, б. В этой модели 24 субъединицы

Ферритин 307

расположены по вершинам деформированного куба. Эта модель

объясняет многие особенности дифракционной картины как на

кубических, так и на тетрагональных кристаллах и их векторные

карты Паттерсона. Для точного определения четвертичной структу-

ры белка необходим более детальный анализ кристаллической

•структуры, который в настоящее время пытаются осуществить.

Полное понимание функций белка всецело зависит от знания тон-

ких особенностей его структуры, но даже не зная их, очень многое

можно понять о природе железного ядра, его связи с белком и

•биосинтезе молекулы ферритина. Для последующего обсуждения

необходимо лишь знать, что белковая оболочка представляет собой

правильный ансамбль из субъединиц, охватывающий железосо-

держащее ядро и позволяющий железу входить и выходить из

молекулы по каналу между субъединицами.

5. МОРФОЛОГИЯ И АТОМНАЯ СТРУКТУРА

ФЕРРИТИНОВЫХ ЯДЕР

Приведенные выше данные показывают, что в молекуле апо-

ферритина имеется центральная полость диаметром приблизитель-

но 73 А, в то время как ферритин содержит непостоянное число

атомов железа вплоть до 4500. В молекулах с максимальным со-

держанием железа пространство внутри белковой оболочки долж-

но быть довольно плотно заполнено. В молекулах с низким содер-

жанием железа частицы железа должны быть либо беспорядочно

распределены по всей полости, либо находиться в изолированных

областях, как это показано на рис. 8.4. !Можно думать, что веще-

ства, изображенные на рис. 8.4, а и г, аморфны, а на рис. 8.4, в, д

и е — кристаллические. Если частицы железа распределены бес-

порядочно, ядра могут отличаться по плотности, но при этом они

все равно должны иметь одинаковый внешний вид и одинаковую

форму, независимо от содержания железа. Если же железосодер-

жащая компонента кристаллическая, ядро может дополнительно

делиться, как это изображено на рис. 8.4, е, и иметь множество

форм, как на рис. 8.4, б, в, д и е. Природа вещества, из которого

состоит ядро, была исследована несколькими методами.

5.1. Электронная микроскопия

Первые электронные микрофотографии показали, что железосо-

держащие ядра ферритина разделены на ряд дискретных частей,

«тетрад», которые иногда видны [33]. Было предложено несколько

структур с альтернативным симметричным расположением четы-

рех или шести частиц [61—64]. Хаксли (на которого ссылаются

в работе [2]) и Хэггис [65] нашли, что ядро при рассмотрении

его на очень тонкой поддерживающей пленке имеет внешний вид

20*

308

i лава 2

Рис. 8.4. Схематическое изображение способов, которыми железосодержащая

компонента может распределяться в молекулах с различным содержанием же-

леза.

а — белок изображен как внешняя почти сферическая оболочка; а, б ив — молекулы с низ-

ким содержанием железа: г, д и е — молекулы с довольно высоким содержанием железа.

Если железосодержащая компонента аморфна и беспорядочно распределен по всему про-

странству внутри белковой оболочки, ядра с различным содержанием железа должны

иметь одинаковую форму, но различную плотность, как в а и г. Если железо находится

в локализованных участках, как в б, в, д или е, возможно многообразие форм в зависи-

мости от числа, расположения и формы различных частиц внутри белка (б из содержат

по одной частице, д — одну частицу, но она разделена расщепляющей линией; в случае

е — три отдельные частицы). Электронная спектроскопия и данные рентгеноструктурного

анализа подтверждают такие структуры, как б, в, д и е, и показывают, что заштрихован-

ные области имеют почти кристаллическую структуру.

«классической» субъединицы только при грубой фокусировке.

Хэггис [65] наблюдал ядра различной формы в различных моле-

кулах, иногда они кажутся одинаковыми по плотности, но имею-

щими различную форму многогранниками (треугольники, ромбы,

квадраты, пятиугольники и шестиугольники), иногда они разделе-

ны на две или более плотные области. Случается, что расщепляю-

щая линия проходит через середину, тогда она имеет U-образную

форму. Хэггис пришел к заключению, что «железо находится

в форме небольших кристаллитов», возможно, в составе несколь-

ких молекул одного небольшого кристалла, находящегося внутри

почти сферической оболочки». Это заключение позднее было под-

тверждено изучением фракций ферритина с высоким и низким

содержанием железа [66], как это показано на рис. 8.5, а и б.

Ферритин

309

Видно, что в молекулах с низким содержанием железа ядра ка-

жутся гораздо меньшими, чем ядра «полного» ферритина. Недавно

Хайдон [67, 68] пересмотрел выводы Хэггиса и приписал появле-

ние кристаллитов на последних микрографиях артефактам, обус-

Рис. 8.5. Электронные микрофотографии неокрашенного ферритина.

а — фракция с высокой плотностью (плотность >1,82 г/см

), содержащая приблизительно

4000—4500 атомов железа на молекулу («полный» ферритин). Обратите внимание на много-

образие форм железосодержащих ядер. 6 — фракция с низкой плотностью (плотность

1,3S г/см

), содержащая приблизительно 450 атомов железа на молекулу, смешанная с фрак-

цией с высокой плотностью (а). Можно видеть что малые частицы (показанные стрелками)

разбросаны среди больших частиц. Эти малые частицы представляют железосодержащие

ядра с низкими плотностями. Электронные микрофотографии получены с помощью электрон-

ного микроскопа AEI ЕМ6В с напряжением 60 кВ и любезно предоставлены Хэггисом

(Х500 000).

Рис. 8.5. в — образец неразделенного на фракции <

электронном микроскопе высокого разрешения. Видны

ности железосодержащих ядер. Фотографии опублик!

Д. Уолла (Х480 00

ловленным зернистостью фона. Тот ф

таких изображений, как Хэггис, возмо>

ванием слишком толстой поддерживаю

жения, полученные одним из самых I

сканирующего трансмиссионного элект

кого разрешения [70], так же как пок

димому, подтверждают мнение Хэггиса

блюдается субструктура ядер, особеннс

низким содержанием железа; в других

полиэдров.

308

5.3. Исследова

с бо.

и дифракции эл<

ф,

Диаграммы Дебая

тронов или рентгеновс?

железосодержащие яд]

содержащего кристалл

логичные результаты ;

высушенного на возду

ядер, так и для интакт

ядер, полученных в ре:

ны дополнительные лш

мому, не зависит от пр

при обработке щелочьк

возможно также его у

Дифрактограммы л-

для хорошо известных

(а- или Y-Fe

, а-, {$-

давно выполненные ис

полученного гидролизо

ным, показали, что эт

Шеррера, которая во

[29, 73, 74]. Характе

один из которых полу

к нитрату железа (III)

за (III) до 85

C [29],

ками линий, полученн

дифрактограмм можно

все три вещества во Mi

Формула продукта

приблизительно 0,3 ил

с помощью электронш

добавлением аммиака,

эти частицы содержат

чете на молекулярнук

дукт, полученный н

200 000—250 000 [29].

щееся при добавлении

изучено также Спиро,

лено, что этот полим

и содержит около 120С

на я масса после ульт

метр, измеренный по

авторы отметили сход

Ферритин

311

5.2. Рассеяние рентгеновских лучей

под малыми углами

Дифрактограммы рентгеновских лучей промытого монокристал-

ла неразделенного на фракции ферритина (в котором преоблада-

ли молекулы с высоким содержанием железа) показали, что же-

лезосодержащие ядра ферритина не состоят из правильно располо-

женных четырех, шести или восьми дискретных субъединиц [36].

В среднем ядро, по-видимому, должно быть полиэдром одного типа.

Более детально ферритиновые железосодержащие ядра были

исследованы Фишбахом и Андереггом [26] с использованием рент-

геновских лучей с малыми углами рассеяния. Они исследовали

серии ферритиновых фракций, в каждой из которых содержание

железа изменялось в узком интервале, в 53%-ном растворе саха-

розы. В этих растворах рассеяние на белковой части ферритина

незначительно, так как она имеет такую же электронную плот-

ность, как и среда, в то время как рассеяние на ядрах, обладаю-

щих высокой электронной плотностью, относительно велико.

Наблюдаемое рассеяние сравнивали с кривыми рассеяния, рассчи-

танными для нескольких моделей. Никакое сочетание маленьких,

идентичных, примерно сферических частиц не дало так хорошо

совпадающего с экспериментальными результатами распределения

рассеяния, как рассеяние на единственной частице. «Полный» фер-

ритин (плотность больше 1,80) был представлен в виде сферы

диаметром 73 А с молекулярной массой 418 000. Средние размеры

рассеивающего объекта становятся меньше, по мере того как со-

держание железа уменьшается. Модели, которые обладают наи-

лучшим соответствием, — это одиночные параллелепипеды или

цилиндры, размер которых такой, что они всегда закрывают дырку

в апоферритине. Фракция с наиболее низкой молекулярной массой

из всех изученных, которая содержала приблизительно 800 атомов

железа, была аппроксимирована параллелепипедом с размерами

17X34X68 А. Теоретическая кривая была получена для единст-

венного объекта, и она не представляла возможности варьировать

форму и размер частиц, из которых состояло ядро, в молекулах

с одинаковой плотностью. Тем не менее эти модели, возможно,

представляют какую-то усредненную частицу ядра. Во фракции,

примерно содержащей 450 атомов железа на молекулу, электрон-

ная микрофотография которой показана на рис. 8.5, б, многие

ядра кажутся примерно одинаковыми по размеру, хотя некоторые

из них вытянуты. Это может быть отражением действительных

отличий в форме или результатом рассмотрения одной и той же

формы с разных точек зрения. Большая асимметрия частиц, о ко-

торой заключили на основании результатов рассеяния рентгенов-

ских лучей под малыми углами, возможно, обусловлена большим

числом атомов железа, имеющихся в данной фракции.

312

i лава 2

5.3. Исследование дифракции рентгеновских лучей

с большими углами рассеяния

и дифракции электронов на железосодержащих ядрах

ферритина и их аналогах

Диаграммы Дебая — Шеррера, полученные с помощью элек-

тронов или рентгеновских лучей, ясно показали, что ферритпновые

железосодержащие ядра состоят из кристаллического материала,

содержащего кристаллиты небольшого размера [29, 65, 71]. Ана-

логичные результаты дает рентгеноструктурный анализ сырого и

высушенного на воздухе вещества [71] как для изолированных

ядер, так и для интактных молекул [71, 72] (хотя для непромытых

ядер, полученных в результате обработки щелочью, были сообще-

ны дополнительные линии [72]). Атомная структура ядер, по-види-

мому, не зависит от присутствия фосфата [71]. Фосфат отделяется

при обработке щелочью [28]. Он может быть связан поверхностью,

возможно также его участие в связывании ядра с белком.

Дифрактограммы железосодержащих ядер отличны от таковых

для хорошо известных оксидов или оксигидроксидов железа(III)

(а- или Y-Fe

, а-, р-, у- или 6-FeOOH) [29, 65, 71]. Однако не-

давно выполненные исследования «гидрата оксида железа(III)»,

полученного гидролизом соли Fe(III) и ранее считавшегося аморф-

ным, показали, что этот продукт дает дифрактограмму Дебая —

Шеррера, которая во многом похожа на таковую для ферритина

[29, 73, 74]. Характеристики интенсивных линий от продуктов,

один из которых получен гидролизом или добавлением аммиака

к нитрату железа (III) [73], а другой нагреванием нитрата желе-

за (III) до 85

C [29], показаны в табл. 8.2 вместе с характеристи-

ками линий, полученных от ферритина [71]. На основании этих

дифрактограмм можно заключить, что по своей атомной структуре

все три вещества во многом сходны.

Формула продукта гидролиза — FeOOH-^H

O, где п равно

приблизительно 0,3 или 0,4 {29, 74]. Диаметр частиц, измеренный

с помощью электронного микроскопа, для продукта, полученного

добавлением аммиака, составляет 20—30 А; было рассчитано, что

эти частицы содержат приблизительно 1000 атомов железа ( в рас-

чете на молекулярную массу 100 000) [74], в то время как про-

дукт, полученный нагреванием, имеет молекулярную массу

200 000—250 000 [29]. Полимерное соединение железа, образую-

щееся при добавлении KHCO

к водному раствору Fe(NO

)

, было

изучено также Спиро, Залтманом и сотр. [75—78]. Было установ-

лено, что этот полимер имеет состав FeOojsOH (NO

)

S(H

и содержит около 1200 атомов железа в молекуле. Его молекуляр-

ная масса после ультрацентрифугирования была 150 000, а диа-

метр, измеренный по электронной микрофотографии, 70 А. Эти

авторы отметили сходство в диаметрах между этим соединением