Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Ферритин

313

Таблица 8.2

Дифракционные данные для ферритиновых железосодержащих ядер

и их аналогов

Параметры

наблюдаемых

О О

линий'

, А

Ферритин

(дифракция

электронов) [65]

Ферритин

(дифракция

рентгеновских

лучей) [71]

Гидрат оксида

железа(Ш);

(рентгенострук-

турные данные)

[73.1

Гидролизат

нитрата железа)III)

(рентгеноструктурные

данные) [29]

4,70

Неопределенная (U)

4,20 U (широкая)

3,30 То же

2,55 I

2,47 I

41 J

73 J

100

S ) неразрешен-

M J

ная

2,35 U

2,24 S

M-S

1,98 M 18 10

M (широкая),

1,73

27 15

1,50

1,47

100

60 S

1,40 U

1,34

VW VW

1,25 1

1,23 J

1,18

широкая

средняя

1,12

1,06 M

широкая

слабая

10 U

0,96 2

0,92

0,88

0,85 M

Средние значения.

и ферритиновым железосодержащим ядром. Однако число атомов

железа, содержащихся в этом полимере, гораздо меньше, чем

в плотно заполненных молекулах ферритина.

5.4. Магнитная восприимчивость и спектры Мессбауэра

ферритина и гидролизатов Fe (III)

Высокоспиновый ион Fe(III) с пятью неспаренными электрона-

ми характеризуется магнитным моментом 5,9 магнетона Бора.

Свободный ион Fe

+ в сильнокислом растворе имеет момент

314

i лава 2

5,8 магнетона Бора [79]. Измерения магнитной восприимчивости

ферритина дали значение 3,8 магнетона Бора для магнитного мо-

мента [27, 28, 80]. Подобные значения были получены также для

растворов полимерного гидролизата железа(III) [77] и мостико-

вого гидрокси-димера [81] [Fe

(OH)

]

(который может быть и

полимером) [78]. Для объяснения низкого магнитного момента

ферритина Михаэлис, Кориэлл и Граник [27] предположили, что

атомы железа могут находиться в довольно необычном состоянии,

имея только три неспаренных электрона и кислород в качестве

лиганда в квадратно-плоскостной конфигурации. Альтернативно

ферритин может содержать смесь ионов Fe

+ с пятью и одним не-

спаренным электроном. Недавно Блайз и сотр. [82, 83] обнаружи-

ли заметную зависимость магнитной восприимчивости ферритина

от силы поля и получили магнитный момент 5,08 магнетона Бора

при высокой силе поля. Они также показали, что тонкие зернистые

частицы ядер ферритина проявляют суперпарамагнетизм. Получе-

ны также доказательства суперпарамагнетизма гидроксида желе-

за (III) [74, 77].

Исследование спектров Мессбауэра ферритина было выполнено

при нескольких температурах [77, 82, 84, 85]. При 77 К или выше

в спектре наблюдаются две линии, а при 4 К — шесть линий.

Между 20 и 45 К по мере повышения температуры наблюдался

постепенный переход от спектра из шести линий к спектру из двух

линий. Такое поведение свидетельствует о суперпарамагнетизме

частиц, размеры которых отличаются не больше чем на 100 А.

Шесть линий в спектре обусловлены расщеплением энергетических

уровней под действием магнитного поля на ядрах железа. Сверх-

тонкая структура спектра и магнитные измерения показали, что

железосодержащие ядра ферритина антиферромагнитны [82, 84].

Наблюдаемый магнитный момент, возможно, обусловлен неком-

пенсированным спином, возникающим из-за статистического раз-

броса в числе занятых мест за счет двух магнитных подрешеток

в очень маленьких частицах [86]. Квадрупольное расщепление,

приводящее к спектру из двух линий, свидетельствует о градиенте

электрического поля, вызванном несимметричным распределением

атомов кислорода вокруг ядра железа.

Если ядра железа находятся в двух значительно отличающихся

состояниях, их спектры Мессбауэра могут быть уширены, несим-

метричны, а иногда разрешены в виде двух групп линий, как этс

видно в спектрах y-Fe

[87] и 6-FeOOH [88], которые содержат

как октаэдрически, так и тетраэдрически координированные ато

мы железа. Спектры железосодержащих ядер ферритина довольнс

симметричны, поэтому нет оснований предполагать присутствш

более чем одного центра, разве только что их поля и изомерньп

сдвиги очень похожи. Величины [82, 84] квадрупольного расщеп

ления изменяются от 0,60+0,10 до 0,74±0,04 мм/с, изомерны'

MNlIС

Рис. 8.6. Спектры поглощения Мессбауэра железосодержащих ядер ферритина

при различных температурах. Показано соответствие со спектрами, рассчитан-

ными на ЭВМ (Д. М. Вильяме и Т. Н. Харрисон, в печати).

Железосодержащие ядра выделены посредством дезагрегации в 67%-ной уксусной кислоте

с последующей обработкой белковых субъединиц пепсином в Г M уксусной кислоте при

рН 2,4. а — температура 10 К; изомерный сдвиг (относительно Fe в Pd) равен 0,30±0,04 мм/с;

напряженность внутреннего магнитного поля составляет 473±10 кЭ. б — температура 77 К, изо-

мерный сдвиг равен 0,29±0,04 мм/с; квадрупольное расщепление (2е) 0,79±0,04 мм/с. в — темпе-

ратура 295 К; изомерный сдвиг равен 0,18+0,03 мм/с; квадрупольное расщепление 0,7±0,04 мм/с..

316

i лава 2

сдвиги относительно нержавеющей стали от 0,47+0,05 до 0,50±

±0,05 мм/с, а внутреннее магнитное поле 493±10 кЭ аналогично

полю, наблюдаемому для продукта гидролиза железа (III) [74, 77]

и для оксида и гидроксида железа(III) [89, 90]. Значения изомер-

ных сдвигов довольно близки к таковым для железа в октаэдриче-

ском окружении, в то время как внутреннее магнитное поле до-

вольно близко к значению, найденному для железа в тетраэдри-

ческом окружении.

Спектр Мессбауэра железосодержащего ядра ферритина, кото-

рый почти не содержал белка, показан на рис. 8.6.

6. АТОМНАЯ СТРУКТУРА ЯДЕР ФЕРРИТИНА

Атомные структуры минеральной части ферритина и продуктов

гидролиза железа (III), по-видимому, одинаковы или очень сходны.

Гидратированный оксид железа(IH) имеет в ИК-спектре полосу

поглощения при 1620—1630 см

-1

, приписываемую воде, которая

почти полностью исчезает при высушивании [74]. Не исчезает

сильная полоса при 3400 см

-1

, возможно, она обусловлена

ОН-группами, находящимися внутри решетки. Такое отнесение

подтверждается также спектрами ядерного магнитного резонанса

[74].

Для объяснения наблюдаемой дифрактограммы был предложен

ряд различных элементарных ячеек и атомных расположений

[29, 71—73]. Наличие сильных полос в области 2,54 и 1,47 А, таких

же, как от образцов б-FeOOH, позволяет предположить структуру,

образованную системой близко расположенных атомов кислорода,

отстоящих друг от друга на 2,94 А. Действительная форма элемен-

тарной ячейки зависит как от способа укладки последующих слоев

из атомов кислорода, так и от положения иона металла в проме-

жутках между ними. Как показано на рис. 8.7, атомы кислорода

могут занимать положения А, В или С. При расположении типа

АВАВ... образуется гексагональная плотная упаковка, а

ABCABC... — кубическая решетка. Возможно и более сложное

расположение, например АВАСАВАС..., как в TiO

[91]. Для фер-

ритина Харрисон и др. [71] предложили простую гексагональную

элементарную ячейку с а = 2,94 А и

= 9,40 А, в то время как Жи-

рарде и Лоренс [72] считали, что это ячейка большего размера

с а = 11,79 А и с = 9,90 А. Похожую ячейку Toy и Брэдли [29]

предложили для продукта гидролиза нитрата железа (III) с а=

= 5,08 А и с=9,40 А, в то же время Гиссен [73] считает, что гид-

рат оксида железа имеет кубическую решетку с а=8,37 А. В рас-

положении атомов, предложенном Харрисом с сотр. [71], атомы

кислорода в слоях имеют последовательность АВАСАВАС..., а ато-

мы железа беспорядочно распределены по всем имеющимся окта-

Ферритин

317

эдрическим и тетраэдрическим положениям. В структуре Toy и

Брэдли [29] последовательность кислородных атомов ABAB.., при

этом все атомы железа находятся в октаэдрических положениях,

Рис. 8.7. Изображение одного слоя тесно упакованных атомов кислорода и очер-

тания двух возможных элементарных ячеек (а), предложенных для железосодер-

жащих ядер ферритина.

B маленькой элементарной ячейке [71] длина стороны (расстояние между атомами кисло-

° ° l/al-

рода) равна а=2,94 А, в то время как в ячейке большего размера [29] а=5,08 A [2,94-(3)

B третьей предложенной элементарной ячейке [72] а=11,79 А (2,94-4). Для того, чтобы

плотная упаковка сохранялась во всех трех направлениях, последующие слои атомов кис-

лорода должны располагаться выше или ниже пространства между кислородными атомами

слоя. Имеются три возможных положения кислородных слоев — А, В и С, но при этом

последовательности слоев могут несколько различаться. Две из таких последовательностей,

предложенные как альтернативные расположения ядер ферритина, показаны на схемах б

и а. На схеме в показана элементарная ячейка, предложенная Toy и Брэдли [29]; в этой

ячейке упаковка — гексагональная типа ABAB. . . с с—9,40 А, что соответствует четырем

кислородным слоям. Большая элементарная ячейка возникает при вхождении атомов железа.

4а схеме б показано расположение, предложенное Харрисоном с сотр. [71]; кислородные

:лои располагаются в последовательности ABAC. .., образуя четырехслойную последова-

ельность с с=9,40 А. Атомы железа могут размещаться в пространстве между кислород-

[ыми слоями, при этом они либо октаэдрически, либо тетраэдрически координированы ато-

1ами кислорода. Два таких положения в кристаллической решетке показаны справа на

хеме в, атомы железа находятся в центрах изображенных октаэдров. В расположениях,

редложеннык Toy и Брэдли, все атомы железа находятся в октаэдрических положениях,

то время как в структуре, предложенной Харрисоном и сотрудниками, могут быть беспо-

рядочно заняты и октаэдрические и тетраэдрические положения.

риводящим к образованию четырехслойной ячейки. В случае ку-

ической решетки никаким расположением атомов железа нельзя

бъяснить наблюдаемые интенсивности [74]. Не была предложена

акже структура для очень большой гексагональной ячейки, хотя

было сделано заключение, что атомы железа должны находиться

в октаэдрических, и в тетраэдрических положениях [85].

Брэди с сотр. [77], исходя из функции радиального распреде-

зния в полимерном соединении железа, полученном добавлением

318

i лава 2

KHCO

к водному раствору Fe(NO

)

, предложили совсем другой

тип атомной структуры. Атомы железа тетраэдрически координи-

рованы к ионам О

или OH

и связаны ими в плоскую ленту. Эта

лента может быть свернута в сферическую частицу.

Исследование различных расположений железа и кислорода

было выполнено Хойем с помощью ЭВМ.

7. СВЯЗЬ БЕЛКОВОЙ ОБОЛОЧКИ С ЯДРОМ,

СОСТОЯЩИМ ИЗ ГИДРАТА ОКСИДА ЖЕЛЕЗА

Внешняя геометрическая форма макроскопического кристалла

зависит от его атомной структуры. Хорошо развитые грани обычно

характеризуются высокой атомной плотностью заселения, хотя

кристаллы, росшие в условиях каких-либо ограничений, по разви-

тию граней могут отличаться от тех, которые росли свободно.

Обычно макроскопические кристаллы представляют собой мозаику

из кристаллитов гораздо меньшего размера, расположенных почти

параллельно. Условия кристаллизации могут влиять на размер

и форму как макроскопических кристаллов, так и микроскопиче-

ских кристаллитов и на порядок их расположения в мозаике.

Если ферритиновые ядра кристаллические, их внешний вид

должен быть близок геометрически их атомной структуре. Если

кристаллиты ядра растут в виде правильного полиэдра, точно со-

ответствующего пространству внутри белка, атомная структура

ядра будет всегда специфически ориентирована относительно бел-

ка. Такое положение можно было бы ожидать, если бы ядра об-

разовывались независимо от белка и действовали как матрицы дл$

связывания субъединиц. Если же гидрат оксида железа расте

в специфическом месте внутри возникшей ранее белковой оболоч

ки, направление роста кристалла может определяться белком

Альтернативный путь — кристаллизация внутри белка — осущест

вляется беспорядочно в разных направлениях.

Электронно-микроскопические исследования привели к заклк

чению, что морфология ядра неодинакова, различные молекул)

имеют разное число и расположение кристаллитов. В частичн

заполненных молекулах иногда обнаруживают пустоту в центр!

при этом предполагается, что кристаллиты прикреплены к белю

плотно заполненные молекулы чаще имеют более единообразны

внешний вид [65, 66]. Методом дифракции рентгеновских луче

с малыми углами рассеяния на кристаллах ферритина также бы;

показано, что ядра не одинаковы [92]. Дифрактограммы фракщ

с низкой плотностью подтверждают различие в форме, положен!

и ориентации кристаллитов, образующих ядра. Фракции с высок<

плотностью имеют более правильную форму. Возможно, в эт

фракциях полость внутри белка в значительной мере или поли

Ферритин

319

стью заполнена гидратом оксида железа. Дифракция рентгенов-

ских лучей с большими углами рассеяния дает как отпечатки

•одиночных кристаллов, благодаря наличию правильной решетки

у молекул белка, так и дифрактограммы Дебая—Шеррера от ядер.

Это означает, что кристаллическая структура вещества, из кото-

рого построены ядра, не имеет правильного расположения отно-

сительно кристаллической структуры белка [92].

Размер кристаллитов ферритиновых ядер, оцененный по шири-

нам линий Дебая — Шеррера, равен 75+30 А [71] или 68 А [85].

Рис. 8.8. Схематическое изображение молекул ферритина, содержащего почти

полный комплект железа, на основании результатов электронной микроскопии и

дифракции рентгеновских лучей.

Ядра построены из кристаллического материала. Некоторые молекулы могут содержать

один кристаллит, как в а и б, а другие — несколько кристаллитов, как в в. Ядерные кри-

сталлиты растут в различных направлениях по отношению к белку в разных молекулах

(а и б) или внутри одной и той же молекулы (в). В ферритине с высоким содержанием же-

леза имеются все типы частиц (а, б и в), но преобладающими могут быть и и б.

Так как размер отверстия в белковой оболочке составляет 73 А,

вещество ядра должно представлять собой либо один кристаллит,

либо небольшое число кристаллитов в нескольких молекулах [93].

Таким образом, полный ферритин, по-видимому, должен быть

смесью молекул, ядра которых для заполнения полости начинают

расти из различных центров и поэтому в различных молекулах

получаются неодинаково ориентированными относительно белка,

как это показано на рис. 8.8.

8. ВЛИЯНИЕ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩЕЙ КОМПОНЕНТЫ

НА СВОЙСТВА И СТРУКТУРУ БЕЛКА

Ферритин более устойчив к атаке некоторыми протеолитически-

ми ферментами, чем апоферритин [24, 48]. При рН 8,5 апоферри-

тин скорее и в большей степени расщепляется трипсином, химо-

трипсином и субтилизином, а при рН 7,0 и 5,0 — папаином [94].

Пепсин при рН 3,0 гидролизует апоферритин и ферритин с одина-

ковой скоростью, но при рН 2,5 он расщепляет апоферритин в 2—

3 раза быстрее, чем ферритин [94]. Влияние катепсина D на фер-

320

i лава 2

ритин одинаково при этих двух значениях рН [94]. Крихтон [48]

объяснил различия в расщеплении трипсином ферритина и апофер-

ритина конформационными различиями в белке. Возможно также,

что железо ингибирует протеолиз, препятствуя развертыванию

белка.

Исследование дисперсии оптического вращения ферритина и

апоферритина в водных растворах показало сравнительно высокое

содержание спиралей: 40—50% в ферритине и 50—60% в апофер-

ритине [95]. Среднее остаточное вращение при 233 нм для ферри-

тинов, содержащих от 100 до 4000 атомов железа и отделенных от

нативного ферритина центрифугированием в градиенте плотности,

было для всех одинаковым, но при этом более низким, чем для

апоферритина, полученного из ферритина восстановлением дитио-

нитом [95]. По-видимому, удаление атомов железа вызывает кон-

фигурационные изменения в молекулах, если только дитионит не

оказывает какого-либо другого влияния. Возможно, покажется

довольно странным, что повышенное содержание спиралей нужно

связывать с большей легкостью атаки протеолитическими фермен-

тами. Доказательства того, что различия между ферритином и

апоферритином обусловлены либо изменением конформации по-

верхности, либо связыванием иона, были получены при помощи

хроматографии на DEAE-целлюлозе (диэтиламиноэтилцеллюлозе).

С помощью этого метода было обнаружено, что ферритин гетеро-

генен, в то время как апоферритин дает одиночный пик [22]. Об-

работка дитионитом также может вызвать полимеризацию моно-

мерных молекул ферритина [22, 49]. С другой стороны, ферритин

и апоферритин обладают одинаковой электрофоретической по-

движностью и одинаковыми серологическими реакциями [96].

Данные рентгеноструктурного анализа показывают, что кон-

формация белка в ферритинах с различным содержанием железа

и в апоферритине, полученном восстановлением с дитионитом,

в кристаллическом состоянии по существу одна и та же [92]. Ди-

фрактограммы, снятые с разрешением от 2,5 до 10 А, очень мало

зависят от присутствия железа. По-видимому, очень маловероятно,

по крайней мере для кристаллических белков, чтобы содержание

спиралей в ферритине и апоферритине отличалось более чем на

10%. Относительно небольшие отличия в структуре поверхностей,

такие, как расположение или химическая модификация некоторых

боковых цепей, могут остаться незамеченными.

9. БИОСИНТЕЗ ФЕРРИТИНА

И ЕГО СИНТЕЗ IN VITRO

Уже давно было показано, что ферритин появляется в клетка:

слизистых оболочек при наличии железа в пище и что этот процеа

сопровождается de novo синтезом ферритинового белка [19]. Таки-

Ферритин

321

же данные получены и для других тканей; при этом с помощью

меченых атомов было показано, что первые образующиеся моле-

кулы либо вовсе не содержат железа, либо содержат его очень

мало [31, 97—106]. Они постепенно за период свыше 72 ч накап-

ливают железо, как это показано на рис. 8.9.

Рис. 8.9. Распределение радиоактивного ферритина, выделенного из печена крыс,

по градиенту плотности сахарозы, через различные промежутки времени после

инъекции 5 мкК лейцина-

С на 100 г веса тела.

В опытах на схеме А каждой крысе вводили 400 мкг железа на 100 г веса тела за 2 ч до

введения меченой аминокислоты. В контрольном опыте (Б) каждая крыса получала инъек-

цию 0,9% NaCl вместо железа. Заметьте, что вначале в обеих группах максимальное коли-

чество метки перешло во фракции с наименьшим содержанием железа (наименьшей плот-

ностью), а в последующие промежутки времени наибольшее количество метки было найдено

в ферритинах с повышенным содержанием железа. Сравнение этих двух групп ясно пока-

зывает индуктивное влияние железа на синтез ферритового белка [воспроизводится с раз-

решения Дж. Дрисдейл и X. Н. Мунро [103] из J. Biol. Chem., 241, 3630 (1976)].

tBepx

I трубки

Ho/wep фракции

123456789 10

Верх Homep фракции

I трубки

Механизм стимуляции железом синтеза ферритинового белка

не был понятен. Обнаруженная в большинстве экспериментов не-

способность актиномицина D ингибировать синтезы послужила

указанием на пост-транскрипционный эффект [103, 105, 107]. Же-

лезо может подавлять трансляционный ингибитор [107], может

промотировать образование белковых субъединиц ,[103] или дей-

ствовать каким-либо другим путем. Было выдвинуто предположе-

ние, что общее повышение выходов при биосинтезе происходит от

стабилизации обогащенных железом молекул до их разрушения

внутриклеточными ферментами [103], но этот оборот совершается

слишком медленно, чтобы его можно было считать единственной

причиной, в то время как in vitro катепсин D атакует ферритин и

апоферритин с одинаковой скоростью [94].

21—2451

322

i лава 2

Предположение о том, что железо в виде внутриклеточного гид-

ратированного полимера оксида железа (III) диаметром 70 А про-

мотирует образование свободных субъединиц было выдвинуто

Залтманом с сотр. [108]. Такой механизм только в том случае

согласуется с образованием in vivo апоферритина, если последний

распадается, а затем вновь образуется вокруг ядра [109]. Измен-

чивость размера и формы железосодержащих ядер ферритина за-

ставляет усомниться в том, чтобы такие неправильные объекты

контролировали сборку белковой оболочки [109]. Кроме того, если

это единственный механизм, которым стимулируются биосинтезы,

он должен требовать значительного предварительного накопления

железа в клетке.

Эксперименты по синтезу in vitro апоферритиновых субъединиц

показали, что присутствие железа (полиядерного или моноядерпо-

го) не обязательно для образования полных оболочек [32]. Моле-

кулы распадаются в 67%-ной уксусной кислоте и вновь образуют-

ся при постепенном повышении рН в присутствии тиолов, образуя

частицы, напоминающие нативный апоферритин [32] по виду под

электронным микроскопом, по коэффициенту седиментации, элек-

трофоретической подвижности и иммунологическим реакциям; они

дают такие же, как апоферритин, кристаллы с растворами CdSO

Молекулы ферритина распадаются под действием уксусной кисло-

ты или додецилсульфата натрия и вновь образуют агрегаты, давая

апоферритин, но не ферритин, тогда как ядра образуют агрегаты

и с уксусной кислотой, и с додецилсульфатом натрия [32, 110].

Полные оболочки апоферритина могут накапливать железо

in vitro, образуя продукт, напоминающий ферритин. Воссоздание

ферритина из железоаммиачных квасцов и апоферритина в бикар-

бонатном буфере при рН 7,6 в присутствии атмосферного кислоро-

да впервые осуществили Билих и Байер [111]. Лоэвус и Файнберг

[112] подтвердили этот результат и показали, что захват соли

железа(Ш) апоферритином может регулироваться кипящим экст-

рактом печени.

«Ферритин», собранный по методу Билиха и Байера, по-види-

мому, не может накапливать свой полный набор железа [71, 108,

111]. Коэффициент седиментации этого продукта в среднем со-

ставляет примерно 45S (рис. 8.10, а), а его дифрактограмма и раз-

мер кристаллитов почти такие же, как у ферритина с низким со-

держанием железа. С имидазолом или трис-буфером с рН 6,7—

7,3 вместо бикарбонатного буфера получается широкий интервал

содержания железа и некоторое количество почти полных молекул

(рис. 8.10, б). Третий способ воссоздания ферритина из апоферри-

тина и железоаммиачных квасцов в незабуференном растворе при

рН 5,8—7,4 с использованием в качестве окислителя KIO

в при-

сутствии Na

впервые применили Орме-Джонсон, Джилхрист

и Коллинс [71]. В этом случае процесс воссоздания, по-видимому,