Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

523

объемистыми о-аминокислотами, тоже не могут образовать все те

три типа связей, которые наблюдаются в фермент-субстратном

комплексе.

Рис. 15.9. Диаграмма предпо-

лагаемых фермент-субстрат-

иых взаимодействий для пен-

тапептидного субстрата.

Отщепляемый остаток Si ориенти-

рован так же, как в случае глицил-

тирозина (рис. 15.6 и 15.8), но в

образовании связи с остатком

Туг-248 участвует группа NH пеп-

тидной связи, соединяющей Si и S2.

2.4.2. Комплексы с ингибиторами

Рентгеноструктурному анализу при разрешении 6 А были под-

вергнуты комплексы фермента с несколькими ингибиторами [70].

В результате не было получено детального описания взаимодейст-

вий, возникающих при связывании. Тем не менее совмещение раз-

ностных карт с картами белка, построенными при высоком разре-

шении, дало некоторую положительную информацию. Три

ингибитора — n-иод-р-фенилпропионат, L-фенилаланин и L-ЛИЗИЛ-

ь-тирозинамид — при рН 7,5 связываются вблизи атома цинка,

причем в их поведении существуют интересные различия. Проще

всего обстоит дело с ь-фенилаланином. Положительная плотность

обнаруживается на разностных картах в том месте полости, кото-

рое на разностных картах с низким разрешением соответствует

молекуле глицилтирозина. Эта плотность происходит от молекулы

ь-фенилаланина, причем свободная группа COO

остатка взаимо-

действует с остатком Arg-145. Кроме того, обнаруживаются участ-

ки с положительной и отрицательной плотностью, возникающие

524

Г лава

при перемещении Туг-248. Лизилтирозинамид, напротив, располага-

ется иначе, чем глидилтирозин, и на картах нет признаков конфор-

мационного изменения, затрагивающего остаток Туг-248. Иодфе-

нилпропионат связывается кристаллической КПА на четырех цент-

рах. Если предположить, что центр пиков электронной плотности

при низком разрешении совпадает с положением атомов иода, то

два из них оказываются в районе активного центра (рис. 15.10).

Рис. 15.10. Стереоизображение активного центра, показывающее расположение

атомов иода иодфенилпропионата. В отличие от других рисунков здесь представ-

лен вид вдоль кристаллографической оси а (на рис. 15.8. справа вдоль плоско-

сти листа). Атом иода Ji находится в субстратсвязывающей полости.

Атомы иода Ij и I

находятся в положениях, при которых возмож-

но взаимодействие между группой COO

ингибитора и атомом

цинка. Ряд других данных подтверждает предположение о том, что

фенилпропионат присоединен к иону металла [71, 72]. Таким об-

разом, иодфенилпропионат не может служить хорошим аналогом

субстрата, глицилтирозина. Несмотря на это, его присоединение,

по-видимому, также вызывает изменение конформации в районе

остатка Туг-248. Множественность центров связывания фенилпро-

пионата не является неожиданной, так как кинетика ингибирова-

ния им довольно сложна (разд. 3.2.1).

2.4.3. Апофермент и металлы, отличные от цинка

Для удаления и замещения цинка в КПА, находящейся в крис-

таллическом состоянии, можно использовать ту же методику, что

и для КПА в растворе, несколько изменив условия [73]. Кристал-

лическая Hg-КПА была получена двумя способами: кристаллиза-

цией после замены Zn на Hg и диализом кристаллов против рас-

твора, содержащего ионы Hg

+ [46]. В последнем случае ртуть не

только замещала цинк, но и присоединялась к другим участкам

молекулы (табл. 15.1). Кристаллическая апо-КПА может быть по-

лучена обработкой кристаллов Zn-фермента оксихинолинсульфона-

том. Cd- и Cu-ферменты были приготовлены из кристаллов апо-

КПА [70].

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

525

Карты электронной плотности для нативной КПА и апофермен-

та при разрешении 6 А практически совпадают, за исключением

большого отрицательного пика в положении атома цинка [46]. На

первый взгляд можно было предположить, что в апо-КПА остаток

His-196, несмотря на жесткость p-структуры, изменит свое поло-

жение таким образом, что между ним и остатками Asn-144 и

Gly-270 образуются водородные связи. Однако на разностных'

картах при низком разрешении отсутствуют участки с положитель-

ной и отрицательной плотностью, которые согласовались бы с этим

предположением. Если допустить, что в кристалле, так же как в

растворе, потеря активности коррелирует с удалением цинка, то из

анализа карт апо-КПА можно заключить, что металл участвует

непосредственно в катализе, а не в возможной структурной пере-

стройке апофермента. Этот вывод строго подтверждается взаим-

ным расположением субстрата и металла в кристаллических фер-

мент-субстратных комплексах. Можно отметить, что результаты

химических исследований в растворе не позволили выяснить роль

цинка.

Карты электронной плотности активного центра Hg-КПА были

рассчитаны с высоким разрешением. Центр иона металла смещен

на 1,0 А главным образом вдоль осей х и у по сравнению с поло-

жением иона цинка. На рис. 15.7 атом ртути был бы выше и бли-

же к остатку His-69. Связь этого металла с белком тоже осущест-

вляется через атомы Ni двух остатков гистидина, 69 и 196, кото-

рые расположены так же, как в комплексе с Zn. Возможность

поворота имидазольного кольца в His-196, в результате чего в свя-

зи с металлом мог бы вместо атома Ni участвовать атом N

, сле-

дует исключить. Причиной этого является обнаружение на картах

молекулы воды, которая, как и в случае цинка, соединена с ато-

мом N

этой аминокислоты водородной связью. Электронная плот-

ность, соответствующая карбоксильной группе остатка Glu-72, не-

сколько понижена. Тем не менее и эта группа, по-видимому, взаи-

модействует с атомом ртути. В остальном карты электронной плот-

ности для комплексов белка с Zn и Hg совпадают. Возможность

использовать Hg-КПА при расчете фаз подтверждает изоморфизм

двух структур. В растворе ртутное производное карбоксипептидазы

проявляет высокую эстеразную активность, но не катализирует

гидролиз пептидов [41]. Однако в кристаллическом виде Hg-КПА

в отличие от Zn-КПА обладает и высокой пептидазной активно-

стью, которая составляет примерно 1/1000 активности Zn-фермента

в растворе [73].

Для изучения структур Mn-КПА и Cu-КПА использовали ме-

тоды магнитного резонанса. Геометрия лигандного окружения этих

ионов в комплексе с белком отличается от существующей в

Zn-КПА. Анализ резонанса иона F

и протонов воды в присутствии

Mn-КПА дает основания предположить, что в растворах, содержа-

526

Г лава

щи.х F

, во внутренней координационной сфере иона металла при-

сутствуют по меньшей мере два небелковых лиганда: один ион

галогена и не менее одной молекулы воды. Если, кроме того, ион

металла связан с тремя белковыми лигандами, то его координаци-

онное число должно быть не менее пяти [6, 72]. Спектры электрон-

ного парамагнитного резонанса кристаллов Cu-КПА согласуются

с плоской геометрией лигандов, а не с искаженной тетраэдриче-

ской. Анализ сверхтонкой составляющей спектра указывает на то,

что среди лигандов есть два атома азота. Кристаллы КПА-у, ис-

пользованные в измерениях электронного парамагнитного резонан-

са, изоморфны соответствующим кристаллам Zn-КПА [74]. Уча-

стие остатков His-196 и His-69 в связывании атома меди не вызыва-

ет сомнения, в то время как природа остальных лигандов и

расположение плоскости, в которой находятся лиганды, по отноше-

нию к молекуле КПА точно не установлены.

3. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ

КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А

3.1. Кинетика (обзор)

Для описания кинетики реакций, катализируемых КПА, в со-

ответствии с современным уровнем знаний требуется использовать

сложную схему, показанную на рис. 15.11. Она суммирует различ-

ные кинетические явления, которые в какой-то степени подтверж-

дены экспериментально: непродуктивное связывание (путь 2);

конкурентное ингибирование продуктами или аналогами субстра-

тов (путь 3); взаимодействие с модификаторами M (которые мо-

гут включать как продукты, так и субстраты), ведущее к смешан-

ному и неконкурентному ингибированию или активации (путь 4).

Ингибирование избытком субстрата можно считать вариантом пу-

ти 4. Существование тех или иных путей зависит от природы суб-

страта. Например, при гидролизе ГФЛ* ингибирование субстратом

проявляется даже при его концентрации 2-Ю

-4

M [28, 75], в то

время как при использовании похожего пептидного субстрата, гип-

пурилфенилаланина, вместо ингибирования наблюдается актива-

ция [76] (см. также [78]). Активация субстратами обнаружена

также при гидролизе эфира — гиппурилгликолата [77] и пептида—

КБЗ-Gly-Phe [78]. Продукт расщепления последнего субстрата,

КБЗ-Gly, активирует гидролиз некоторых пептидов и в то же вре-

мя конкурентно ингибирует гидролиз циннамоилфениллактата [79]

и ацилтрипептидов [76]. К модификаторам относятся также бенз-

амид, циклогексанон и ряд замещенных спиртов [80].

* Формулы субстратов приведены в табл. 15.4.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

527

1 •

Основная реакция (ковалентные промежуточные соединения опущены)

/ *1 /

*2 /

+ s

+Ha0

+Рг 5

E + Pl

2. Образование непродуктивного комплекса

—\

3. Конкурентное ингибирование

/ Ki

+ I E

4. Реакция с модификаторами

/ V / /

*2М. „

+M ч=* E

+S=P=^E

+ H

O^==* E

\ \М *-im \М —2М

+Pi

Рис. 15.11. Кинетическая схема реакций, катализируемых КПА. Приведенные ме-

ханизмы являются упрощенными и включают только нековалентные промежу-

точные соединения. Для объяснения ингибирования продуктом реакции показана

стадия его диосоциации.

Непродуктивное связывание, проявляющееся в конкурентном

ингибировании субстратом, довольно трудно обнаружить с по-

мощью кинетических измерений [81]. Однако сравнение величин

Км и Ум в ряду субстратов (Gly)

-Tyr, где п= 1—6, позволило од-

нозначно установить его существование в случае дипептида. Ве-

личина Км для Gly-Tyr в 5 раз меньше, чем для более длинных

субстратов, в то время как Ум для него составляет всего 1/1000

соответствующей величины для (Gly)

-Tyr [82]. Аналогичная за-

кономерность при удлинении олигосахаридной цепи субстрата на-

блюдается для лизоцима. В случае этого фермента о существова-

нии непродуктивного связывания, определяющего величину Км,

хорошо известно [83, 84]. Анализ кристаллического комплекса

глицилтирозин—>КПА показывает, что сравнительно прочное при-

соединение субстрата, которое, возможно, мешает образованию пе-

реходного состояния, объясняется взаимодействием а-аминогруппы

глицилтирозина через молекулу воды с остатком Glu-270 (разд.

3.5). Для более длинных субстратов такое взаимодействие невоз-

можно.

Некоторые кинетические параметры для ряда субстратов и мо-

дификаторов приведены в табл. 15.4. Незнание полного механизма,

Кинетические параметры для некоторых субстратов

Соединение

Структурная формула

Пептиды

1. Карбобензокси-

глицил-L-фенил-

.а л а нин (КГФ)

О О

$ \—СН„—ОС—NHCH

C--NH—CH—COO

" in -TX

2 у 1

2. Бензоилглицил-

ь-фенилаланин

(БГФ)

О о

/~\_с -NH-CH

-С— NH-CH-COO

" VQ

3. Бензоилглицил-

глицилфенил-

аланин (БГГФ)

О OO

/г-л Il Il Il

f ^—С—NH—CH

CNHCH

—С—NH—CH—COO

ООО

4- Тетра-ь-аланин

NH,-CH-С—NH-CH-C-NH-CH-С—NH-CH-COO

I I I I

5. Глицил-ь-тиро-

зин

+ Il

-C-NH-CO-COO"

Ациламинокисло-

TbL

1. Ацетил-L-фенил-

аланин

-C-NH-CH-COO-

сн

-/~\

\ /

2. гранс-Цинна-

моил-Ь-фенил-

аланин

CH=CH—C—NH—CH—COO-

V у

Таблица 15.4

и модификаторов КПА (рН 7,5, 25°С)

, M

или K

, M

Kar-

мин_1

Важные побочные процессы

Литература

2-Ю"

—

37-IO-

4,2-10-

5,5-Ю

—

12-IO

Активация субстратом,

ингибирование избыт-

ком субстрата

26, 78, 85,

о,елоз-

ило-

11•10"

за

5,6-IO

11•IO

Активация субстратом

78, 89

ыо-

1,2-IO

-0,08

6Л0

0,7-IO

-3

ыо-

за

)

ыо-

0,9

76, 82

0,155

6Л0-

0,2

34—2451

Соединение

Структурная формула

Сложные эфиры

1- Бензоилглицил-

фениллактат

(гиппурил-Ь-фе-

ниллактат,

ГФЛ)

2. Циннамоил-L-

фениллактат

3. Гиппурилгли-

колат

4. Ацетилманделат

Ингибиторы

а) Продукты

1. L-Фенилаланин

2. L-Фениллактат

3. Циннамат

б) Аналоги

1. |3-Фенилпрапи'0-

нат

2. D-Фенилаланин

Модификаторы

1. Карбобензокси-

глицин

О О

/"A—C—NHCHa—C—O—CH-COO-

CH=CH-C-O-CH-COO

о о

/ V-С— NHCH

—C—0—CH

—C00-

CHo-C -О—CH-СОО"

-CH-COO-

(к-ГЛ

НО—CH-COO-

-Q

-СН=СПСОО"

-COO-

сн^ГЛ

+ I

-CH-COO-

// w—СН»—О—С—]

-О—С—NHCH

COO

Присоединение к

КПА (метод гель-фильтрации).

Продолжение табл. 15.4

. M

или K

. M

KHT'

"И"-

Важные побочные процессы

Литература

5,1-10-

8,8-10-

28-IO

35-IO

Ингибирование избытком

субстрата

28, 78

1,5-10-

1,9-10-*

4,6-IO

90, 91

1,2-10-

4-IO

Активация субстратом

6. ю-

5,8-10-«

33, 78

0,005

Связывается не так, как

другие продукты?

90, 93

6,2-Ю-

—

19-IO-

Конкурентное, смешан-

ное неконкурентное

26, 76, 94,

0,002 26, 96

0,016-0,029

Активатор для ацил-

дипептидов, ингибитор

для эфиров и более

длинных пептидов

76, 79, 80

532

Г лава

конечно, не позволяет выразить k

KaT

и Км через индивидуальны!

константы скорости. Для большого числа субстратов, кинетика ре

акций с которыми не подчиняется уравнению Михаэлиса—Ментен

побочные пути учитывались введением соответствующих поправок

В таблице приведены некоторые константы связывания, использо

ванные ниже при обсуждении влияния модификации и замещенш

металла. Для субстратов приведены значения Км., определенные i

стационарной фазе реакции. Понятно, что предположение о равен

стве константы Михаэлиса равновесной константе связывания не

всегда справедливо для быстро превращающихся субстратов. Kai

видно, константы Км и £

ат не связаны простой пропорциональное

зависимостью [76], однако из рассмотрения параметров актнвацш-

гидролиза КГФ было заключено, что &

ат вносит вклад в Км [85]

Присоединение к апоферменту изучалось методом, основанном на

анализе влияния субстратов на скорость рекомбинации цинка и

апо-КПА [86]. Если скорость этого процесса в присутствии субст-

рата существенно уменьшается, то при добавлении цинка к смеси

фермента и субстрата и последующем быстром отделении белка

образование Zn-КПА пропорционально количеству КПА, не свя-

занной в комплекс с субстратом. Любые взаимодействия, не влия-

ющие на скорость рекомбинации с металлом, оказываются при

этом незамеченными. Более того, любое изменение равновесной

константы связывания металла под действием субстрата должно

вызывать обратное влияние металла на сродство к субстрату [87].

Качественные оценки связывания были получены также по зави-

симости скорости обмена металлов от природы субстратов и инги-

биторов [88].

Выведение общих правил на основании данных, приведенных в

табл. 15.4, представляется несколько опасным. Частично это объ-

ясняется заметной величиной поправок на существование множе-

ственных путей реакции, а кроме того, известным фактом влияния

таких переменных, как ионная сила, на кинетические параметры

для пептидов. Тем не менее можно отметить некоторые закономер-

ности. Увеличение субстрата в определенных пределах уменьшает

величину Км, что указывает на усиление взаимодействия с фер-

ментом (ср. ацетилфенилаланин, БГФ и БГГФ). Изучение эффек-

та заместителей для ряда пептидов на основе аланина подтверж-

дает это общее заключение [31]. Аномальная кинетика чаще на-

блюдается для малых субстратов. Например, ацилирование

трипептидов упрощает кинетические закономерности [31, 76]. Кро-

ме того, аномалии обычно связаны с присутствием ароматических

остатков в защитных группах [2]. Из сравнения изостерических

соединений ГФЛ и БГФ ранее был сделан вывод о том, что эфиры

связываются ферментом значительно прочнее соответствующих

пептидов. Однако для других субстратов это правило не всегда

сохраняется. Если малая величина Км для эфиров типа ГФЛ и