Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Металлоферменты 503

58. Londesborough J. С., Webster L. Т., Serutton М. С., unpublished observations

(1969).

59. Webster L. Т., J. Biol. Chem., 241, 5504 (1966).

60. Svensson /., Biochim. Biophys. Acta, 146, 239 (1967).

61. Kingdon H. S., Webster L. T., Davie E. W., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 44,

757 (1958).

62. Webster L. T., Davie E. W., Biochim. Biophys. Acta, 35, 559 (1959).

63. Lagerkvist U., Rymo L., Waldenstrom J., J. Biol. Chem., 241, 5391 (1966).

64. Clark I. M., Eyzaguirre J. P., J. Biol. Chem., 237, 3698 (1962).

65. Bublitz C., Biochim. Biophys. Acta, 128, 165 (1966).

66. Bublitz C., Biochim. Biophys. Acta, 133, 158 (1966).

66a. Cole F. X., Sehimmel P. R., Biochemistry, 9, 3143 (1970).

67. Allende J. E., Mora G., Gatiea M., Allende C. C., J. Biol. Chem., 241, 2245

(1966).

68. Grosjean G., Charlier J., Vanhumbeeek I., Biochem. Biophys. Res. Commun.,

32, 935 (1968).

68a. Loftfield R. B., Eigner E. A., J. Biol. Chem., 242, 5355 (1967).

686. Lindahl T., Adams A., Fresco J. R., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 55, 944

(1961).

69. Himes R. H., Rabinowitz !. C., J. Biol. Chem., 237, 2903 (1962).

70. Kaziro Y., Ochoa S., Adv. Enzymol., 26, 283 (1964).

71. Scrutton M. C., Mildvan A. S., unpublished observations (1963).

72. Scrutton M. C., Olmsted M. R., Utter M. F., in S. P. Colowick, N. O. Kaplan

(eds.), Methods in Enzymology, Vol. 13, Academic Press, New York, 1969,

p. 235.

73. Keech D. B., Barritt G. !., J. Biol. Chem., 242, 1983 (1968).

74. Blair J. McD., FEBS Lett., 2, 245 (1968).

75. Meister A., in P. D. Boyer, H. A. Lardy, K. Myrback (eds.), The Enzymes,

Vol. 6, 2nd edn., Academic Press, New York, 1962, p. 443.

76. Woolfotk C. A., Shapiro B. M., Stadman E. R., Arch. Biochem. Biophys., 116,

177 (1966).

76a. Kingdon H. S., Shapiro B. M., Stadtman E. R., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S.,

58, 1703 (1967).

77. Kingdon H. S., Hubbard J. S., Stadtman E. R., Biochemistry, 7, 2136 (1968).

178. Denton M. D., Ginsburg A., Biochemistry, 8, 1714 (1969).

179. Valentine R. C., Shapiro B. M., Stadtman E. R., Biochemistry, 7, 2143

(1968).

!80. Shapiro B. M., Ginsburg A., Biochemistry, 7, 2153 (1968).

181. Gottschalk A., Eur. J. Biochem., 7, 301 (1969).

!82. Robinson J. R., Sagers R. D., Bact. Proc., 1970, 124.

!83. Benziman M., Sagers R., Gunsalus I. C., J. Bact., 79, 474 (1960).

!84. Su J. C., Li C. C., Ting C. C., Biochemistry, 5, 536 (1966).

!85. Margoliash E., A. Rev. Biochem., 30, 549 (1961).

186. Kosicki G. W., Lee L. P. K., J. Biol. Chem., 241, 3571 (1966).

ГЛАВА 15

КАРБОКСИПЕПТИДАЗА А

И ДРУГИЕ ПЕПТИДАЗЫ*

Марта Л. Людвиг**, В. Н. Липскомб

Ludwig Martha L., Biophysics Research Division, Institute

of Science and Technology, University of Michigan and

Biological Chemistry Department, University of Michigan

Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA

Lipscomb W. H., Chemistry Department, Harvard University,

Cambridge, Massachusetts, USA

1. КАРБОКСИПЕПТИДАЗА А БЫКА: ВЫДЕЛЕНИЕ,

СВОЙСТВА И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Для карбоксипептидазы А (КПА) из поджелудочной желез1

быка известны и трехмерная структура [1—3], и полная амино

кислотная последовательность [4]. Роль существенно важного ме

талла установлена менее определенно, но она доступна изучеш»

с помощью разнообразных спектроскопических [5, 6] и кинетиче

ских [7, 8] методов. Следовательно, этот фермент можно включит

во все увеличивающийся список белков, для которых возмож»

провести корреляции структуры и функции. Любой предлагаемы:

механизм катализа под действием КПА должен теперь учитыват

как накопленные химические данные, так и взаимодействия, на

блюдавшиеся при структурном исследовании кристаллов комплек

са карбоксипептидазы с модельным субстратом глицил- ь-тирозг

ном [3, 9].

Карбоксипептидаза А вырабатывается ацинарными клеткам

поджелудочной железы в виде неактивного профермента. Молеку

ла прокарбоксипептидазы быка имеет молекулярную массу при

мерно 87 000 [10] и состоит из трех субъединиц, одна из которы

с молекулярной массой 40 000—42 000 и является непосредствен

ным предшественником КПА [11]. Активную КПА можно пол)

чить любым из следующих трех методов: 1) фракционирование:

автолизата замороженных поджелудочных желез (Энсон [12])

2) фракционированием водного экстракта ацетонового порошк

поджелудочной железы после активации трипсином (Аллан [13])

3) очисткой про-КПА хроматографией на ДЭАЭ-ионообменни

ках с последующим расщеплением трипсином (Кокс [14]). Прс

* Сокращения: КПА — карбоксипептидаза А, КПВ — карбоксипептидаза I

про-КПА — прокарбоксипептидаза А, ЛАП — лейцинаминопептидаза, КБЗ -

карбобензокси, E — фермент, S — субстрат, I — ингибитор, k кат — ката литическэ

константа, Км — константа Михаэлиса.

** Обладатель поощрительной премии (1 K04GM06611) службы здравоохр;

нения США.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

505

5 10 15 20 25

WlG-SER-THR-ASN-THR-PHE-ASN-TYR-ALA-THR-TYR-HI S-THR-LEU-ASP-GLU-ILE-TYR-ASP-PHE-MET-ASP-LEU-LEU-

30 35 40 45 50

UA-GLN-HIS-PR О-GLU-LEU-VAL-SER-LYS-LEU-GLN-ILE-GLY-ARG-SER-TYR-GLU-GLY-ARG-PR О-ILE-TYR-VAL-LEU-

55 60 65 70 75

PHE-SER-IHR-GLY-GLY-SER-ASN-ARG-PRO-ALA-ILE-TRP-ILE-ASP-LEU-GLY-ILE-HIS-SER-ARG-GLU-TRP-ILE-THR-

80 85 90 95 100

ILA-THR-GLY-VAL-TRP-PHE-ALA-LYS-LYS-PHE-THR-GLU-ASN-TYR-GL Y-GLN-ASN-PRO-SER-PHE-THR-ALA-ILE-LEU-

105 110 115 120 125

5ER-MET-ASP-ILE-PHE-LEU-GLU-ILE-VAL-THR-ASN-PRO- ASN-GLY-PHE-ALA-PHE-THR-HIS-SER-GLU-ASN-ARG-LEU-

130 135 140 145 150

ШС-LYS-THR-ARG-SER-VAL-THR-SER-SER-SER-LEU-CYS-VAL-GLY-VAL-ASP-ALA-A SN-ARG-ASN-TRP-ASP-ALA-GLY-

155 160 165 170 175

GLY-LYS-ALA-GLY-ALA-SER-SER-SER-PRO-CYS-SER-GLU-THR-TYR-HIS-GLY-LYS-TYR-ALA-ASN-SER-GLU-VAL-GLU-

LYS-SER-^^ V^-AS P-PHE-VAL-LYS-A^N-HI S-GLY-A SN-PHE-LY^-ALA-PKE-LEU-SER-1LE-HIS-SER-TYR-SER-GLN-

205 210 215 220 225

LEU-LEU-TYR-PRO-TYR-GLY-TYR-THR- THR-GLH-SER-ILE-PRO-ASP-LYS-THR-GLU-LEU-ASN-GLN-VAL-ALA-LYS-SER-

VAL^^ALA-£28-LYS-SER-LEU-TYR-CLY-THR-SER- TYR-LYS- WR-GLY-SER-ILE-ILE-TTO-THR-ILE-TYR^GLNJ^

GLY-GLY-SER- I^E-ASP-TRP- SER- TYR-ASN-GLN-GLY-ILE-LYS-IYR- SER-PHE-THR-PHE-GLU-LEU-ARG-ASP-THR-GLY-

TYR-GLY-FHE-ffii-LEU-PRO-ALA- SER-GLN-ILE-ILE-PR O- THR-A?A-GLN-GLU- TTO- TRP-LEU-GI.Y-VAL-LEll-THR-n.8-

305

VAT

GLU-HIS-THR—j-ASN-ASN

Рис. 15.1. Аминокислотная последовательность КПА из поджелудочной железы

быка [4].

N-концы форм а, (5 и V (или б) соответствуют остаткам I, 3 и 8, как показано стрелками.

В КПА

611

в положениях 179, 228 и 305 находятся аминокислоты, приведенные над чертой,

Val

тогда как в КПА их место занимают аминокислоты, указанные под чертой. Сегменты

цепи, которые, судя по трехмерным моделям комплекса КПА с ацилтрипептидом, образуют

активный центр, подчеркнуты.

дукт, полученный любым из этих трех методов, содержит пример-

но один атом цинка на молекулу [15] и состоит из одной полипеп-

тидной цепи [16].

Последующее хроматографическое разделение в присутствии

Р-фенилпропионата обнаружило в этих препаратах два типа ге-

терогенности [17, 18]. Поскольку в процессе активации не проис-

ходит количественного расщепления единственной пептидной связи

506

Г лава

профермента, то в зависимости от условий активации (см. работ

[19]) могут образовываться формы карбоксипептидазы, обознач;

емые буквами а, |3 или у (или б) [20, 21]. Различия в длине цеп

показаны на рис. 15.1. Препаративные методы Энсона (у-форма

[12] и Аллана (б-форма) [13] дают главным образом цепь дл!

ной 300 остатков, в то время как при активации очищенной прс

КПА получается в основном а-форма с молекулярной массо

35472 [4, 22], состоящая из 307 остатков [1] (рис. 15.1). Кром

того, КПА может существовать в виде двух аллотипных форм [23'

В одной из них, KnA

val

, остаток 179 является изолейцином, остг

ток 228 — аланином, а остаток 305 — валином. Остатки, наход?

щиеся на их месте во втором аллотипе, КПА

Ьеи

, приведены н

рис. 15.1.

Кристаллы КПА

и КПА

изоморфны. Неодинаковое распреде

ление электронной плотности в районе N-конца приводит к неболь

шим различиям в интенсивностях дифракционных пятен. Кристал

лы препарата Энсона, т. е. КПА

, принадлежат к той же прост

ранственной группе, что и кристаллы двух других карбоксипепти

даз, однако по своим характеристикам и дифракционной картин

они очень сильно отличаются от них. Хотя и КП^б и КПА

состоя

главным образом из цепей, имеющих на N-конце Asn, различия :

кристаллографических свойствах и стабильности апоферменто:

[24] указывают на то, что они химически неодинаковы. При ана

лизе кристаллической структуры была использована КПА

, в т

время как аминокислотная последовательность была определен;

для КПА

Специфичность карбоксипептидазы А такова, что она отщепля

ет L-аминокислоты от С-конца белков и модельных пептидны}

субстратов*. При работе с чистыми препаратами эндонуклеазназ

активность не обнаруживается. КПА не гидролизует простые ами

ды с образованием аммиака, а также не отщепляет от С-концг

пептидной цепи а-амиды аминокислот. Гидролиз протекает быст

рее всего в том случае, если боковая цепь остатка на С-конце име

ет гидрофобный характер [26, 27]. Величина &

ат для классиче-

ских модельных пептидных субстратов — КБЗ-глйцил-ь-фенилала

нина (КГФ) (рис. 15.2) и бензоилглицил- ь-фенилаланиш

(БГФ)—составляет примерно IO

мин

-1

. Эфирный аналог БГФ

бензоилгилицил-ь-фениллактат (БГФЛ), также быстро гидролизу-

ется с каталитической константой примерно 3-Ю

мин

-1

[28, 29]

В противоположность этому N-ациламинокислоты и дипептиды реа-

гируют значительно медленнее (табл. 15.4). Замещение у любогс

из атомов азота пептидной связи в ацилдипептидных субстратах

* Стереоспецифичность не является абсолютной; в некоторых модельных пеп-

тидах наблюдалось очень медленное отщепление от D-конца остатка D-аланина

[25]. Освобождение концевых D-аминокислот большего размера не наблюдалось,

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

507

заметно уменьшает скорость гидролиза [26, 27]. Остатки дикарбо-

яовых кислот, а также глицина и аланина отщепляются от пепти-

цов тоже сравнительно медленно в диапазоне рН 7,5—8,0, т. е. в

условиях, оптимальных для гидролиза таких модельных субстра-

тов, как БГФ. Появление в ходе гидролиза аргинина или пролина

на С-конце практически прекращает дальнейший процесс [30]. На

величины кинетических параметров реакции влияет природа не

только двух аминокислотных остатков, образующих расщепляе-

мую связь, но также, хотя и в меньшей степени, трех ближайших

Рис. 15.2. Карбобеизоксиглицилфенилаланин — модельный пептидный субстрат

карбоксипептидазы А. Гидролизуемая связь указана штриховой линией.

к ним остатков [31]. Следовательно, размеры участка связывания

пептидов таковы, что обеспечивают взаимодействие с пятью остат-

ками, причем предпоследний остаток цепи оказывает заметное вли-

яние на кинетику реакции. Присутствие остатков некоторых D-ами-

нокислот в положениях, отличных от С-концевого, не препятствует

взаимодействию с ферментом, однако если объемистая D-амино-

кислота является предпоследним остатком от С-конца, то гидролиз

идет только в случае дипептидных субстратов [32, 33].

Карбоксипептидазы, выделенные из млекопитающих и из бо-

лее примитивных видов, таких, как обыкновенная колючая акула,

требуют для активности ион металла. Предположение о присутст-

вии в КПА иона металла было сделано на основании анализа с

помощью ингибиторов [34]. Впоследствии было показано, что он

является ионом цинка и существен для активности [35]. Неактив-

ный апофермент может быть получен диализом против растворов

разнообразных хелатирующих агентов, в том числе о-фенантроли-

на и оксихинолинсульфоната [36, 37]. Апоферменты, полученные

из КПА а и КПАб. достаточно стабильны для использования в изу-

чении связывания металлов и субстратов, в то время как апофер-

мент КПА

ПО неизвестным причинам быстро денатурируется [24].

Реконструкцией из апо-КПА можно приготовить целый набор ме-

таллокарбоксипептидаз [38, 39]. Их каталитическая эффектив-

ность зависит от природы металла и наиболее высока в случае

+, Mn

+ и Ni

+ (табл. 15.5). Выдерживание Zn-КПА в присут-

ствии другого подходящего иона в соответствующей концентрации

приводит к замещению им цинка [40].

Кажущиеся константы стабильности Co(II)-КПА были опреде-

лены измерением количества связанного

Co в равновесных сме-

-O-C- NH-CH

-CfNH-CH-COO"

508

Г лава

сях металла и апофермента. Для более прочно связывающихс

металлов (табл. 15.5) эти константы были получены из эксперн

ментов, в которых с белком уравновешивались пары конкурирую

щих металлов [41]. Кроме ионов, приведенных в табл. 15.5, актив

ность апо-КПА восстанавливают Cr

+ и Fe

+ [38]. Если предполо

жить, что реакция цинка с КПА в диапазоне рН 7—9 протекае

стехиометрически (что подтверждается данными, приведенными ;

табл. 15.5), то выделение протонов при присоединении цинка i

КПА контролируется двумя группами с р/С

7,7 и 9,1. Предполага

лось, что эти группы участвуют в связывании цинка [41]*.

2. СТРУКТУРА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А

И ЕЕ КОМПЛЕКСА С ГЛИЦИЛТИРОЗИНОМ

2.1. Общее описание конформации белка

Атомные модели карбоксипептидазы А получены совмещен!^

последовательности 307 остатков с картой электронной плотности

при номинальном разрешении 2 А [1—3]. Фазы отраженных рент

геновских лучей были определены методом изоморфного замеще

ния с помощью четырех производных тяжелых атомов при разре-

шении 2,8 А и двух производных с разрешением, промежуточным

между 2,0 и 2,8 А. В двух ртутных производных ртуть замещала

цинк в активном центре (табл. 15.1). При совмещении полипептид-

ной цепи с картой электронной плотности не возникло чрезмерных

трудностей, хотя для некоторых остатков, например 133—137.

электронная плотность была существенно меньше, чем в среднем

по цепи. Оказалось, что остатки 138 и 161 соединены дисульфид-

ным мостиком [1]. Как и ожидалось, наибольшая электронная

плотность соответствовала иону цинка. При анализе карты элект-

ронной плотности было обнаружено, что цинк имеет три лиганда,

соответствующие остаткам 69, 72 и 196. Остатки 69 и 72 были пра-

вильно идентифицированы как His и Glx [1]. Отождествление ос-

татка 196 с Lys или Glx оказалось ошибочным [22].

При определении аминокислотной последовательности, приве-

денной на рис. 15.1, начальная фрагментация проводилась дейст-

вием Br

CN по остаткам метионина 22, 103 и 301 [42—44]. Взаим-

ное расположение этих фрагментов было определено изучением

пептидов, содержащих метионин [21], и было подтверждено срав-

нением с картой электронной плотности. Последующее расщепле-

ние самого большого фрагмента цепи, 104—301, потребовало ис-

пользования пяти различных протеолитических ферментов [4].

* Теперь, когда известно, что лигандами цинка служат остатки гистидина и

глутаминавой кислоты ,интерпретация этих значений рКт представляется более

сложной.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

509

Таблица 15.1

Присоединение тяжелых металлов к карбоксипептидазе

Атом

Заполнение

(число элек-

тронов на

молекулу)

Координаты тяжелого

атома Остаток

58 —0,094 0,500

—0,089

Glu-270

53 —0,089

0,540

—0,147

Небелковый цитрат

Hg,g

—0,071

0,455 —0,115

His-69, Glu-72, His-196

47 —0,071

0,452

—0,115

His-69, Glu-72, His-196

Hg,S

—0,506

0,069 —0,257 His-29

Hg,s

—0,475

0,109 —0,136

His-29, Lys-84

74 0,341 0,430

0,034

Cys-161

—0,438 0,305 —0,568 Met-103

—0,292

0,082

0,141

Ala-I (N-конец)

—0,484 0,485

—0,500 His-303

0,238

0,498

—0,278 His-166, Ser-158

—0,082

0,220

0,193

His-120

—0,457 0,090

—0,143

His-29 (Lys-84)

—0,483 0,477 —0,516

His-303

—0,500

0,500

—0,500 His-303

—0,500 0,070

—0,130 His-29 (Lys-84)

—0,087

0,443

—0,115

His-69, Glu-72, His-196

Для получения КПА с Hg.g 5-IO-' M фермент диализовали против 1 мМ HgCb, 1 M

LiCl, 0,2 M трис-буфера (рН 8) и кристаллизовали диализом против 0,18 M LiCl, 0,02 M

трис-буфера (рН 8). Это производное, содержащее один атом металла, практически не дава-

ло информации о фазовых углах при высоком разрешении. Центры Hg

Si, Hg

и Hg

заполняются при суспендировании кристаллов КПА в 0,8 мМ Hgb .

В согласии с данными рентгеноструктурного анализа остатки ци-

стеина были обнаружены в положениях 138 и 161. При определе-

нии последовательности удалось установить, что остаток 196, тре-

тий лиганд цинка, является гистидином. Природа двух других

лигандов, остатков 69 (His) и 72 (Glu), была при этом подтвер-

ждена.

Для сравнения с результатами определения аминокислотной

последовательности была предпринята попытка идентифицировать

боковые цепи методом рентгеноструктурного анализа [2, 3]. В за-

висимости от участка молекулы правильность определения остат-

ков варьировала от 60 до 85% [22]. Остатки, участвующие в свя-

зывании субстрата и в катализе (Arg-145, Туг-248 и Glu-270), были

510

Г лава 10

идентифицированы правильно. При окончательном рассмотренш

некоторых участков структуры, в которых обнаруживались проти

воречия между картой электронной плотности и последовательно

стью, были рассчитаны дополнительные карты, причем для опре

деления фазовых углов использовались координаты атомов. (Дл5

учета уменьшения электронной плотности на месте остатков 133—

137 были введены необходимые температурные параметры [3])

Как это принято в обычных кристаллографических исследованиях

Рис. 15.3. Стереоизображение молекулы карбоксипептидазы А.

Представлен вид молекулы вдоль оси В. Модельный субстрат КБЗ-Ala-Ala-Tyr занимает вы-

емку связывания субстрата и полость, примыкающую к атому дйнка. Слева видны несколь

ко больших спиральных участков. В центре молекулы находится участок с |5-структурой. ДИ'

сульфидная связь расположена в нижней правой части рисунка.

атомы, расположение которых вызывало сомнения, не использова-

лись при расчете фаз. В результате этого были исключены атомь

растворителя и около 5% атомов белка. Появление этих атомон

впоследствии на результирующих картах служило подтверждением

их важности. После повторной обработки на вычислительной ма-

шине все же остались некоторые противоречия в последовательно-

стях, определенных двумя способами [22], причем они не затра-

гивали остатки, различающиеся в двух аллоформах. Действитель-

но, из плотностей, соответствующих остаткам 179, 228 и 305

можно было заключить, что если сок поджелудочной железы дл*

приготовления кристаллов взят от одной коровы, то они отвечают

КПА

. Тем не менее остатки 151 и 93, по данным химическогс

анализа являющиеся соответственно Phe и Asn, занимают на кар-

тах больший объем и похожи скорее на Trp и Glx. Кроме того, ДВЕ

остатка кислых аминокислот, Glu-108 и Asp-256, находятся в поло-

жениях, в которых присутствие амидов вероятнее присутствия сво-

бодных кислот [22].

Общая конформация полипептидной цепи видна на рис. 15.3

на котором помечены все а-углеродные атомы. Молекула размером

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

511

Таблица 15.2

Вторичная структура карбоксипептидазы

Остатки Структура

Остатки

Структура

14—28

Спираль

173—187

Спираль

32—36

(З-Слой

190—196

13-Слой

49—53

200—204

60—66 215—231

Спираль

72—80, 82—88 Спираль

239—241

P-Слой

94—103

254—262

Спираль

104—109 (З-Слой

265—271

Р-Слой

112—122

Спираль 285-306

Спираль

122—174 «Неупорядоченная»

50X42X38 А имеет почти сферическую форму и, следовательно,

компактнее, чем было предсказано на основании величины f//

, оп-

ределенной из коэффициентов диффузии [45]. В непосредственной

близости от атома цинка находится полость, которая оказалась

участком связывания ароматической боковой цепи глицилтирозина

(ср. рис. 15.6 и 15.8). Это углубление на поверхности молекулы хо-

рошо просматривается даже на картах КПА с низким разрешени-

ем [46]. При высоком разрешении в этой полости видно несколь-

ко молекул воды. От атома цинка в сторону, противоположную ей,

проходит выемка или канал, в который можно поместить ацилиро-

ванные трипептиды (разд. 2.4.1). Из общего числа 307 остатков

115 входят в спиральные структуры*, 45 —в протяженные р-струк-

туры, а оставшиеся 147 — в структуры, которые можно назвать

«нерегулярными» в том смысле, что они отличаются от типичных.

В табл. 15.2 приведены типы вторичной структуры, которые на-

блюдаются при рассмотрении пептидной цепи. Все спиральные уча-

стки, за исключением трех сравнительно коротких (остатки 112—

122, 173—187 и 254—262), расположены в левой части молекулы,

изображенной на рис. 15.3. Фактически ни один из них нельзя

х считать находящимся внутри молекулы. Центр КПА и одна из

сторон активного центра образованы участком с искаженной

р-структурой, состоящим из восьми сегментов, которые расположе-

ны таким образом, что четыре пары цепей параллельны, а три ан-

типараллельны (рис. 15.4). На рис. 15.3 участок с р-структурой

расположен перпендикулярно плоскости листа, в результате чего

* Считается, что остатки входят в а-спиральный участок, если они образуют

одну водородную связь, характерную для этой структуры.

512

Г лава 10

хорошо видны искривления в слое: самый верхний сегмент (остат-

ки 238—243) повернут по отношению к самому нижнему (остатки

32—37) почти на 120°. Правая часть молекулы (рис. 15.3) состоит

главным образом из «неупорядоченных» участков и содержит ди-

сульфидный мостик, соединяющий остатки 138 и 161 и находящий-

ся на расстоянии около 20 А от атома цинка. Эта «неупорядочен-

-C-241-N- C-240-N-С-239- «—-

0 \ d

' \ I

1 О /

/ V I

-204-N-C-203-N-C-202-N-C-20VN-C-200-N- «—

Ii Ii I

О I °|

О I

? 'OO

-N-265-C-N-26e^-N-267<:-N-268-C-N-269-C-N-27D-C-N-271-i »

I \ I \ ) \ I

I О I О I О I

\ I

О \ О

-190-C-N-191-C-

-192-C-N-193-C-N-194-C - N-195-C-N-196-C- —»

0 / о

о \ о \ 9

-60-C -N -61 -i-N-62-C- N-63-C-N-64-C-N-65-C-N-66- —»

' ' '

Я / о / о

1 о \ О \ О

\ I , / \ I

-N-ICH-C-N-105-(^-N-Ю6-С-N-107-^-N-108-C-N-109- —»

: ? : ?

? : ? :

-53-N-C-52-N-C- 51-N-C-50-N-С-49 -N-

• О ; О !

9 \ О | О

-32-C

N-33-C-N-34-C-N-35-C-N- 36-С- —»

6 6

Рис. 15.4. Диаграмма расположения |3-слоев в молекуле карбоксипептидазы А.

Предполагаемые водородные связи показаны штриховыми линиями. Стрелками обозначены

параллельное и антипараллельное расположения сегментов.

ная» часть молекулы сравнительно подвижна, и в ней происходит

большая часть конформационных изменений, вызываемых связы-

ванием субстрата. Окончательная структура КПА, изображенная

на рис. 15.3, не может получиться сворачиванием полипептидной

цепи субъединицы про-КПА в ходе ее синтеза, идущего от N-KOH-

ца. Так, например, цепь 249—254 должна разместиться между дву-

мя сегментами около остатков 150 и 208, разделенными расстояни-

ем всего в 5—6 А. Аналогичным образом участок 265—271 в конеч-

ной структуре расположен между сегментами 200—204 и 190—196.

Координаты атомов были уточнены с помощью программы, ко-

торая, варьируя углы поворота относительно отдельных связей,

оптимизирует согласие с известной последовательностью на осно-

вании некоторых контрольных координат [47]. Уточненное значе-

ние угла т, обр

азованного связями Скарбонил—-C

—N, составило