Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

513

112°, а не 109,5°, как в правильном тетраэдре. Это указывает на то,

что структура пептидных единиц несколько искажена. По извест-

ным координатам атомов для каждого остатка были рассчитаны

величины диэдральных углов ф и -ф [3, 48, 49]. Описание структу-

ры посредством диэдральных углов дано на рис. 15.5, представля-

ющем собой конформационную карту молекулы карбоксипептида-

ф, град

Рис. 15.5. Карта диэдральных углов КПА.

Границы размещения областей обозначены сплошными линиями для X—110° и штриховыми

линиями для X—115°. Светлые кружки соответствуют остаткам глицина. Величины углов

Ф и i|) в а-спирали составляет 132 и 123°, а в антипараллельном Р-слое — 40 и 315* соот-

ветственно. Отсчет углов ф и \|> приводился так же, как в работе [49].

зы. Хотя сгущение точек примерно соответствует углам, характер-

ным для модельной а-спирали, разброс означает, что ни один из

спиральных участков не является абсолютно правильным. Напри-

мер, часть цепи, содержащая остатки с 72 по 88, изогнута посере-

дине таким образом, что образование водородной связи с остатком

триптофана 81 оказывается невозможным. Точно так же обнаружи-

ваются отклонения от модельной структуры на участке с р-формой

[50].

Несколько остатков, по-видимому, находятся в конформациях,

которые по теоретическим соображениям запрещены. Аналогичные

результаты были получены для лизоцима [51], однако значение

этих высокоэнергетических конформаций пока непонятно. При

35—2451

514

Г лава 10

встраивании остатка гистидина 196, являющегося лигандом цинка,

в карту электронной плотности оказалось необходимым ввести ис-

каженную ^ис-пептидную связь между серином 197 и тирозином

198. Поскольку это первый пример образования ^ис-пептпдной свя-

зи у остатка, отличающегося от пролина, к нему следует отнестись

с некоторой осторожностью. С другой стороны, возможно, что та-

кой способ образования связи имеет значение для активности фер-

мента.

Распределение остатков внутри и снаружи молекулы согласу-

ется с данными для других глобулярных белков. Гидрофобные

остатки предпочтительнее располагаются внутри молекулы, а заря-

женные группы — снаружи [52]. Поскольку участок в (3-формс на-

ходится главным образом внутри глобулы, в нем обнаружено мно-

го гидрофобных аминокислот, в том числе лейцина и фенилалани-

на. Всего в контакте с водой не принимают участия 78 остатков.

Из них 22 могут образовывать водородную связь с атомами пептид-

ной связи или близлежащих остатков, и, по-видимому, эта возмож-

ность почти во всех случаях реализуется [3, 52]. Два остатка трип-

тофана (63 и 147) и один остаток тирозина (238) спрятаны внутри

молекулы КПА. Остальные остатки этих аминокислот находятся в

частичном контакте с растворителем. Существование водородной

связи между ОН-группой Туг-238 и карбонильной группой Glu-270,

вероятно, имеет некоторое значение для конформационного изме-

нения с участием Glu-270 при связывании субстрата, как описано

ниже. Четыре из десяти остатков пролина расположены у N-концов

спиральных участков, а три — у концов наиболее длинных цепей в

слое с p-структурой. Во внутренней части молекулы находятся три

карбоксильные группы, принадлежащие остаткам 104, 108 и 292.

Конечно, справедливость этого утверждения зависит от того, на-

сколько правильно установлен тот факт, что они являются свобод-

ными и не участвуют в образовании амидных связей. Карбоксиль-

ная группа Glu-292 образует солевой мостик с Arg-272, так что ее

заряд локально нейтрализован. Детальное изучение карт электрон-

ной плотности обнаружило неизвестный ранее факт внедрения в

молекулу карбоксипептидазы десяти молекул воды [52].

2.2. Активный центр

2.2.1. Конформация белка

Структура активного центра образована теми атомами фермен-

та, расстояния которых от природных субстратов не превышают

расстояния, на котором действуют силы Ван-дер-Ваальса. Если

учесть все остатки вблизи молекулы глицилтирозина, а также те

остатки, близость которых к ацилтрипептиду, находящемуся в «вы-

емке» поверхности, постулируется из модельных опытов (рис. 15.3),

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы 515

то можно заключить, что в образовании активного центра участву-

ют следующие сегменты цепи: 69—72, 125—127, 142—145, 155, 163,

164, 194—203, 243, 247—256, 268—270 и 275—279. Боковые цепи

остатков 70, 126, 143, 195, 197, 200, 202, 249, 252—253 и 275—276

направлены в сторону, противоположную месту присоединения суб-

страта, и, по-видимому, не контактируют с ним непосредственно.

Остатки 194—203 и 268—270 входят в слой с p-структурой, кото-

рый образует одну из стенок участка связывания глицилтирозина.

Остальные остатки, за исключением лигандов цинка 69 и 72, нахо-

дятся в извилистой правой части молекулы, показанной на

рис. 15.3. Верхняя часть полости, в которой помещается тирозиль-

ная боковая цепь глицилтирозина, образована остатками 243 и

246—250, а остальная ее часть — остатками 155 и 253—256. Левая

часть выемки, являющейся участком связывания, образована сег-

ментом 275—279 (рис. 15.3), а правая — сегментами 125—127,

142—145 и 163—164. На рис. 15.6 карта электронной плотности в

районе связывания субстрата совмещена с изображениями глицил-

тирозина и части контактирующих остатков.

Большая часть центра присоединения субстрата не имеет регу-

лярной вторичной структуры. За исключением нескольких сегмен-

тов в p-форме и нескольких остатков в начале одной из спираль-

ных частей (255—256), подавляющее большинство остатков нахо-

дятся в «неупорядоченных» участках. Конформационная карта

остатков активного центра подтверждает то, что только незначи-

тельная их часть имеет значения ср и я|з, близкие к наблюдаемым в

а-спиральной структуре.

2.2.2. Цинк

В присоединении цинка к карбоксипептидазе участвуют три

белковых лиганда: His-69, Glu-72 и His-196. Связи гистидин—цинк

осуществляются через атом азота в положении Ni кольца. Кроме

того, лиганды принимают участие и в других взаимодействиях.

Атом азота N

в His-69 образует водородную связь с остатком

Asp-142, а атом азота N

в His-196 соединен такой же связью с мо-

лекулой воды. На предварительных картах вблизи атома цинка

была обнаружена повышенная электронная плотность, не относя-

щаяся к белку. С помощью карт, построенных по рассчитанным

значениям фаз, удалось установить, что она принадлежит един-

ственному небелковому лиганду металла. Поскольку величина

электронной плотности соответствовала атому кислорода, было

предположено, что он является молекулой воды или ОН-ионом.

Понятно, что некоторые молекулы КПА вместо воды могут связы-

вать Cl

, однако малая величина электронной плотности свидетель-

ствует о том, что их число невелико. Расположение лигандов отно-

сительно атома цинка показано на рис. 15.7, а значения углов

33*

516

Г лава

pbe-ZTf

Рис. 15.6. Центр связывания глицил-L-тирозина. Модель глицил-L -тирозина в

ориентации, определенной по разностным картам, совмещена с несколькими се-

чениями карты электронной плотности КПА.

Близлежащие остатки аминокислот приведены в той конформации, в которой они находятся

в свободной КПА. Справа от субстрата расположен кластер из трех остатков аргинина.

Плотность в районе фенольнсиго кольца субстрата происходит, как полагают, от четырех

молекул воды, вытесняемых субстратом (Dickerson R. E., Geis /., The Structure and Action

of Proteins with Stereo Supplement, Harper and Row Publishers, Inc., 1969). Рисунок приве-

ден с разрешения авторов и издателей.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы 517

между связями приведены в табл. 15.3. Даже если допустить, что

ошибка при определении углов составляет ±10°, отклонения от

тетраэдрической конфигурации значительны главным образом из-

за близости атома цинка к |3-СН

-группам гистидина вследствие

того, что связь с ним осуществляется через атом азота.

мощью ЭВМ по программе OR-TEP д-ра К. Джонсона.

Искажения в геометрическом расположении лигандов цинка не

являются исключительным свойством белков, так как они встреча-

ются и в хелатах, образуемых цинком с аминокислотами и пепти-

дами (гл. 4). Из них можно упомянуть Zn(Gly-Gly-Gly)(SO

)IZj-

•2Н

0, Zn(b-His)

-2H

0 и Zn(D, L-His)

-5H

0. Комплекс с тригли-

цином представляет собой деформированную бипирамиду, углы

Таблица 15-3

Углы между связями, образуемыми лигандами металла

в Zn-карбоксипептидазе

Li—Zn— Угол, град

N(69)—Zn-N(196)

N(69)—Zn—0(72)

0(72)—Zn—N(196) 143

0(72)—Zn—O(H

O) 99

N(69)—Zn-O(H

120

N(196)—Zn—O(H

111

518

Г лава

между связями в которой отличаются от идеальных на 20° [53]

В соединениях с гистидином четыре азотных лиганда образуют

тетраэдр с угловыми искажениями около 10°. Кроме того, с цин-

ком связаны два атома кислорода [54, 55].

2.3. Комплекс КПА с глицилтирозином

Фермент-субстратный комплекс глицилтирозина и КПА был

изучен кристаллографически при атомном разрешении с помощью

разностного фурье-метода [1—3]. Это оказалось возможным бла-

годаря чрезвычайно низкой скорости превращения глицилтирози-

на. В растворе £

ат имеет порядок 1 мин

-1

, тогда как в кристалли-

ческом состоянии величина периода полупревращения соизмерима

со временем съемки дифракционной картины. В кристаллическом

комплексе обнаружен только один тип связывания глицилтирозина

с ферментом. Взаимодействия, наблюдаемые в этом комплексе, лег-

ли в основу предполагаемого механизма действия КПА (разд.

3.5.1) [2].

Обычно в кристаллографии белков для расчетов по

разностному методу Фурье используются коэффициенты

to (I Fes

— JexpCiaE)*. Поскольку вклад, соответствующий

структуре нативного фермента, вычитается, то суммирование ря-

дов Фурье позволяет получить изображение различий между струк-

турами E и ES. Если некоторые атомы белка смещаются в резуль-

тате комплексообразования, то на их месте появляются участки

с отрицательной электронной плотностью. На предварительных

разностных картах комплекса с глицилтирозином при разрешении

2,8 А хорошо наблюдалось расположение атомов тирозильной

группы. Однако глицильный остаток субстрата, который на

рис. 15.6 и 15.8 находится над атомом цинка, особенно его карбо-

нильная группа, был виден плохо. Причиной этого могло быть то,

что при связывании субстрата электронная плотность небелкового

происхождения вблизи атома цинка замещалась на эквивалент-

ную ей. Были рассмотрены две возможные ориентации глицильной

части субстрата. Более вероятная из них предполагает образова-

ние связи между атомом металла и кислородом карбонильной

группы [2].

Для того чтобы более надежно определить ориентацию моле-

кулы глицилтирозина, был проведен новый обсчет дифференциаль-

ной карты. В общем случае можно ожидать, что карта, рассчитан-

I FE S

I—амплитуда рассеивания для кристаллов, содержащих субстрат,

— амплитуда рассеивания для кристаллов «свободного» фермента, ав—фа-

зовый угол, рассчитанный методам изоморфного замещания. Множитель ш харак-

теризует вес отдельного члена.

Рис. 15.8. Стереоизображение конформационных изменений, сопровождающих

присоединение субстрата

а — свободная КПА; б — комплекс КПА с Gly-Tyr. Остатки Arg-145, Glu-270 и Туг-248, из-

меняющие свое положение при связывании субстрата, и молекула Gly-Tyr обозначены утол-

щенными линиями. Тирозильный остаток Gly-Tyr занимает «полость специфичности», а атом

кислорода карбонильной группы расщепляемой пептидной связи становится лигандом цинка.

520

Г лава

ная по коэффициентам ( I^es |— |/

Pacc

I) ехр (га

ра

ссч) *, обнаружит

расположение всех атомов комплекса с субстратом, для которых

оно будет иным, чем в нативной структуре. К сожалению, из-за

того, что только часть молекул (х) в кристалле связана с субстра-

том, карта, основанная на этих коэффициентах, содержала бы

плотности, соответствующие всем атомам той доли молекул

—

х), которые не образовали комплекс, за исключением опущенных

при расчете структуры, а именно, молекулы воды в полости, и

плотность небелкового происхождения вблизи атома цинка. По-

этому коэффициенты, соответствующие доле свободного фермента,

были также вычтены. Таким образом, в новом модифицированном

варианте расчета [3] коэффициенты были равны

(I Fes

—*

vacc4

— (1-х)

|) ехр (Шрассч)

•

Контакты фермента с субстратом, обнаруженные на окончатель-

ной карте, представлены на рис. 15.6 и 15.8. Существенные взаимо-

действия между глицилтирозином и белком можно разбить на пять

групп.

1. Фенольная боковая цепь остатка тирозина занимает полость

на поверхности фермента, вытесняя оттуда несколько молекул во-

ды. Соответствие фенольной группы и этой полости неидеально, что

согласуется с наличием довольно широкой специфичности в отно-

шении этой части субстрата, которая может быть ароматической

или разветвленной алифатической. Вблизи ароматического цикла

находятся остатки Ile-243, Ile-247, 11е-255 и Asp-256 (рис. 15.6).

2. Карбоксильная группа субстрата присоединена к гуанидино-

вым группам Arg-145 посредством двух водородных связей.

3. Фенольный атом кислорода в Туг-248 находится на расстоя-

нии, меньшем длины водородной связи, от NH-группы пептидной

связи субстрата. Расстояние это равно 2,7 А при точности ±1,0 А.

4. Атом кислорода карбонильной группы субстрата занимает

по отношению к атому цинка примерно то же положение, что и мо-

лекула воды или ион OH

в свободном ферменте. Хотя атом кис-

лорода карбонильной группы субстрата виден очень плохо, его

локализация подтверждается расположением плотностей, соответ-

ствующих атомам азота аминогруппы и C

в субстрате. Кроме то-

го, на картах нет других сгущений электронной плотности, которые

можно было бы приписать карбонильной группе. Атом углерода

этой группы расположен на расстоянии 3,5 А от атома кислорода,

принадлежащего остатку Glu-270.

5. Аминогруппа субстрата связана с остатком Glu-270 через мо-

лекулу воды. Это взаимодействие считается «непродуктивным»

(разд. 3.5.1). По-видимому, оно не является электростатическим,

* IFpaссч] и сХрассч — амплитуда рассеивания и фазовый угол, рассчитанные

по положению атомов.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

521

поскольку из экспериментов по ингибированию вытекает, что с

КПА связывается только анионная форма глицилтирозина [56].

Образование фермент-субстратного комплекса происходит в ре-

зультате ряда конформационных изменений в структуре белка. Са-

мые значительные из них затрагивают остатки 248, 270 и 145 и

видны из сравнения рис. 15.8, а и б. Гуанидиновая группа остатка

Arg-145 перемещается примерно на 2 А в результате поворота вок-

руг связи Cp—C

. Кислородные атомы карбоксильной группы ос-

татка Glu-270 смещаются примерно на 2 А вдоль оси у вследствие

поворотов вокруг связей C

—Cp и Cp—C

(на рис. 15.8, б карбо-

ксильная группа переворачивается и сдвигается вверх по отноше-

нию к наблюдателю). Более других изменяет свое положение оста-

ток Туг-248. Кислородный атом боковой цепи этой аминокислоты

сдвигается на 12 А в результате поворота приблизительно на 120°

вокруг связи C

—Cp и небольшого смещения пептидного скелета.

Фенольное кольцо остатка Туг-248 поворачивается по направлению

к субстрату, заключая С-концевой участок в полость. В своем но-

вом положении этот остаток близок к расщепляемой пептидной

связи. Движение остатков Arg-145 и Туг-248, вероятно, взаимосо-

гласовано посредством нескольких менее значительных перемеще-

ний. В свободном ферменте остатки Туг-248 и Arg-145 соединены

системой водородных связей, в которой принимают участие остат-

ки 155, 154 и 249. После присоединения глицилтирозина взаимо-

действия в парах Arg-145—Glu-155 и Gln-249—Туг-248 нарушают-

ся и пептидная цепь на участке 247—249 несколько изменяет свое

положение.

Присоединение субстрата превращает заполненную молекулами

воды полость в сравнительно гидрофобный участок. Остаток

Leu-203 выступает внутрь полости, тогда как в свободном фермен-

те он взаимодействует с другими аминокислотами, образующими

Р-структуру. Однако вода удаляется из полости лишь частично, и

три или четыре ее молекулы остаются внутри после присоединения

тирозильной группы субстрата. Поскольку в этом участке происхо-

дит связывание боковых групп гидрофобных С-концевых остатков

и субстраты с такими остатками гидролизуются быстрее всего

(рис. 15.2), то эту полость можно назвать участком специфичности.

При этом надо иметь в виду, что другие участки связывания также

влияют на специфичность.

Константа диссоциации комплекса глицилтирозина с КПА при

C равна Ы0~

M (табл. 15.4). Соответствующая ей величина

AG составляет —4,1 ккал/моль, что меньше суммы вкладов всех

наблюдаемых взаимодействий [57, 58]. Часть энергии связывания

предположительно используется для перевода субстрата и (или)

фермента в напряженные, т. е. энергетически невыгодные конфор-

мации [59—62] (разд. 3.5.1). Таким образом, благоприятные фер-

мент-субстратные взаимодействия служат источником энергии для

522

Г лава

конформационных изменений белка. Так как остаток Туг-248, по-

видимому, существен для пептидазной активности (разд. 3.3), а его

правильное расположение по отношению к субстрату достигается в

результате структурной перестройки, вызываемой присоединением

субстрата, то взаимодействие КПА — глицилтирозин служит хоро-

шим примером «индуцированного соответствия» фермента субстра-

ту [63, 64].

2.4. Дополнительные структурные исследования*

2.4.1. Моделирование

Для увеличения взаимодействия с ферментом можно увеличить

размер пептидного субстрата, исходя из известной специфичности

КПА в отношении связывания [2, 3]. Одна из моделей фермент-

субстратного комплекса, в котором субстратом является КБЗ-А1а-

Ala-Туг, показана на рис. 15.3. После того как остаток Туг-248 из-

менил свое положение, пептидная связь Ala-Ala находится по

отношению к нему на расстоянии, при котором возможно образо-

вание водородной связи. Ее существование объясняет большую ре-

акционную способность пептидов с NH-группой в ближайшем от

конца положении по сравнению с пептидами, у которых в положе-

нии Si (рис. 15.9) находится N-метильный [66] или р-аланильный

остаток [67]. Остальная часть субстрата располагается в «выем-

ке» на поверхности КПА, что согласуется с тем, что в контакте с

белком могут находиться до пяти аминокислотных звеньев субстра-

та [31]. Положение бензильного остатка КБЗ-группы вблизи аро-

матического остатка Phe-279 и атома кислорода карбоксильной

группы третьей от конца аминокислоты субстрата вблизи гуани-

диновой группы остатка Arg-71 согласуется с известным влиянием

заместителей на величину Км [31].

Можно отметить, что моделирование подтверждает и некоторые

известные особенности стереоспецифичности КПА [3, 52], если до-

пустить, что молекула субстрата в кинетически важном комплексе

расположена так же, как молекула глицилтирозина. Так, если суб-

страты, замещенные в области С-конца (КБЗ-01у-тиазолидинкар-

боновая кислота [68], КБЗ-Gly-Pro [69]), поместить таким обра-

зом, что группа R оказывается в полости, COO

— вблизи Arg-145,

a C=O-вблизи атома цинка, то возникают стерические помехи

со стороны остатков 11е-247 и Туг-248. Пептиды, оканчивающиеся

* В настоящее время проводится кристаллографическое изучение комплекса

КПА и Phe-Gly-Phe-Gly [65]. Карты электронной плотности отчетливо указывают

на существование связи между карбонильной группой субстрата и атомом цинка.

Кроме того, ион цинка заметно смещается (примерно на 0,6 А) при связывании

этого субстрата.