Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

Глава

ПРИМЕРЫ

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

КИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА

ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Механизм ферментативной реакции можно считать полно-

стью установленным, если охарактеризованы все промежуточ-

ные соединения, комплексы и конформационные состояния фер-

мента и определены константы скорости их взаимопревращений.

Таким образом, задача исследователя состоит в установлении

числа и последовательности промежуточных соединений и про-

цессов, выяснении их природы (т. е. в установлении, образуются

ли промежуточные соединения с ковалентными связями или

имеют место конформационные изменения), в измерении кон-

стант скорости и (исходя из анализа их рН-зависимости) в

определении степени участия в катализе кислых и основных

групп. Исследователь должен установить химическую природу

промежуточных соединений, выяснить, в

ходе

каких превраще-

ний

они образуются и распадаются, и определить тип катализа.

Все эти результаты вместе с данными рентгеноструктурного ана-

лиза и теоретическими расчетами позволят полностью описать

механизм данной реакции.

Рассмотрим ряд методов обнаружения промежуточных со-

единений и описания путей реакции на примере процессов, ка-

тализируемых некоторыми хорошо изученными ферментами.

А.

Возможности

предстационарной

стационарной

кинетики

Часто можно услышать, что кинетика не в состоянии дока-

зать правильность предложенного механизма, но зато всегда

может исключить альтернативные механизмы. Это утверждение,

несомненно,

справедливо для стационарной кинетики, когда из-

меряются только скорости появления продуктов или исчезнове-

ния

реагентов, но оно не распространяется на предстационарную

кинетику. Если промежуточные соединения можно регистриро-

вать и, таким образом, определить скорость их образования и

исчезновения, исследователь в состоянии доказать адекватность

данного механизма. В этом заключается главная сила предста-

ционарной

кинетики; фермент берется в количествах,

сравнимых

212

ГЛАВА

количеством

субстрата,

и исследуются события, происходящие

на

самом ферменте. Конечно, и в этом

случае

некоторые проме-

жуточные соединения

могут

остаться неидентифицированны-

ми

— либо из-за того, что они не накапливаются, либо из-за того,

что не

дают

вклад в изменение спектров или просто имеют

слишком малые времена превращения, чтобы их можно было

зарегистрировать. И тем не менее общий ход реакции можно

проследить достаточно строго с помощью предстационарнои ки-

нетики.

Основная слабость стационарной кинетики состоит в том,

что получаемые данные всегда являются неоднозначными. Ста-

ционарная

кинетика не

дает

прямой информации относительно

числа промежуточных соединений и поэтому всегда оперирует

минимальным числом этих соединений. Это не означает, что

предстационарная кинетика должна вытеснить стационарную;

скорее

следует

использовать сочетание этих

двух

подходов.

Стационарная кинетика становится значительно более мощным

инструментом, если с помощью предстационарнои кинетики по-

лучена информация о промежуточных соединениях.

Предстационарная кинетика обладает рядом преимуществ с

практической точки зрения. Она имеет дело с очень простыми по

сути процессами; например, с ее помощью определяют стехио-

метрию процесса, в

ходе

которого происходит

«всплеск»

концен-

трации продукта, находят константы скорости переноса связан-

ных с ферментом промежуточных соединений на второй

субстрат

или исследуют индуцируемые лигандами конформационные из-

менения

в белках. Кроме того, характеристики процессов перво-

го порядка (которые обычно изучают) не зависят от концентра-

ции

фермента в отличие от констант скорости, измеряемых в

стационарной кинетике. Для исследования быстрых реакций

требуются очень высокие концентрации ферментов, но их значе-

ния

близки к концентрациям in

vivo.

Более того, аналогичные

концентрации

обычно используются при прямом определении

физического состояния белка, что позволяет получать, например,

данные об агрегации в условиях, при которых протекает реак-

ция.

Данные предстационарнои кинетики основаны на прямых из-

мерениях, а прямые данные всегда предпочтительнее косвенных,

особенно если

учесть

неопределенности, возникающие обычно

при

интерпретации данных стационарной кинетики (разд. Б.4).

1. Выявление промежуточных соединений:

что считать доказательством?

Основная часть изложенного ниже материала посвящена

вопросам определения путей превращения субстратов в

ходе

ферментативных реакций. Обычно прежде всего нужно обнару-

КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 213

жить промежуточные соединения, поскольку это является дово-

дом в пользу существования данного пути. Мы

будем

считать,

что образование промежуточного соединения в

ходе

реакции

доказано, если выполняются следующие условия:

а. Промежуточное соединение выделено и охарактеризовано.

б. Промежуточное соединение образуется достаточно быстро,

чтобы находиться на пути превращения.

в. Промежуточное соединение реагирует достаточно быстро,

чтобы находиться на пути превращения.

Чтобы выяснить, выполняются ли эти условия, необходимо на

какой-то стадии исследований прибегнуть к предстационарной

кинетике с тем, чтобы измерить константы скорости образования

исчезновения промежуточного соединения. Однако просто

провести такие измерения недостаточно — нужно показать, что

полученные константы согласуются с активностью фермента в

стационарных условиях. Следовательно, весьма полезно и

даже

необходимо использовать сочетание этих

двух

подходов.

Следует

помнить, что выделенное промежуточное соединение

может представлять собой продукт превращения

другого

про-

межуточного соединения и на самом

деле

не образовываться в

ходе

реакции. Вот почему нужно, чтобы выполнялись условия б

в. И наоборот, может оказаться, что выделено само промежу-

точное соединение, но при выполнении экспериментальных про-

цедур

фермент переходит в

другую,

менее активную конформа-

цию.

В этом

случае

условия б и в не

будут

выполняться,

несмотря на то что природа химического соединения не измени-

лась.

Б.

Химотрипсин: выявление промежуточных

соединений с помощью метода остановленной

струи, данных стационарной кинетики и

определения соотношения

между

продуктами

Механизм гидролиза амидов и эфиров, катализируемого этой

типичной сериновой протеазой, включает образование на на-

чальной стадии комплекса Михаэлиса с последующим ацилиро-

ванием

Ser-195

и образованием ацилфермента (гл. 1). Многие

кинетические исследования ферментов были направлены на вы-

явление ацилфермента. Полученные результаты хорошо демон-

стрируют возможности предстационарной и стационарной

кине-

тики.

Ацилфермент накапливается при гидролизе активирован-

ных или специфических эфирных субстратов (k

> k

), так что

выявить его относительно просто. В

случае

физиологических

214

ГЛАВА 7

пепетидов накопления ацилфермента

не

происходит

(/г

< &з) и

его выявление затруднено.

RCO—X

ч=*

RCO—Х.Е

—^

RCO—Е

—^->

RCO

Е.

(7.1)

хн

1. Выявление ацилфермента, образующегося

при

гидролизе эфиров,

помощью данных

предстационарной

кинетики

а. Исследование начального всплеска концентрации продукта

реакции

1954 г.

Хартли

Килби

при

исследовании реакции

между

химотрипсином, взятом

количестве, сравнимом

количеством

субстрата,

избытком я-нитрофенилацетата

или

п-нитрофенил-

этилкарбоната

II],

обнаружили,

что

экстраполяция количества

высвобождающегося n-нитрофенола

нулевому моменту време-

ни

дает

не

нулевое количество этого соединения,

указывает

на

наличие всплеска, амплитуда которого равна концентрации

фермента

(рис.

4.10).

Они

постулировали,

что

сначала эфир

быстро ацилирует фермент

соотношении

1 : 1, а

затем

ходе

последующего превращения субстрата идет относительно

мед-

ленный

гидролиз ацилфермента

—

стадия, являющаяся лимити-

рующей. Впоследствии

это

предположение было подтверждено

ходе

исследований

применением метода остановленной

струи.

Позже

аналогичные эксперименты были проведены

и с мно-

гими другими ферментами. Однако наличие всплеска может

быть обусловлено

не

накоплением промежуточных соединений,

причинами

иной природы,

что

всегда

следует

иметь

виду.

Ниже

рассмотрено несколько примеров такого рода.

а.

При

связывании

первым молем субстрата фермент

пе-

реходит

менее активное конформационное состояние.

б.

Лимитирующей стадией является высвобождение

про-

дукта.

в.

Имеет место сильное ингибирование продуктом.

Исключить

пп. а а б

довольно сложно.

Это

удалось сделать

случае

химотрипсина

ходе

следующих исследований

приме-

нением

метода остановленной струи.

б. Метод

остановленной

струи

Хромофор в уходящей группе [2—4].

Первые исследова-

ния,

которых использовался нитрофенилацетат, получили

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

ФЕРМЕНТОВ

215

дальнейшее развитие после того, как

удалось

синтезировать

n-нитрофениловые эфиры специфических аминокислот, например

E-OH

AcPhe

E-OH

AcPheOM*

AcPheO-E

О 20 40 60 80 100'

Вр

10 20 30 40

емя

Рис.

7.1. Метод вытеснения профлавина. Растворы химотрипсина (10 мкМ),

профлавина (50 мкМ) и AcPheOMe (2 мМ) смешивали при рН = 6 и 25 °С

приставке к спектрофотометру, предназначенной для проведения исследова-

ний

методом остановленной струи. Связывание

субстрата

протекало слишком

быстро, чтобы его можно было зарегистрировать. Быстрое экспоненциальное

уменьшение поглощения обусловлено вытеснением профлавина из фермента

при

образовании ацилфермента. Медленное увеличение поглощения отра-

жает

исчерпание

субстрата

и последующее уменьшение стационарной концен-

трации ацилфермента [4].

ацетил-Ь-фенилаланина, ацетил-Ь-тирозина и ацетил-Ь-трипто-

фана.

Скорость ацилирования фермента определяют по скорости

появления

нитрофенола или нитрофенолят-иона, полоса погло-

щения

которого не совпадает с полосой поглощения исходного

эфира.

СН

NO,

с=о

п-Нитрофениловый

эфир

ацетил-1-

фенилаланина

При

смешивании эфира с ферментом сначала наблюдается

быстрый экспоненциальный рост поглощения, а затем поглоще-

ние

увеличивается линейно и

отражает

постепенное накопление

216

ГЛАВА 7

нитрофенола. Константу скорости ацилирования

константу

диссоциации фермент-субстратного комплекса можно рассчи-

тать

из

концентрационной зависимости константы скорости

экспоненциальной

фазы [уравнение (4.44)]. Константа скорости

для линейного

участка

дает

скорость деацилирования.

сожа-

лению, нитрофениловые эфиры часто настолько реакционноспо-

собны,

что

скорость ацилирования слишком высока, чтобы

мож-

но

было использовать

метод

остановленной струи.

Хромофор в ацильной группе [4, 5].

Поглощение фурил-

акрилоиловой группы зависит

от

полярности окружающей

сре-

ды,

также

от

природы соединения,

которому

эта

группа

присоединена. Связывание этилового эфира фурилакрило-

ил-Ь-тирозина

химотрипсином сопровождается небольшим

из-

менением

спектре

его

поглощения; образование ацилфермента

последующий гидролиз также приводят

спектральным

из-

менениям.

Из

соответствующих

экспериментов можно опреде-

лить константы скорости ацилирования

деацилирования

константу диссоциации комплекса Михаэлиса.

НО—£

\-СН

СН ОСН

СН

сн=сн

Этиловый

эфир

фурилакрилоил-L-

тирозина.

При

смешивании этилового эфира фурилакрилоил-Ь-тирози-

на

ферментом

на

первом этапе происходит изменение погло-

щения

раствора, обусловленное образованием комплекса Миха-

элиса. Константа скорости этого процесса лежит

вне

временной

шкалы

метода

остановленной струи, однако данные

по

измене-

нию поглощения можно использовать

для

расчета константы

диссоциации.

По

мере накопления ацилфермента наблюдается

экспоненциальный

рост поглощения. Дальнейшие изменения

спектре фурилакрилоиловой группы связано

постепенным

гид-

ролизом этого эфира

до

свободной кислоты.

Хромофор в

обратимо

связывающемся

ингибиторе

[6, 7].

Спектр поглощения красителя профлавина очень сильно зависит

от полярности растворителя. Профлавин является конкурентным

ингибитором химотрипсина, трипсина

тромбина;

его

связыва-

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

ФЕРМЕНТОВ

217

ние

сопровождается значительным увеличением поглощения

при

465

нм

(Де~2-10

М-

см-

) (рис. 7.1).

Профлавин

{Ъ,6-шаминоакридин)

При

смешивании эфира (например, этилового эфира ацетил-

L-фенилаланина)

химотрипсином

профлавином происходит

следующее. Связывание

субстрата

ферментом сопровождается

быстрым вытеснением некоторого количества профлавина

из

активного центра,

что

приводит

уменьшению

А465.

Когда обра-

зуется ацилфермент, равновесие

между

эфиром

профлавином

при

их

связывании ферментом смещается, приводя

полному

вытеснению профлавина. Поглощение остается постоянным

до

тех

пор,

пока

не

израсходуется весь эфир

и не

исчезнет ацил-

фермент.

Зная

количество вытесненного

на

первом этапе

про-

флавина, можно рассчитать константу диссоциации фермент-

субстратного комплекса,

а из

второй, экспоненциальной фазы

получить константу скорости ацилирования.

Метод вытеснения профлавина значительно более удобен,

чем использование соединений, содержащих фурилакрилоило-

вую

группу,

поскольку

нет

необходимости синтезировать специ-

альные субстраты;

при

работе

со

всеми субстратами можно

использовать одно легкодоступное соединение. Вообще говоря,

модифицированными субстратами

лучше

не

пользоваться

сов-

сем, поскольку

трудностям, связанным

химическим синтезом,

добавляются сомнения, правильно

ли эти

соединения идентифи-

цированы.

4. Деацилирование.

Отдельные неспецифические ацилфер-

менты можно синтезировать

хранить

их при

низком

рН 18—

11].

При

переходе

высоким

рН

ацилферменты деацилируются

со скоростью, ожидаемой исходя

из

данных

по

стационарной

кинетике.

Этот

подход

был

использован

для

изучения свойств

специфических ацилферментов.

При

инкубации производных

ацил-Ь-триптофана

среде

с рН 3—4

происходит накопление

ацилфермента.

рН

раствора можно очень резко изменить,

сме-

шав

его с

концентрированным буфером

высоким

рН в

кювете

спектрофотометра, применяемого

для

регистрации

методе

остановленной струи

[12, 13].

Константу скорости деацилирова-

ния

можно определить методом замещения профлавина

или

используя соединения, содержащие фурилакрилоиловую

группу.

Ацилферменты получают

и in

situ, смешав эфирный

субстрат,

218

ГЛАВА

содержащий нитрофенильную

группу,

с избытком фермента в

устройстве, применяющемся в методе остановленной струи [14].

Эти эксперименты показывают, что промежуточным соедине-

нием

в реакции гидролиза эфиров является ацилфермент, кото-

рый можно выделить при низких рН. Константа скорости де-

ацилирования ацилфермента имеет такое же значение, какое

было получено из данных по стационарной кинетике. Из опытов

по

изучению реакции ацилирования

следует,

что промежуточное

соединение образуется довольно быстро, в стехиометрическом

соотношении 1:1. Естественно, что ни в одном из этих экспери-

ментов не было показано, что ацилируется именно Ser-195.

Окончательно этот вопрос был решен лишь при рентгенострук-

турном анализе индолилакрилоил-химотрипсина (гл. 1) [15].

Вывод об участии в ацилировании

Ser-195

был подтвержден

классическим путем, состоящим в необратимом ингибировании

фермента эфирами фосфорной кислоты (например, диизопро-

пилфторфосфатом) с последующим выделением фосфатсодер-

жащего пептида после частичного гидролиза белка [16, 17].

2. Выявление ацилфермента при гидролизе эфиров

с помощью данных стационарной кинетики

В предыдущем разделе было показано, что кинетические

исследования с помощью метода оставленной струи

дают

воз-

можность обнаружить

накапливающиеся

промежуточные со-

единения.

Стационарная кинетика не позволяет прямо выявить

эти

соединения, она

дает

лишь косвенные данные. Окончатель-

ный

ответ на вопрос зависит от результатов прямых измерений с

привлечением данных предстационарной кинетики. Однако ста-

ционарная

кинетика позволяет выявить

ненакапливающиеся

промежуточные соединения и, основываясь на данных тех

эспериментов, когда накопление происходит, доказать их су-

ществование и выяснить природу.

Для выявления промежуточных соединений с помощью ста-

ционарной

кинетики необходимо, чтобы имело место накопление

а) промежуточного соединения, способного взаимодействовать

с акцептором (или желательнее с несколькими различными ак-

цепторами), концентрация которого (или которых) может изме-

няться;

б) общего для нескольких субстратов промежуточного

соединения Е—R, образуемого субстратами, каждый из которых

содержит фрагмент R; это промежуточное соединение должно

обладать способностью взаимодействовать с различными акцеп-

торами.

Гидролиз эфиров (и амидов), катализируемый химотрипси-

ном,

удовлетворяет обоим требованиям. Так, например, при

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

219

гидролизе n-нитрофенилового эфира ацетил-Ь-триптофана об-

разуется ацилфермент, реагирующий с различными аминами,

например с гидроксиламином, аланинамидом, гидразином и

т. д., а также с такими спиртами, как метанол, давая гидрокса-

мовую кислоту, дипептид, гидразид и метиловый эфир аце-

тил-Ь-триптофана соответственно. Аналогичный ацилфермент

образуется при гидролизе фенилового, метилового, этилового и

других

эфиров аминокислот (а также при гидролизе амидов).

Кинетические последствия, к которым приводит наличие общего

промежуточного соединения,

могут

быть использованы для вы-

явления

его присутствия.

Таблица

7.1

Значения

ca|

для катализируемого а-химотрипсином гидролиза

различных субстратов при рН 7,0 и 25 °С

Производное

cat.

мМ

Лимитирующая стадия

Производные

N-ацетила-триптофана

Амид

Этиловый

эфир

Метиловый

эфир

и-Нитрофениловый

эфир

0,026

7,3

0,1

0,002

Ацилирование

Деацилирование

Производные

Ы-ацетил-L

-фенилаланина

Амид

Этиловый

эфир

Метиловый

эфир

я-Нитрофениловый

эфир

0,039

0,09

0,15

0,02

Ацилирование

Деацилирование

Производные

N-бензоилглицина

Источник

данных

)

Этиловый

эфир

Метиловый

эфир

Изопропиловый

эфир

Изобутиловый

эфир

Холиновый

эфир

4-пиридинметиловый

эфир

п-Метоксифениловый

эфир

Фениловцй

эфир

n-Нитрофениловый

эфир

0,1

0,14

0,05

0,17

0,43

0,51

0,61

0,54

2,3

2,4

2,3

2,4

1,2

0,092

0,1

0,14

0,03

В основном ацилирова-

ние

То

же

Ацилирование

В основном ацилирова-

ние

Деацилирование

> 1—Zerner В., Bond R. P. M., Bender M. L., J Am. Chem. Soc, 86,

3674

(1964).

2 — Epand R. M..

Wilson

I. В., J. biol. Chem.. 238, 1718 (1963).

—Williams

A., Biochemystry, 9,

3383

(1970). (Данные приведены к рН 7,0 исходя

из

данных для рН 6,91 в предположении, что рК =6,8.)

220

ГЛАВА

а. Распад

общего

для

нескольких

субстратов

промежуточного

соединения

значения

Vmax

и k

Если

из нескольких субстратов образуется одно и то же

промежуточное соединение и если его распад является лимити-

рующей стадией процесса, то гидролиз

всех

этих субстратов

характеризуется одинаковой константой

Этот феномен,

обнаруженный Гутфройндом и Хаммондом в 1959 г. 118], на-

блюдался затем при исследовании многих серий эфирных суб-

стратов химотрипсина (табл. 7.1). Для слабо активированных

эфиров

величина k

t уменьшается до значения, меньшего k

поскольку стадия, характеризуемая константой k

, становится

частично лимитирующей [уравнение (7.1)]. В

случае

амидов

&cat очень мала и стадия с константой &

является полностью

лимитирующей.

Однако наличие одинаковой константы k

i для ряда суб-

стратов еще не доказывает того факта, что происходит накопле-

ние

общего ковалентного промежуточного соединения, распад

которого является лимитирующей стадией. Например,

для

гидролиза большого числа эфиров фосфорной кислоты, протека-

ющего с участием щелочной фосфатазы, одинакова [19, 20].

Объяснялось это тем, что лимитирующей стадией для

всех

ре-

акций

является гидролиз фосфорилфермента. Однако теперь

представляется более вероятным, что при щелочном рН дефос-

форилирование

происходит быстро [21], а лимитирующей ста-

дией является высвобождение неорганического фосфата из ком-

плекса фермент — продукт (E.Pi) [22, 23]. Наличие одинаковой

константы

&cat Д

ля всех

упомянутых реакций действительно

обусловлено образованием одного и того же промежуточного

соединения,

однако оно не является ковалентным.

б.

Распределение

промежуточного

соединения

между

конкурирующими

акцепторами

Если

образующееся промежуточное соединение может реа-

гировать с различными акцепторами, то для его обнаружения

можно использовать два подхода.

Первый

подход

состоит в определении соотношения, в кото-

ром образуются продукты. Например, гидролиз химотрипсином

серии

эфиров гиппуровой кислоты в растворе гидроксиламина

ведет

к образованию свободной гиппуровой кислоты и гиппу-

рилгидроксамовой кислоты в постоянном соотношении

(табл. 7.2). Неферментативный гидролиз в тех же условиях

приводит к разному соотношению

между

продуктами [24, 25].

*• RCONHOH

E+RCOOR'

—> RCO—Е — н,о (7.2)

*• RCOjfl