Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

221

Таблица

7.2

Соотношение

между

продуктами

катализируемого

а-химотрипсином

гидролиза

N-бензоилглициновых

эфиров

в 0,1 М растворе

гидроксиламина

[24, 25]

Эфир

Метиловый

Изопропиловый

Гомохолиновый

4-пиридинметило-

вый

Оксиаминолиз/Гидролиз

в присутствии

фермента

рй

6,6-6,8

0,37

0,38

0,37

в отсутствие

фермента

рН 12

0,99

0,29

1,73

3,03

Это четко указывает на наличие общего промежуточного соеди-

нения.

Второй подход состоит в измерении скорости образования

продуктов гидролиза определенного субстрата при разных кон-

центрациях акцептора. Это дает информацию о лимитирующей

стадии процесса и о природе промежуточного соединения.

Предположим, что лимитирующей стадией является образова-

ние

ацилфермента. В таком случае, поскольку акцептор реаги-

рует

с ацилферментом после лимитирующей стадии, он не может

увеличить скорость гидролиза эфира. Суммарная скорость об-

разования

продуктов

будет

такой, как показано на рис. 7.2. Если

лимитирующей стадией является гидролиз ацилфермента, то

акцептор

будет

увеличивать скорость этой реакции и, следова-

тельно, суммарную скорость образования продуктов (рис. 7.3).

Чтобы рассчитать кинетические параметры для распределе-

ния

промежуточного соединения, можно воспользоваться схе-

мой

(7.3) (для простоты предполагается, что нуклеофил N не

присоединяется к ферменту);

2°]

+ RCOOR'

E.RCOOR'

R'OH

RCO—Е

—

RCO

RCO-Л/

(7.3)

Применение

обычного подхода, используемого для реакций,

катализируемых химотрипсином [26], дает следующие выраже-

ния

ДЛЯ &cat И /См:

[Н

О]

+ fe

[Щ

(7.4)

222

ГЛАВА

-AcPheTMA

AcPhe

Ala NH

0,06 0,10

Рис.

7.2. Катализируемый химотрипсином гидролиз и реакции трансацилиро-

вания

n-триметиламмонийанилидацетилфенилаланина (AcPheTMA) в при-

сутствии

AlaNH

в различных концентрациях. Значения k

t для исчезнове-

ния

AcPheTMA и образования

AcPhe

и AcPheAlaNH

получены из уравнения

(7.3) при fe

0,504

с-

*з[

*°]

144 с

и ki

6340

c~'

[И].

800 -

4-00 -

200 -

0,02

9,04 0,06

[Ala№

],M

0,08

Рис.

7.3. Катализируемый химотрипсином гидролиз и реакции трансацилиро-

вания

метилового эфира ацетилфенилаланина (AcPheOMe) в присутствии

AlaNHz в различных концентрациях. Значения

для исчезновения

AcPheOMe и образования

AcPhe

AcPheAlaNbb

получены из уравнения (7.3)

при

2200

с-

, *з [HsO] = 144 с"

, k

6340

М->с-> [14].

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФГ.РМЕНТОВ

223

Для

реакции образования RCO

cat

для образования RCO-N

*cat

[N\

+ k'

[HjO] + k

[N]

(7.5)

(7.6)

Значение

kc^i/KtA для исчезновения RCO

R' получается де-

лением

суммы

двух

значений k

t [уравнения (7.5) и (7.6)] на

Км и равно kilKs. Напомним (гл. 3, разд. Е), что такое соотно-

шение

всегда справедливо для серии последовательных реакций,

следующих за стадией равновесного связывания. Это дает еще

один

способ выявления промежуточного соединения. Если реак-

ция

с участием нуклеофилов включает прямую атаку комплекса

Таблица

7.S

Кинетические константы для катализируемого

о-химотрипсином

гидролиза

эфиров N-ацил-Ь-аминокислот при 25 °С, рН 7,8

ионной

силе 0,1,

полученные

из опытов по

определению

соотношения

между

продуктами

реакции [27]

Ацил

Ацетил

Бензоил

Ацетил

Бензоил

Ацетил

Бензоил

Ацетил

Хлорацетил

Бензоил

Ацетил

Ac-L-Ala

Бензоил

Ацетил

Бензоил

Ac-L-Leu

Фуроил

Амино-

кислота

Gly

Cly

But

Ala

NVal

Val

NLeu

Phe

Tyr

Эфир

ОСНз

ос

ОСНз

ОС

ОСНз

ОС

ИЗО-ОСЗН7

ОСНз

ОС

ОСНз

ОС

ОСНз

*cat.

=-'

0,109

0,051

0,31

1,41

0,32

0,069

5,08

2,45

0,173

0,152

0,096

0,127

0,064

16,1

97,1

68,6

57,3

30,7

192

90,9

85,9

65,7

/С

мМ

862

445

4,24

66,7

1,41

5,97

14,3

0,85

87,7

110

177

4,17

5,37

0,93

1,85

0,296

0,0349

0.663

0,018

0,022

0,0192

0,417

*2.

С-1

0,49

0,094

0,42

8,81

0,41

0,069

35,6

4,16

0,98

0,55

0,178

0,32

0,09

103

796

265

176

45,8

5000

364

249

158

66,7

*з,

с-1

0,14

0,11

1,17

1,68

1,52

0,6

5,93

0,21

0,22

19,1

111

92,7

91,6

200

121

131

ИЗ

200

мМ

3380

823

5,78

417

1,79

5,97

100

1,45

500

398

327

108,8

5,84

34,4

7,63

7,14

0,909

0,0524

17,2

0,0728

0.0638

0,0461

0,56

224

ГЛАВА

Михаэлиса, как в реакции, представленной ниже,

ftcat/Ам

будет

функцией

концентрации N. Например, если

[Н

О]

—*•

RCO

E + RCOOR'

=<=*

E.RCOOR' —

[лг]

(7.7)

>- RCO-Л/,

то для исчезновения эфира

W*M

= (

+ k

[N])/K

(7.8)

[Ситуация, естественно, усложняется, если нуклеофилы связы-

ваются с ферментом и оба (и нуклеофил, и

субстрат)

конкури-

руют

за один центр.]

Увеличение скорости деацилирования при добавлении нукле-

офилов

использовалось для получения константы скорости де-

ацилирования

) в

случае

тех субстратов, для которых стадия

с константой k

обычно является лимитирующей.

1,4-бутанди-

ол — достаточно хороший нуклеофил, чтобы его присутствие да-

же в умеренной концентрации приводило к увеличению скорости

деацилирования до значения, большего чем k

[27]. Значения

некоторых констант скорости, полученных этим методом, приве-

дены в табл. 7.3.

Итак,

очевидно, что исследование соотношения

между

про-

дуктами является мощным методом обнаружения промежуточ-

ных соединений.

3. Выявление ацилфермента при гидролизе амидов

пептидов [14]

При

гидролизе амидов ацилфермент не накапливается и об-

наружить его довольно трудно. К счастью, для этого можно

воспользоваться методикой прямого обнаружения промежуточ-

ного соединения, применявшейся в

случае

эфирных субстратов.

Образование ацилфермента при гидролизе производных

ацетил-Ь-фенилаланина

(AcPhe) было установлено исходя из

следующих данных:

а. При гидролизе амидов в присутствии акцепторов-нукле-

офилов

получается такое же соотношение

между

продуктами,

как

и при гидролизе метилового эфира ацетил-Ь-фенилаланина

(AcPheOMe) в аналогичных условиях (табл. 7.4). Более того,

соотношение

между

продуктами оказалось таким же, какое

ожидалось исходя из прямого спектрофотометрического иссле-

дования

атаки нуклеофилами AcPhe-химотрипсина, генериро-

ванного in

situ

методом остановленной струи (табл. 7.5).

б. В условиях, когда более 94 % реагирующего амида обра-

зует

AcPhe-нуклеофил, скорость исчезновения амида практиче-

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ФЕРМЕНТОВ

225

Таблица

7.4

Соотношение

между

продуктами,

образующимися

ходе

катализируемого

6-химотрипсииом

гидролиза

субстратов

при рН = 9.3 и 25 °С (14)

Трансацилирование/Гидролнз,

М~

Субстрат

Акцептор

= А1аМНг

QlyNHj

H2NNH2

AcPhe-OMe

AcPhe—NH-

AcPhe-AlaNHj

-N

Таблица

2,2

1,8

—

Константы скорости для атаки

AcPhe-6-химотрипсина

нуклеофиламя

при рН 9,3 и 25 °С [141

Нуклеофил

AlaNH

GlyNH

H2NNH2

(Н

ft,

M-'c-

прямые

кинетические

измерения

4,8 • 10

1,5 • 10

3,3-10

142 с-

)

рассчитано

из

данных

по

соотно-

шению

между

продуктами

6,2 • 10

1,6-1Q

2,8 • 10

> Из

данных

табл.

7.4.

ски

не возрастает. Это согласуется с тем, что атака нуклеофила

происходит после лимитирующей стадии, т. е. после образова-

ния

промежуточного соединения, и что по крайней мере на 94%

реакция

идет через образование этого промежуточного соедине-

ния.

в. Последний довод в пользу образования в

ходе

реакции

ацилфермента дает расчет константы скорости реакции гидро-

лиза из константы скорости обратной реакции (синтез субстрата

через образование ацилфермента) и

уравнения

Холдейна

(гл. 3,

разд. 3). Установлено, что амины реагируют с ацилферментом с

образованием амидов и пептидов. Следовательно, согласно

принципу

детального равновесия, должна иметь место обратная

реакция

(гидролиз пептидов с образованием ацилфермента).

226

ГЛАВА 1

Вопрос состоит

в том,

достаточно

ли

высока скорость этой реак-

ции,

чтобы объяснить наблюдаемую скорость гидролиза.

На

этот

вопрос можно ответить, измерив (k

^t/KtA)s

для

реакции синте-

за пептида через стадию образования ацилфермента, определив

/Ceq

для

гидролиза этого пептида

затем рассчитав (k

i/Kn)H

для реакции гидролиза

из

уравнения Холдейна l/C

(&cat//(M)H/(&cat//CM)s].

Рассчитанное значение близко

к по-

лученному экспериментально.

4. Обоснованность выводов, полученных

при

исследовании распределения продуктов,

возможные источники ошибок

Ни

постоянство величины

x, ни

постоянство соотношения

между

образующимися продуктами

еще не

доказывают присут-

ствия промежуточного соединения. Например, оказалось,

что в

случае

щелочной фосфатазы постоянство значения

Vmax

являет-

ся

артефактом,

кроме того, нельзя сказать

priori,

что

атака

комплекса

Михаэлиса акцепторами также

не

даст

постоянного

соотношения

между

образующимися продуктами.

Для

того

что-

бы

из

указанных экспериментов можно было сделать четкий

вывод

наличии промежуточного соединения,

их

необходимо

связать

измерением скоростей.

При

измерении скоростей

рамках стационарной кинетики наиболее благоприятной являет-

ся

такая ситуация, когда промежуточное соединение накапли-

вается. Если выполняются уравнения

(7.4) —

(7.6), можно

сде-

лать четкий вывод

существовании промежуточного соедине-

ния.

Чрезвычайно полезно сочетание опытов

по

установлению

распределения продуктов

исследованиями предстационарной

кинетики

(как это

было сделано

случае

химотрипсина

и ами-

дов).

Возможным источником ошибок является нежелательное

из*

менение

свойств ферментов. Химотрипсин часто рассматривают

как

раствор имидазола

серина. Однако белки крайне чувстви-

тельны

окружению;

они

могут

неспецифически связывать

ор-

ганические молекулы

ионы, изменяя

при

этом свои кинетиче-

ские

свойства. Первое правило, которого

следует

придержи-

ваться

при

постановке экспериментов, состоит

том,

что

реакции

необходимо проводить

при

строго фиксированных, одинаковых

концентрациях

фермента. Многие белки склонны

агрегации,

что может привести

изменению констант скорости. Второе

правило гласит: соотношение

между

продуктами

следует

опре-

делять путем непосредственного анализа продуктов,

а не из

косвенных данных. Например, скорость атаки ацилфермента

бензоил-Туг-химотрипсина глицинамидом (GlyNH

) была

свое

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 227

время определена из данных по уменьшению fecat для гидролиза

6eH3Owi-Tyr-GlyNH

при добавлении GlyNH2.

(GlyNH

ингиби-

рует

эту реакцию, поскольку реагирует с ацилферментом с об-

разованием бeнзoил-Tyr-GlyNH2.) Как оказалось, присоедине-

ние

аминов к химотрипсину приводит к увеличению k

t на 30%

[14].

Это увеличение имеет тот же порядок величины, что и

ожидаемое уменьшение, обусловленное обращением реакции.

Вообще говоря, если изменения скорости ферментативных реак-

ций

невелики, эти данные нельзя считать надежными, поскольку

изменения

могут

быть обусловлены причинами кинетической

природы.

В ряде ситуаций простые правила распределения промежу-

точных соединений перестают выполняться. Если акцептор-нук-

леофил реагирует с ацилферментом до того, как успевает про-

изойти

диффузия уходящей группы от фермент-содержащего

промежуточного соединения, то распределение может зависеть

от природы уходящей группы (т. е. обусловливаться стериче-

ским

затруднением атаки и т. д.). Кроме того, измерение кон-

стант скорости атаки нуклеофилами промежуточного соедине-

ния

может привести к не совсем верным результатам вследствие

упоминавшихся выше эффектов неспецифического связывания.

В. Другие примеры обнаружения промежуточных

соединений

с помощью исследования распределения

продуктов и из кинетических данных

1, Щелочная фосфатаза

Почти

нет сомнения в том, что при гидролизе этим фермен-

том эфиров фосфорной кислоты образуется фосфорилфермент.

Фосфорилфермент

стабилен при низком рН и его можно выде-

лить [28, 29]. Исследование распределения продуктов с исполь-

зованием трис-буфера в качестве акцептора фосфата показало,

что соотношение

между

продуктами постоянно (табл. 7.6) [30,

31].

Результаты проведенных ранее кинетических исследований

должны оцениваться в свете последних данных, согласно кото-

рым выделенный фермент может содержать прочно, хотя и

нековалентно

связанный фосфат [32], а лимитирующей стадией

реакции

при высоком рН является высвобождение этого прочно

связанного

фосфата 122, 23] (правда, единого мнения относи-

тельно кинетики или стехиометрии связывания нет) [33,34]. Как

отмечалось выше, постоянство

Vmax

в реакциях гидролиза ши-

рокого круга эфиров фосфорной кислоты (табл. 7.7) [19, 20]

228

ГЛАВА

Таблица

7.6

Относительные значения

max

для катализируемого

щелочной фосфатазой гидролиза эфиров

фосфорной

кислоты [20]

Фосфат

5'АМР

Пирофосфат

З'АМР

АрАр

АТР

dATP

dGTP

UDP

6'UMP

'max

0,9

0.6

1,05

1,0

0,85

Фосфат

dCTP

Рибозо-5-фосфат

р-Глицерофосфат

Этаноламинфосфат

Глюкозо-1-фосфат

Глюкозо-6-фосфат

Гистидинфосфат

я-Нитрофенилфосфат

max

1,05

0,7

0,9

0,7

0,8

0,9

0,8

1,0

обусловлено, вероятно, тем, что лимитирующей стадией является

медленная диссоциация комплекса фермент — продукт.

НОСН

СН

—ОРОГ

НОСНг—С—NH

HOCH

—С—NH

НОСН

HOCHj

Трис [трис-(оксиме- О-фосфорил-трис

тил)-аминометан]

Таблица

7.7

Соотношение

между

продуктами

для катализируемого щелочной фосфатазой

гидролиза эфиров фосфорной кислоты

фосфоамидатов [30, 31]

Фосфат

Фенил

Крезил

Хлорфенил

га-грег-Бутил

фенил

п-Нитрофенил

о-Метокси-и-метилфенил

а-Нафтил

fl-Нафтил

п-Нитрофенил

Фосфоамидаты

Трансфосфорилиро-

вание/Гидролиз

)

1,42

1.41

1,38

1,37

1,40

1>40

1,2

1,1

Акцептор

трис;

рН 8.

) Акцептор=2

трис;

рН 8,2.

) Срецнее

для

нескольких фосфоамидатов.

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

229

2. Кислая фосфатаза

Реакция,

катализируемая кислой фосфатазой,— это простой

пример реакции с накоплением промежуточного фосфорилфер-

мента, распад которого является лимитирующей стадией. Ши-

рокий

круг эфиров гидролизуется кислой фосфатазой с одина-

ковым значением Vmax (табл. 7.8) [35], причем соотношение

Таблица

7.8

max

для

катализируемого

кислой

фосфатазой

предстательной

железы

гидролиза

эфиров

фосфорной

кислоты

при рН 5 и 37 °С [35]

Эфиры фосфорной

кислоты

Р-Глицерофосфат

2'AMP

Ацетилфосфат

З'АМР

п-Нитрофенилфосфат

'max

(относительная)

Таблица

7.9

Соотношение

между

продуктами

катализируемого

кислой

фосфатазой

предстательной

железы

гидролиза

эфиров

фосфорной

кислоты

[36]

Эфир

фосфорной

кислоты

я-Нитрофенилфосфат

Фенилфосфат

3'UMP

З'АМР

З-Глицерофосфат

Трансфосфорилирование/Гидролиз

Акцептор—

этанол

0,29

0,26

0,28

0,30

0,28

Акцептор—

этаноламиа

0,044

0,046

0,041

между продуктами остается постоянным (табл. 7.9); исследова-

ние

методом остановленной струи с использованием п-нитрофе-

нилфосфата показывает, что во время всплеска высвобождается

один моль n-нитрофенолята на субъединицу фермента; фермент

ковалентно модифицируется диизопропилфосфатом [36].

Быстро Медленно

Е—OH + ROPO3H ч=Ь Е—OH.ROPOgH -^- > Е—ОРО3Н ->

ROH

Е-ОН + Н

РО

-. (7.9)

230

ГЛАВА

3. Р-Галактозидаза: сохранение конфигурации

предполагаемого промежуточного соединения

Алкоголиз p-D-галактозидов р-галактозидазой происходит с

сохранением конфигурации у атома С-1 137, 38].

О—R

ROM

ОН

OR'

(7.Ю)

Тем самым из этого процесса исключаются простые реакции

бимолекулярного замещения (SN2), которые часто встречаются

органической химии, поскольку известно, что они всегда

идут

с обращением конфигурации [39].

А А

X® В • • • С—Y-+X—С • • • В+Y®

(7.11)

Сохранение конфигурации наблюдается всегда, когда имеют

место два последовательных обращения у данного углеродного

атома или если образуется промежуточный карбоний-ион, кото-

рый

может быть атакован нуклеофилом только с одной стороны.

Следовательно, сохранение конфигурации связано с наличием

многостадийной реакции, в

ходе

которой образуется промежу-

точное соединение. Согласно этому критерию, реакция с участи-

ем лизоцима также идет с образованием промежуточного со-

единения

[40, 41].

Данные,

полученные при исследовании соотношения

между

продуктами при гидролизе р-галактозидов, свидетельствуют в

пользу образования в

ходе

этой реакции промежуточного со-

единения

(табл.

7.10).

Из таблицы видно, что соотношение

между

водой и метанолом остается постоянным [42, 43]. Лими-

тирующей стадией в

случае

слабоактивированных субстратов

является образование промежуточного соединения, поскольку

Vmax

— величина переменная, а в

случае

сильноактивированных

динитросоединений

лимитирующей стадией становится гидролиз

этого промежуточного соединения, так как скорость остается