Новиков Д.К. (и др.). Медицинская микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

471

РАЗДЕЛ III. ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

ПО МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ПЕРЕЧЕНЬ ЗАДАНИЙ

Определить морфологию микроорганизмов (по готовым маз-

кам).

Определить морфологические и тинкториальные свойства

микроорганизмов (по готовым мазкам).

Приготовить мазок из агаровой культуры, окрасить по Граму.

Определить морфологические и тинкториальные свойства.

Произвести бактериоскопическое исследование гноя и

определить морфологию и тинкториальные свойства

имеющихся микроорганизмов.

Сделать посев исследуемого материала петлей на жидкую

и плотную питательные среды.

Выполнить 1 этап выделения чистой культуры, оценить

культуральные свойства по готовым посевам.

Произвести посев на косой агар с целью выделения чи-

стой культуры микроорганизмов.

Сделать посев исследуемого материала на чашку с МПА

сплошным газоном.

Сделать посев для определения биохимических свойств вы-

деленной культуры.

10.

Выполнить 1 этап бактериологического исследования ис-

пражнений больного при подозрении на дизентерию.

11.

Определить вид микроба по антигенным свойствам в реак-

ции агглютинации с адсорбированной агглютинирующей

сывороткой.

12.

Поставить и оценить ориентировочную реакцию агглюти-

нации для определения вида микроба.

13.

Оценить результаты РСК с целью определения антител в

сыворотке больного по демонстрационному ряду.

14.

Поставить реакцию преципитации для определения анти-

гена в ликворе больного.

15.

Оценить РПГА для определения наличия столбнячного ток-

сина в фильтрате исследуемого материала (по демонстраци-

онному материалу).

16.

Поставить РГА для индикации и титрования вируса. Оценить

реакцию по демонстрационному ряду.

17.

Поставить РТГА для определения типа вируса в аллантоис-

ной жидкости.

472

18.

Оценить РТГА в парных сыворотках больного с целью

серодиагностики вирусных инфекций.

19.

Поставить РПГА для определения титра антител в сыво-

ротке больного. Оценить реакцию по демонстрационному

ряду.

Определить титр антител в ИФА по демонстрационному ма-

териалу.

21.

Поставить опыт по определению чувствительности куль-

туры микроорганизмов к антибиотикам методом бумаж-

ных дисков. Оценить опыт по демонстрационным посе-

вам.

22.

Определить МПК (минимальной подавляющей концентра-

ции) антибиотика методом серийных разведений в бульоне

(по демонстрационному ряду).

23.

Среда Эндо.

24.

Среда Плоскирева.

25.

Среда Гисса.

26.

Среда Китта–Тароцци.

27.

Среда Ресселя.

28.

Среда Кесслера.

29.

Брюшнотифозный диагностикум.

30.

Эритроцитарный брюшнотифозный Vi-диагностикум.

31.

Агглютинирующая брюшнотифозная сыворотка.

32.

Люминесцирующая брюшнотифозная сыворотка.

473

1. Определить морфологию микроорганизмов (по готовым

мазкам).

Морфологию микроорганизмов определяют путем микроскопии

мазков в световом микроскопе с иммерсионной системой.

На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла,

помещают препарат на столик микроскопа и под контролем зрения

опускают иммерсионный объектив в масло. Макровинтом находят

поле зрения, затем микровинтом устанавливают четкость изображе-

ния. Изучают форму (кокки, палочки, спирохеты), размеры, располо-

жение микроорганизмов. В зависимости от способа окраски выявляют

дополнительные структуры (капсулу, споры, зерна волютина и т.д.).

2. Определить морфологические и тинкториальные свой-

ства микроорганизмов (по готовым мазкам).

Взять предметное стекло с готовым микропрепаратом,

окрашенным по Граму. Нанести на препарат каплю иммерсионно-

го масла. Провести микроскопию в световом микроскопе с увели-

чением объектива 90.

Определить форму микробных клеток и отношение к окрас-

ке по Граму.

3. Приготовить мазок из агаровой культуры, окрасить по

Граму. Определить морфологические и тинкториальные свой-

ства.

Стекло обезжиривают мылом, ограничивают стеклографом ме-

сто для нанесения мазка с обратной стороны от обезжиривания. Сте-

рильной бактериологической петлей на стекло наносят каплю физио-

логического раствора.

Пробирку с агаровой культурой бактерий берут в левую руку, а

петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени

горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из

пробирки ватную пробку, прижимая ее IV и V пальцами правой руки

к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в

пробирку со скошенным агаром, охлаждая петлю о внутреннюю по-

верхность, после чего легким скользящим движением берут материал.

Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и за-

крывают пробкой.

Петлей с культурой прикасаются к капле физиологического

раствора до появления легкого помутнения. Избыток культуры сжи-

гают в пламени спиртовки, после чего петлю охлаждают прикоснове-

нием к стеклу и равномерно распределяют каплю по стеклу в виде

круга. Мазок высушивают, фиксируют трехкратным проведением

препарата через пламя горелки. Окрашивают мазок по Граму: наносят

474

на фильтровальную бумагу, пропитанную карболово–спиртовым рас-

твором генцианового фиолетового, дистиллированную воду на 1–2

минуты, снимают фильтрованную бумагу, наносят раствор Люголя на

1–2 минуты, сливают его и наливают пипеткой этиловый спирт на 30

секунд. Тщательно промывают водой, докрашивают водным раство-

ром фуксина 1–2 минуты. Промывают и высушивают мазок. Грампо-

ложительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, гра-

мотрицательные – в красный.

4. Произвести бактериоскопическое исследование гноя и

определить морфологию и тинкториальные свойства имею-

щихся микроорганизмов.

Взять чистое предметное стекло, произвести обезжиривание

его натиранием кусочком сухого мыла, мыло со стекла тщательно

удалить с помощью ваты. Место мазка на стекле обозначить ка-

рандашом-стеклографом в виде овала в центре стекла площадью

примерно 1/3 предметного стекла. Овал начертить на стороне, об-

ратной обезжиренной.

Взять в правую руку бактериальную петлю, простерилизо-

вать в пламени горелки. В левую руку взять пробирку с гноем.

Мизинцем правой руки плотно захватить наружный конец ватной

пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынуть пробку

из пробирки. Обжечь край пробирки в пламени спиртовки. Опу-

стить петлю в пробирку, остудив о стенку, взять материал. Вынуть

петлю из пробирки. Быстро обжечь край пробирки и внутреннюю

часть пробки. Пробирку закрыть пробкой, поставить в штатив.

На предметное стекло в центр овала внести каплю гноя и

равномерно круговыми движениями распределить по всей площа-

ди овала. После этого петлю тотчас же, не выпуская из рук, про-

стерилизовать в пламени горелки.

Мазок высушить при комнатной температуре на воздухе или

в струе теплого воздуха над пламенем горелки.

Сухой мазок зафиксировать нагреванием на пламени горелки.

Стекло держать за край мазком вверх и 3 раза провести через сред-

нюю часть пламени.

Зафиксированный мазок окрасить по Граму (см. это в вопросе

№3).

На окрашенный препарат нанести каплю иммерсионного масла.

Провести микроскопию в световом микроскопе с увеличением объек-

тива 90.

Определить форму микробных клеток и отношение к окраске по

Граму.

475

5. Сделать посев исследуемого материала петлей на жид-

кую и плотную питательные среды.

Пробирку с исследуемым материалом берут в левую руку, а

петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени

горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из

пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки

к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в

пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким

скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из

пробирки, снова обжигают ее край и закрывают пробкой. Далее в

пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материа-

лом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообраз-

ным движением распределяют материал по скошенной поверхности

агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее проб-

кой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. От-

крывают пробирку с жидкой средой и вносят материал петлей в верх-

нюю часть жидкой среды. Пробирку закрывают как описано выше.

6. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры, оце-

нить культуральные свойства по готовым посевам.

Бактериологическую петлю стерилизуют в пламени спир-

товки (до ее покраснения). Над пламенем спиртовки открывают

пробирку с исследуемым материалом. Мизинцем и ладонной по-

верхностью правой кисти зажимают пробку и вынимают ее. Об-

жигают края пробирки и пробку, петлю держат как писчее перо.

Погружают петлю в исследуемый материал после ее охлаждения в

пробирке. Извлекают петлю материала, закрывают пробку над

пламенем спиртовки и ставят ее в штатив. Слегка открывают чаш-

ку Петри. Для разобщения микробных клеток материал распреде-

ляют петлей параллельными штрихами на обе половины чашки.

Закрытую чашку, дном кверху, помещают в термостат на 24 часа.

Оценку культуральных свойств проводят с учетом величины, пиг-

мента, формы, края колонии и консистенции колонии.

7. Произвести посев на косой агар с целью выделения чи-

стой культуры микроорганизмов.

Берут чашку Петри с МПА с ростом колоний. Отмечают на

дне чашки изолированную колонию. Стерилизуют бактериальную

петлю в пламени спиртовки. Левой рукой открывают чашку Пет-

ри, на бортике чашки охлаждают бактериальную петлю. Петлей

снимают часть отмеченной колонии, чашку Петри закрывают.

Берут в левую руку пробирку со скошенным агаром и ми-

зинцем правой руки плотно захватывают наружный конец ватной

476

пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынимают

пробку из пробирки. Обжигают край пробирки в пламени горелки.

Опускают петлю с взятой колонией бактерий до конденсационной

воды у дна пробирки и проводят зигзагообразную линию, скользя

петлей по поверхности агара от одного края пробирки к другому,

поднимая штрихи от конденсационной воды до верхней части ко-

сого агара. Вынимают петлю из пробирки. Быстро обжигают край

пробирки и внутреннюю часть пробки. Пробирку закрывают

пробкой. Прокаливают петлю в пламени и ставят ее в штатив. За-

сеянную пробирку подписывают, ставят в штатив, который поме-

щают в термостат.

8. Сделать посев исследуемого материала на чашку с МПА

сплошным газоном.

Один мл исследуемого материала набирают стерильной пипет-

кой и выливают в чашку Петри (слегка открыв ее). Легким покачива-

нием чашки распределяют материал по всей поверхности агара.

9. Сделать посев для определения биохимических свойств

выделенной культуры.

Чистую культуру с косого агара засевают петлей в среды «пест-

рого» ряда (пептонная вода, 1% раствор глюкозы, лактозы, сахарозы,

маннита, мальтозы, индикатор Андреде и поплавок для улавливания

газа) и МПБ. Для этого стерилизуют бактериологическую петлю (до

покраснения) в пламени спиртовки. В левой руке держат 2 пробирки

(первая - косой агар с чистой культурой, вторая - с одной из питатель-

ных сред). Вынимают пробки из пробирок мизинцем и ладонной по-

верхностью кисти над пламенем горелки. Петлю опускают в пробирку

с культурой, после ее остывания берут исследуемую культуру мето-

дом соскоба, извлекают из пробирки, вносят поочередно в среды

«пестрого» ряда и МПБ. В среду с МПБ после посева культуры поме-

щают индикаторные бумажки, смоченные щавелевой кислотой для

выявления индола и раствором уксуснокислого свинца для выявления

сероводорода, и закрепляют их у пробки.

10. Выполнить 1 этап бактериологического исследования

испражнений больного при подозрении на дизентерию.

Произвести посев испражнений петлей в чашку Петри с пи-

тательной средой Плоскирева (технику посева и состав среды см.

в вопросах №№6 и 24).

477

11. Определить вид микроба по антигенным свойствам в ре-

акции агглютинации с адсорбированной агглютинирующей сы-

вороткой.

Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На

одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида

натрия (контроль), а на другую – каплю сыворотки. Затем петлей в

каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры

и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получе-

ния равномерной взвеси. Реакция протекает быстро. Наблюдают за

появлением зерен агглютинации в пробах. Учет производят через 3-5

мин.

12. Поставить и оценить ориентировочную реакцию аг-

глютинации для определения вида микроба.

Берут предметное стекло, делят стеклографом на две части:

опытную (о) и контрольную (к). На опытную часть пастеровской

пипеткой наносят каплю агглютинирующей сыворотки в разведе-

нии 1:5, на контрольную – каплю физиологического раствора. За-

тем в каждой капле тщательно размешивают небольшое количе-

ство культуры бактерий до получения гомогенной взвеси. Бакте-

рии вносят прокаленной и остуженной бактериальной петлей.

Петля стерилизуется после каждой капли. Результат наблюдают

через 1-2 мин. Контрольная капля остается равномерно мутной. В

опытной капле в положительном случае наблюдается склеивание

бактерий в виде мелких зернышек.

После учета реакции предметное стекло опускают в стакан с

дезинфицирующим раствором.

13. Оценить результаты РСК с целью определения анти-

тел в сыворотке больного по демонстрационному ряду.

Взять ряд пробирок с разведениями сыворотки больного:

1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 и контролями гемолити-

ческой системы, антигена и комплемента.

Учет начать с контрольных пробирок. В пробирке контроля

гемолитической системы выявить отсутствие гемолиза, в контро-

лях антигена и комплемента – гемолиз. В опытных пробирках

определить отсутствие или наличие гемолиза.

При отсутствие гемолиза РСК положительная. При наличии

гемолиза РСК отрицательная. В положительном случае дать за-

ключение о наличии в сыворотке больного специфических анти-

тел и определить их титр, т.е. наибольшее разведение сыворотки

больного, при котором отсутствует гемолиз.

478

14. Поставить реакцию преципитации для определения

антигена в ликворе больного.

Взять пробирку и осторожно по стенке внести пастеровской

пипеткой около 0,5 мл преципитирующей менингококковой сыво-

ротки. Затем аккуратно наслоить на сыворотку такое же количе-

ство ликвора так, чтобы ликвор не смешивался с сывороткой, а

образовал над ней верхний слой. Пробирку поставить в штатив.

При положительном результате сразу на границе обеих жидкостей

образуется мутное кольцо преципитации.

15. Оценить РПГА для определения наличия столбнячного

токсина в фильтрате исследуемого материала (по демонстраци-

онному материалу).

Оценивают результаты РПГА по характеру осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция – осадок компактный в виде колечка с ров-

ными краями, «пуговица», положительная – характерный кружевной

осадок в виде зонтика. Титр токсина – предельное разведение филь-

трата, дающее положительный результат.

16. Поставить РГА для индикации и титрования вируса.

Оценить реакцию по демонстрационному ряду.

Постановка реакции гемагглютинации для индикации и титро-

вания вируса.

Разведения

1:5

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

Физ.раствор

0,8

0,4

Аллантоисная

жидкость

0,2

0,4

Взвесь эритроцитов

0,4

0.4

0,4

Результат

Заключение:

Максимальное разведение аллантоисной жидкости, еще дающее

гемагглютинацию (осадок в форме зонтика), принимается за титр ге-

магглютинирующего вируса.

17. Поставить РТГА для определения типа вируса в аллан-

тоисной жидкости.

Реакцию ставят по следующей схеме:

479

Ингредиенты разведения

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

1:320

Физ. раствор

0,2

Противогриппозная сыворотка А

(Н

) 1:5 титр сыворотки 1:320

0,2

Противогриппозная сыворотка А

) 1:5 титр сыворотки 1:320

0,2

Аллантоисная жидкость 4ГАЕ

0,2

Взвесь эритроцитов

0,4

Термостат 37

С 2 часа

Результат А (Н

)

Результат А (Н

)

Заключение:

Если торможение гемагглютинации (осадок в форме пуговицы

или кольца) пройдет до титра диагностической сыворотки или его по-

ловины, то вирус соответствует диагностической сыворотке.

18. Оценить РТГА в парных сыворотках больного с це-

лью серодиагностики вирусных инфекций.

Берут 2 ряда пробирок с разведениями сыворотки больного:

1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, К (контроль). Учет начинают с

контрольных пробирок, в которых должен быть осадок эритроци-

тов в виде «зонтика». Затем сравнивают результаты опытных про-

бирок с контролем. При наличии осадка эритроцитов в виде «пу-

говки» результат оценивается положительно, при наличии «зон-

тика» - отрицательно.

Определяют титры антител в двух рядах сыворотки и срав-

нивают.

Для серологического подтверждения вирусной инфекции

титр антител во II-й сыворотке, взятой в конце заболевания, дол-

жен возрасти не менее, чем в 4 раза по сравнению с I-й сыворот-

кой больного.

19. Поставить РПГА для определения титра антител в

сыворотке больного. Оценить реакцию по демонстрационному

ряду.

Используют стандартные антигенные эритроцитарные диагности-

кумы. В пробирках готовят последовательные разведения сыворотки

больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую

пробирку вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных ан-

тигеном эритроцитов (эритроцитарного диагностикума). Через 2 ч

инкубации при 37

С учитывают результат, оценивая внешний вид

480

осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательная реакция – оса-

док эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными

краями на дна лунки, положительная реакция – характерный кружев-

ной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

20. Определить титр антител в ИФА по демонстрационному

материалу.

Сначала оценивают контрольные пробы:

1. Отрицательная проба – лунка, в которой цвет пробы про-

зрачный со слегка желтоватым оттенком.

2. Положительная проба – лунка, в которой цвет среды ко-

ричневый.

После этого учитывают лунки, в которых находятся разведения

исследуемой сыворотки (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). За титр антител прини-

мают последнее разведение, в котором цвет пробы совпадает с цветом

положительной пробы.

21. Поставить опыт по определению чувствительности

культуры микроорганизмов к антибиотикам методом бумаж-

ных дисков. Оценить опыт по демонстрационным посевам.

Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на пи-

тательный агар в чашке Петри. Для этого извлекают из бумажной

упаковки стерильную пипетку, ее берут в правую руку. В левую руку

берут пробирку с 1 млрд взвесью бактериальной культуры, открывают

над спиртовкой пробку 4 –5 пальцами правой кисти. Набирают в пи-

петку 1 мл культуры, располагают пипетку горизонтально (чтобы

случайно не вылить содержимое на стол), обжигают края пробирки и

закрывают ее пробкой. Приоткрыв чашку Петри с МПА, выливают 1

мл культуры на агар. Чашку закрывают и распределяют культуру по

поверхности агара, оставляют на несколько минут (для всасывания

жидкости) на столе. Затем на поверхность питательной среды пинце-

том помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные

диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы

инкубируют при 37

С до следующего дня. По диаметру зон задержки

роста культуры судят об ее чувствительности к соответствующим ан-

тибиотикам. При зоне задержки роста диаметром 0-10 мм культура

расценивается как нечувствительная (устойчивая), диаметром 11–15

расценивается как малочувствительная, 16-25 мм – чувствительная,

больше 25 мм – высокочувствительная.

22. Определение МПК (минимальной подавляющей концен-

трации) антибиотика методом серийных разведений в бульоне (по

демонстрационному ряду).