Санагурський Д.І. Об’єкти біофізики: монографія

Подождите немного. Документ загружается.

361

Він виявив, що у хребетних та безхребетних тварин наявні

ГАМК- та L-глютаматні рецептори в низки йон-селективних

каналів. У хребетних тварин іонотропні ГАМК-рецептори

(ГАМК

) проникні для іонів Сl

, оскільки глютаматні

рецептори/канали, які підрозділяються на NMDA- та не-NMDA

типи, є проникними тільки для катіонів.

Електрофізіологічні дослідження на м’язових волокнах

сарани засвідчують наявність подібних двох типів іонних каналів,

які при використанні глютамату спричиняють кожну

деполяризацію (опосередковану при Н-рецепторах) волокон

(Т. Piek, 1985; H. Shinozaki, 1988). Під час експериментів на

кишковопорожнинних, зокрема, на абдомінальних м’язових

гангліях молюсків Aplisia califomica, було продемонстровано вплив

глютамату на нейрони та встановлено, що цей вплив зумовлюють

три різні шляхи: чітко виражена гіперполяризація, що

супроводжується транспортуванням іонів Сl

, сильна

деполяризація, причиною якої є провідність Na

, та менша

гіперполяризація у відповідь на провідність К

, що, очевидно,

служить ланкою зв’язку при G-білковому з’єднанні рецептора.

Подібні результати йонної відповіді були зареєстровані при

дослідженнях на нейронах Aplisia з використанням ГАМК

(M. Hollman et al., 1989; H. Luddens, W. Wisden, 1991). Отже,

йонотропні ГАМК- та глютаматні рецептори у хребетних

розміщені переважно в межах центральної нервової системи, тоді

як у безхребетних ці рецептори/канали наявні в обидвох “типах”

нервової системи та периферійній – у комах.

362

Вчені Дарлісон та Рош, продовжуючи вивчати

цейнапрямок, надавали перевагу експериментам з відомим опором

в комах класу циклодинів інсектицидів, які містять диелдрин,

ендрин та гептахлор-епоксид (R.H. Ffrench-Constant, R.T. Roush,

1991; G.M. Darlison, 1992). Складники були запропоновані при

вивченні дії ГАМК-рецептора, який є блокатором хлорних каналів.

У комах oпip до циклодієнів з’являвся на початку мутації

поодинокого гена. Явище це спостерігали i на інших об’єктах,

наприклад, фруктовій мусі, домашній мусі та м’ясна мусі.

3 вищесказаного можливий досить незвичний висновок,

який полягає у виявленні поліпептиду в молюсків та Drosophila

(розміри якого 54 500 та 60 600 Da відповідно) схожого у

послідовності та передбаченні вторинної структури до субодиниць

ГАМК

-рецепторів у мозку хребетних тварин. Структурно,

порядок Lymnaea більш схожий до β-субодиниці ГАМК

рецепторів у хребетних (49–52 % схожості), ніж до якихось інших

лігандних воріт хлорних каналів.

10.5. ²îííà ïðîíèêí³ñòü

ìåìáðàí òà ãåíåðóâàííÿ

ïîòåíö³àë³â ä³¿ ïðè çáóäëèâèõ

òà ãàëüì³âíèõ ñèíàïòè÷íèõ

ïðîöåñàõ ó íåéðîíàõ

áåçõðåáåòíèõ

У класичній серії досліджень Фетта і

Катца (P. Fatt, В. Katz, 1951; 1953) на нервово-м’язових синапсах

363

жаби та краба вивчали роль іонної проникності при синаптичному

передаванні. Вчені виявили, що струми, пов’язані зі збуджуючими

та гальмівними синаптичними впливами, генеруються в

постсинаптичній клітині завдяки змінам мембранної провідності.

Пізніше Екклс, Фетт та Кумс (Дж. Экклс, 1971; 1959; J. Coombs et al.,

1955) довели справедливість цих принципів для центральних

нейронів. Відомо, що у м’язових та нервових клітинах іонні канали

контролюються рецепторами, що знаходяться на зовнішній

поверхні постсинаптичної мембрани. Активування різних

рецепторів призводить до виникнення збуджуючих та гальмівних

постсинаптичних потенціалів (Э. Кэндел, 1980). Синаптичні

потенціали можуть супроводжуватися збільшенням або

зменшенням ioнної проникності. Збуджуючі постсинаптичні

потенціали зумовлюють деполяризацію та збудження завдяки

тому, що взаємодія медіатора з рецептором призводить до різкого

збільшення g

, а інколи i g

. Оскільки g

i g

зростають одночасно,

потенціал інвepciї для збудження становить –10 мВ (який є

приблизно середнім між натрієвим +55 мВ i калієвим –75 мВ)

(Э. Кэндел, 1980).

Дія гальмівних постсинаптичних потенціалів спричинена

тим, що вони заважають МП зони генерування підійти до порога

виникнення імпульсів. Такий ефект досягається за рахунок

збільшення мембранної провідності та гіперполяризації мембрани

(Э. Кэндел, 1980). В пре- та постсинаптичну зони гальмівний аксон

виділяє один i той самий медіатор – гама-аміномасляну кислоту,

яка зумовлює збільшення проникності для аніонів Сl

(A. Takeuchi,

364

N. Takeuchi, 1966). У синаптичних закінченнях збуджуючого

аксона збільшення g

СІ

знижує амплітуду пресинаптичних

імпульсів; одночасно вхід аніонів Сl

нейтралізує частину

позитивних зарядів, які переносять катіони Na

, чим дещо

зменшує деполяризацію i, можливо, знижує кількість вхідних іонів

Са

(Э. Кэндел, 1980). Пресинаптичне гальмування виявлено

також у нейронах центральної нервової системи ссавців, де воно

пов’язане з деполяризацією пресинаптичних закінчень, які

зменшують амплітуду ПД (Дж. Экклс, 1966). Унаслідок взаємодії

медіатора з рецептором різко збільшується проникність мембрани

для катіонів K

чи для аніонів Сl

(Э. Кэндел, 1980; Дж. Экклс, 1966;

A. Takeuchi, N. Takeuchi, 1966).

Отже, встановлено, що для епітеліально-м’язових клітин

ектодерми гідри характерна електрична активність у вигляді

періодичного генерування потенціалів дії, яке відбувається за

принципом “все або нічого”.

10.6. Äîñë³äæåííÿ åëåêòðè÷íèõ

ïîêàçíèê³â ã³äðè

Прісноводна гідра належить до типу

Hydrozooa, ряду Hydrida, роду Hydra, виду Hydra oligactis Pallas.

Гідра є зручним об’єктом для проведення біологічних досліджень

на клітинному рівні. Так, розміри клітин, особливості поведінки та

морфофізіологічні характеристики гідри, а також можливість

культивувати організм у лабораторних умовах, дають змогу

365

виконувати дослідження, використовуючи метод відведення

мембранного потенціалу спокою та електричної активності від

клітин за допомогою скляних мікроелектродів (М.Д. Бересткина и

др., 1987; А.В. Иванов и др.,1981; И.И. Канаев, 1952; А.Н. Липин,

1950; Э. Хадора, З.Венер 1989; E.M. Jonson, 1984; A.N. Spenser, W.E.

Schwab, 1980).

Для досліджень гідру відбирають з природних водойм із

проточною водою та культивують при температурі середовища

+18–20 °С. Окремо відбирають дорослих особин без стадії

брунькування віком до семи днів, яких використовують у

експериментах. За допомогою пастерівської піпетки поміщають

одну особину у чашки Петрі з оргскла (об’єм 7 см

), де є

інкубаційне середовище. Для адаптації та ліпшого прикріплення

гідри до дна чашки поміщають об’єкт за добу до експерименту.

Світловий режим підтримують за допомогою люмінесцентних

ламп. Аерацію середовища забезпечують шляхом сполучення

поверхні чашки з об’ємом акваріума, який підлягає інтенсивному

постачанню повітря. Висока чутливість гідри до забруднень сере-

довища, а саме: здатність до накопичення важких металів, її мор-

фологічні та фізіологічні показники дають можливість стежити за

змінами, що відбуваються під впливом факторів хімічного наван-

таження, порівняно з нормальним фізіологічним станом об’єкта

досліджень, за яким проводять контроль згідно з літературними

даними (М.Д. Бересткина и др., 1987; И.И. Канаев, 1952).

Відомо, що нервова система гідри має вигляд нервової

сітки, розгалуженої по всьому організму тварини (O. Koizumi,

366

H. Bode, 1991; O. Koizumi et al., 1990). Нервова сітка гідри стійкої

структури продукує та втрачає нейрони, які безперервно

утворюються в стовпчику тіла та сконцентровані у відділі шлунка

(M. Sakaguchi et al., 1996). На сьогоднішній день невідомо, чи

можливі синаптичні контакти між нервовими клітинами гідри та

якого вони типу. Однак, відповідно до даних П’єробона та співав.

(P. Pierobon et al., 1995) у мембранній фракції гомогенату клітин

Hydra vulgaris при хімічному стимулюванні виявлено ГАМК-

рецептори .

10.7. Âíóòð³øíüîêë³òèííå

â³äâåäåííÿ ìåìáðàííîãî

ïîòåíö³àëó ñïîêîþ òà

åëåêòðè÷íî¿ àêòèâíîñò³

åï³òåë³àëüíî-ì’ÿçîâèõ êë³òèí

åêòîäåðìè ã³äðè

Мікроелектрод вколюють у клітини

ектодерми гідри у ділянці підошви під бінокулярним мікроскопом.

Вимірювали МПС i електричну активність клітин

ектодерми за допомогою установки, схему якої зображено на рис.

10.1. Установку розміщують у заземленій камері (1). Для

уникнення механічних вібрацій металевий столик мікроскопа (2)

закріплюють до нижньої частини камери. Чашку Петрі місткістю

8 мл та діаметром 40 мм використовують для експериментальної

камери (3) з культуральним середовищем – розчином

Гольтфретера (4).

367

Рис. 10.1. Схема установки для дослідження електричної активності

клітин гідри:

1 – заземлена камера; 2 – столик мікроскопа; 3 –експериментальна камера;

4 – культуральне середовище; 5 – об’єкт досліджень; 6 – мікроелектрод; 7 – тримач;

8 – мікроманіпулятор; 9 – порівняльний електрод; 10, 11 – мікроелектродні підсилювачі;

12 – підсилювач-перетворювач; 13 – осцилограф С1-83; 14 – потенціометр із самописцем;

15 – перистальтична помпа; 16 – трубка перистальтичної помпи; 17 – колонки з

досліджуваними середовищами

Прикріплення об’єкта досліджень (5) підошвою до дна

експериментальної камери дає змогу вводити мікроелектрод (6).

Мікроелектрод являє собою мікропіпетку з скла “Пірекс” (діаметр

кінчика 0,5 мкм), яку наповнюють 3М КСl через фільтрувальну

насадку (діаметр пор 0,2 мкм). Oпip мікроелектрода становить 10 ±

2 МОм.

368

Закріплюють мікроелектрод у тримачі (7) мікромані-

пулятора (8) з пристроєм для переміщення мікроелектрода у трьох

взаємоперпендикулярних площинах, завдяки чому з’являється

змога підводити мікроелектрод з максимальною точністю до

клітин підошви гідри.

Як індиферентний електрод (9) використовують скляний

капіляр з агаровим містком, один кінець якого поміщають у

розчин експериментальної камери, а від іншого відводять трубку у

колбу з 3 М розчином КС1, де поміщений порівняльний електрод

від рН-метра, заповнений насиченим розчином КС1.

Мікроелектроди з’єднують відповідно до точок елект-ричної

схеми за допомогою хлор-срібного містка. Для підсилення

досліджуваних мембранних потенціалів засто-совують підсилювачі

(10, 11, 2), зібрані на базі інтегральних мікросхем К 544 УДІА за

принциповими схемами (И. Магура, 1981; Р. Первис, 1983).

Контролюють гене-рування ПЕА та зміни величини МП за

допомогою осцилографа С1-83 (13). Реєструють результати

експери-ментів на стрічках самописного потенціометра КСП-4

(14), або інших носіїв інформації.

Протоку культурального середовища під час дослідів

забезпечують зі швидістю 0,5 мл/хв за допомогою перистальтичної

помпи НП-1М (15), відвідну трубку (16) якої поміщають в

експериментальну камеру. Культуральне та досліджувані

середовища поміщають у колонки (17) місткістю 100 мл i

діаметром 30 мм. Виходи трубок від колонок також поміщають у

експериментальну камеру.

369

10.8. Åëåêòðîííî-

ì³êðîñêîï³÷íå äîñë³äæåííÿ

êë³òèí ã³äðè

Електронно-мікроскопічні дослідження

проводять за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа

ПЕМ-100. Фіксують зразки для електронно-мікроскопічних

досліджень за загальноприйнятими методиками (J.H. Luft, 1961;

E.S. Reynolds, 1963). Зрізи готують на ультрамікротомі УМТП-6 за

допомогою алмазного ножа; контрастують солями свинцю за

методикою Рейнольдса (E.S. Reynolds, 1963).

10.9. Åëåêòðè÷íà àêòèâí³ñòü

êë³òèí åêòîäåðìè Hydra

oligactis P. ó íîðì³

Досліджуючи епітеліально-м’язові та

нервові клітини представників класу Hydrozooa методом

внутрішньоклітинного відведення за допомогою скляних

мікроелектродів, виявили характерну складну електричну

активність у вигляді ПД та ПЕА, які відображають їхній діяльний

стан. Описано параметри спонтанної електричної активності

клітин ектодерми прісноводної гідри в умовах нормального

культурального середовища та доведено, що МПС клітин зазвичай

становить –38 ± 3,0 мВ. Важливу роль у процесі електричної

активності відіграють іонні механізми, які вивчені недостатньо.

Тому доцільним стало вияснення механізмів генерування

електричної активності клітин ектодерми прісноводної гідри

370

шляхом встановлення залежності параметрів клітин ектодерми за

умови нормального культурального середовища.

Для чіткого контролю та уникнення виходу мікроелектрода

з клітини ектодерми Hydra oligactis, що траплялось при

скоротливих рухах тулуба та щупалець гідри, точку для

внутрішньоклітинного відведення МП обирають близькою до

підошви. Оскільки на параметри електричної активності клітин

гідри впливають такі показники, як розміри організму, фаза

харчового циклу та ін. (R.D. Campball et al., 1976; A.N. Spenser,

W.E. Schwab, 1980) для стабільних записів електричної активності

відбирають особини з подібними характеристиками (И.И. Канаев,

1952). Під час введення мікроелектрода в клітину МПС становив –

27 ± 5 мВ, а через 5–10 хв стабілізувався на показнику від –38 до –

40 мВ, який залежав залежності від ступеня пошкодження

плазматичної мембрани клітини ектодерми при введені

мікроелектрода. Контрольними показниками вважають величину

МПС від -35 до –40 мВ.

З’ясовано, що специфічна електрична активність виникає

при скороченні епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри і

полягає у періодичному виникненні спонтанних короткотривалих

деполяризацій (відносно величини потенціалу спокою), які мають

ритмічну динаміку.

Виявлено, що під час ПЕА (рис. 10.2) при значеннях МП

вищих, ніж –38 мВ відбувалася деполяризація мембрани (рис. 10.2,

А), а при нижчих – така деполяризація не виникала (рис. 10.2, Б).

Потенціал спокою клітин ектодерми гідри становить у

середньому –37 мВ (n = 9). Перед початком пачки спайків