Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

(А) - UДР-глюкозо дегидрогеназа;

(В) - NАДР: l-гексонат дегидрогеназа;

(С) - l-гулоно-γ-лактон дегидрогеназа.

Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является ис-

пользование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от

исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с

использованием радиоактивных веществ проведены Ф.Ловусом с сотрудниками.

В отделенные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз,

меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов

выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его

активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки,

проростки кресс-салата, молодые побеги фасоли,

Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с

сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной

группы [272]. В ягодах земляники и побегах фасоли [217] исследовался

биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона.

Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в

предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных

Ф.Ловусом с

сотрудниками [308, 309, 310, 311, 312], суммированы в таблице 7.

Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках

кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому,

превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода.

Это дало возможность авторам предполагать, что образование l-АК из d-

глюкозы и d-галактозы идет

без разрыва углеродной цепи и без специфического

использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как

один из путей образования АК в растениях, включающий образование

фосфорилированных гексоз.

Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d-глю-

куронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой

экспозиции 97% метки было

сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что

возможно только при перестройке углеродного скелета [311].

Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды

земляники d-галактуроновой кислоты [304]. Данные эксперименты

подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК

предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь

в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения

специфического углеродного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В

нормальном процессе биосинтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным.

Таблица 7

Включение субстратов -

С в l-АК

Объект

Субстрат

Распределение меченого С в

молекуле АК, в % от общей ак-

тивности

Проростки кресс-

салата

d-глюкоза-1-

С 64

d-глюкоза-1-

С 65-70 7-8 2-8 14-19

Созревающие плоды d-глюкоза-2-

С 69-73 0-6 22-23 2-5

земляники d-глюкоза-6-

С 24 <1 1 2 73

d-глюкуронолактон-1-

- - - 97

d-галактоза-1-

С 45 - 8 6 - 41

Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из d-

глюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает

образование промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает

образование l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с

исходной уроновой кислотой или лактоном.

Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза

l-АК,

выдвинутое Ф.Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф.Ишервуда и

Л.Мапсона [282]. Так как экспериментальные доказательства в пользу

отсутствия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от

чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует

радиоактивное загрязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим

веществом авторы

считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть

образована следующим образом: d-глюкоза → 6-фосфо-d-глюконовая кислота →

3-окси-6-фосфо-d-глюконовая кислота → 3-окси-d-глюконовая кислота →

d-арабоаскорбиновая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по

первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую

также по первому углеродному

атому, так что действительная картина

превращения d-глюкозы в l-АК будет завуалирована.

В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза,

а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы

менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие

работы, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути

синтеза l-АК в

растениях, как предполагает Ф.Ловус [305], или один путь, включающий

инверсию углеродной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-

АК, как считает Ф.Ишервуд и др.

3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой,

дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот

Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее

в субклеточных

структурах во многом зависит от их функционального

состояния [195, 289] и от внешних условий [181, 273]. Обнаружение АК в тех

или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными

компартментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен

метаболитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации

биосинтеза АК в листьях ячменя

нами не только учитывались данные по

количественному распределению аскорбата [178], но и исследовалось

накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании

хлоропластных, митохондриальных и цитоплазматических рибосом в зеленых,

этиолированных и альбиносных листьях ячменя.

Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В.Соколовского,

Л.В.Лебедевой, Т.Б.Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного

материала

[172]. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали

стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом.

Цитоплазматические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации

15 мкг/мл [155], митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл) [185],

учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов [7].

Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели

альбиносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону.

Анализ содержания

АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной

пигментацией (рис.3) показал присутствие анализируемых кислот и в

альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и

средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма

АК. Таким образом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать

АК

и ее производные, несмотря на значительные нарушения структуры

некоторых клеточных органоидов.

Рис. 3. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней (1), средней (2) и нижней

альбиносной (3) частях мутантных листьев ячменя

Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой

ткани листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев

передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и

по межклетникам паренхимы даже в корни [169]. Исследования, выполненные

на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в

срезанных листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой

ткани в белую ни на свету, ни в темноте [14], хотя стоит учесть, что характер

расположения белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных

листьев

ячменя различный.

С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось

накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных

проростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние

их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев.

Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них

уровень

АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление [181].

Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб

светозависимого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по

степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного

выдерживання их в темноте (рис.4). После 48-часовой темновой экспозиции

проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК:

максимальное количество аскорбата обнаружено в

этиолированных проростках,

минимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от

уровня ее в этиолянтах.

Рис. 4. Действие света (33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) на содержание АК (1), ДАК (2)

и ДКГК (3) в 7-дневных зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в)

проростках ячменя, выдержанных 48 часов в темноте

Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во

всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был

неодинаков; если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то

у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и

19% соответственно.

Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по

степени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной

способностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется

новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования,

которых восстановленная форма АК обратимо окисляется до

дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней

приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты.

Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность

процессов в системе АК ↔ ДАК → ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету

уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК,

тогда

как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается

на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно

полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК

используется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный

уровень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше

определяемого.

Следует отметить, что если у этиолированных проростков на

свету количество ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно,

происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в

хлоропластах [286].

Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия

зеленых, этиолированных и альбиносных проростков и их способность

синтезировать АК на свету, можно было

бы связывать биосинтез аскорбата с

хлоропластами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали

проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в

этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у

альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так

как в этих условиях нарастало количество продуктов окисления

АК - ДАК и

ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных

стрептомицином, который взаимодействует с 30S-субъединицами 70S-рибосом.

Следовательно, светозависимое накопление АК может идти при ингибировании

хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в

метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур.

В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования

митохондриальных рибосом

на биосинтез АК, так как ранее при исследовании

количественной локализации АК в листьях ячменя было показано

светозависимое накопление АК во фракции, включающей митохондрии [178].

Ингибирование митохондриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом

(100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах

использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в

темноте. Нижние участки листьев

данных проростков, а также этиолированных

вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор

хлорамфеникола на свет (рис. 5).

У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на

134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень

светозависимого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным

возрастанием содержания окисленной формы. В этиолированных проростках,

также как и у зеленых, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК

тормозился, и только у альбиносов светозависимое

наколение АК не

ингибировалось хлорамфениколом. Таким образом, в присутствии

хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК

снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альби-

носных.

Рис. 5. Действие хлорамфеникола на содержание АК, ДАК и ДКГК в зеленых (а),

этиолированных (б) и альбиносных (в) листьях ячменя, находящихся на свету

(33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

). Проростки предварительно 48 часов выдерживались в темноте

Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы

митохондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов,

преимущественно высокомолекулярных [81]. Поэтому снижение уровня АК у

зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может

быть результатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков

на свету масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не

менялся, и

это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в

метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только

хлоропластных рибосом, но и митохондриальных.

Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых

проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в

этиолированных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя

синтезировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных

рибосом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и

этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что

фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс,

идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с

помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются

разной

скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью

субстратом процесса биосинтеза АК.

Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам

и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом [29], но

отношение к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у

цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если

митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то

цитоплазматические - цикдогексимидом [7],

угнетающим синтез белка. Действие

циклогексимида на светозависимое накопление АК проверялось в следующих

опытах (рис. 6).

Рис. 6. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в зеленых проростках ячменя

после 48 часов темноты (а) и 24 часов освещения (33 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) на воде (б)

и растворе циклогексимида (15 мкг/мл) (в)

Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой

он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с

низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное

выдерживание их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно

активно накапливают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков

после темноты освещалась на

воде (контроль), другая - на растворе

циклогексимида. В контрольном варианте уровень АК повысился более чем в 3

раза, в присутствии же циклогексимида светозависимое накопление АК было

полностью блокировано. Следовательно, в процессе биосинтеза АК в растениях

на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-

рибосомах цитоплазмы. Как говорилось выше, АК в растениях

может синтезироваться из глюкозы и

(с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не

изучен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза →

d-галактуроновая кислота → l-галактоновая кислота → l-галактоно-γ-лактон →

l-аскорбиновая кислота. По данным [327], восстановление метил-d-галактурона-

та

в l-галактоно-γ-лактон в системе in vitro идет при участии фермента,

локализованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК

требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в

митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК

глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и

гулонолактоноксидаза [74] соответственно (рис. 7). Для второго

фермента

показано [402], что в митохондриях эвглены его содержание составляет только

11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в ци-

тозоле. Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза

аскорбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез

глюкуронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез

гулонолактоноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она

синтезируется

на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в

этом случае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона.

В работе [178] показано, что при длительном освещении проростков ячменя

значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей

митохондрии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата

уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции [243], а в

темноте -

наоборот. Эти факты могут говорить об активном использовании АК в

митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза,

поэтому при отсутствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в

хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо

сформированным фотосинтетическим аппаратом понижается темновое дыхание

[161], количество АК увеличивается в митохондриях.

Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом

субстратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что

экзогенный субстрат -

глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК [103]. Если

же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые"

продукты фотосинтеза [125] или восстановитель - НАДРН+Н

фотосинтетического проис-

Рис. 7. Схема биосинтеза аскорбиновой кислоты (по А.Ленинжеру, 1985 г.)