Дурынина Е.П., Егоров В.С. Агрохимический анализ почв, растений, удобрений

Подождите немного. Документ загружается.

При необходимости сменить воду и повторить промывку. Электроды

протереть и поместить в раствор cpC

-= 3. Нажать кнопку ">0<".

Через 1.5-2 мин. записать приращение ЭДС системы в

растворе с рСцог = 3. Нажать кнопку ">0<

. Записать показания

мономера.

В контрольном растворе с

NOr

= 3 после калибровки

прибора на ЖКИ должно высветиться "36.0 + 4.2" или "36.6 + 4.2" при

анализе растений, или 35.0±4.2 при анализе почвы.

Приращение ЭДС при переходе от раствора с рСно,- = 4 к

раствору

= 3 или от раствора с

- 3 к раствору

рСцог-

2 должно составлять не менее 53 мВ при 25°С.

После калибровки прибора электроды ополаскивают в

дистиллированной воде и промокают фильтровальной бумагой. Затем

проводят определение в исследуемых растворах.

При перерывах в работе более I часа электроды хранят в

0.0001

н. растворе KNO

}

4.15. Определение углеводов, содержание в растениях,

классификация.

Углеводы являются основным продуктом фотосинтеза, на их

основе в процессе обмена веществ в растительном организме

формируются белки, жиры, нуклеиновые кислоты и другие

соединения. Углеводы - основной источник для аэробного и

анаэробного дыхания клеток; источник энергии для возобновления

вегетации. Обычно растение содержит большой набор разнообразных

углеводов. В процессе вегетации соотношение растворимых и

нерастворимых форм изменяется. В молодых растениях преобладают

моно-

и дисахариды, в период созревания увеличивается содержание

крахмала, целлюлозы, т.е. нерастворимых форм.

Содержание углеводов и их разнообразие определяются видом

растения, фазой развития и абиотическими факторами среды и

изменяются в широких пределах. Например, зерно пшеницы содержит

3 % растворимых углеводов и 70 % крахмала, в свекле - 20 %

растворимых углеводов (сахарозы), в картофеле - 20 % крахмала, а

волокно хлопчатника на 90 % состоит из целлюлозы.

Определение углеводов в растительной продукции позволяет:

а) установить закономерности обмена этих веществ при формировании

урожая, при созревании и хранении продукции; б) оценить качество

плодов, овощей, зеленой массы и возможность их технической

переработки, например, у сахарной свеклы, картофеля и др.; в) в

здравоохранении составить энергетический баланс, в зоотехнике

рассчитать пищевой рацион.

Принята следующая классификация углеводов:

Моносахариды Пописахориды

1-го

порядка

Пописахориды

2 1

порядка \

глюкоза Сахароза крахмал

фруктоза Мальтоза клетчатка

манноза Целлобиоза гемицеллюлоза

галактоза и т.д. Раффиноза пектиновые вещества

Моносахариды состоят из одной молекулы углевода, хорошо

растворимы в воде.

Полисахариды J-го порядка состоят из двух, а раффиноза из

трех молекул моносахаридов, соединенных между собой "

кислородным мостиком" (связь -О-), хорошо растворимы в воде.

Полисахариды 2-го порядка состоят из нескольких тысяч

молекул моносахаридов, в основном глюкозы, соединенных между

собой кислородными мостиками. Упаковка молекул осуществляется в

виде циклических цепей, например инулин, в виде ветвистой

структуры - крахмал, мицелляльных нитей - клетчатка. Клетчатка

нерастворима в воде, крахмал дает коллоидные растворы. Эти

углеводы обеспечивают механическую прочность клеточных стенок и

многих органов растений, формируют покровные ткани, обеспечивают

стабильность биохимического состава при обмене веществ в растениях

и хранении продукции.

Существуют количественные методы определения

моносахаридов: химические, поляриметрические. Определение

полисахаридов в растениях осуществляется теми же методами, но ,

прежде кислородная связь (-О-) этих соединений разрушается в

процессе кислотного гидролиза, а в почве этот процесс идет медленно ,

за счет гидролитических ферментов почвы или почвенной биоты.

4.16. Определение углеводов по методу Бертрана.

Принцип метода. Растворимые углеводы извлекаются из

растительного материала горячей дистиллированной водой. В одной

части фильтрата определяют моносахариды, в другой - после

гидролиза соляной кислотой - ди- и трисахариды, которые

распадаются при этом до глюкозы. Полученная в растворе смесь

простых углеводов называется "инвертированным сахаром".

Метод определения основан на способности моносахаридов,

содержащих альдегидную или кетонную группу восстанавливать

феллннгову жидкость. Последняя представляет собой смесь 1:1

щелочного раствора сегнетовой соли (калий, натрий виннокислый) н

сернокислой меди. При этом моносахариды окисляются до

соответствующих кислот, а окись меди восстанавливается до закиси

меди, которая выпадает в осадок красно-бурого цвета. Количество

осадка эквивалентно количеству углеводов.

Полисахариды не имеют альдегидных или кетонных

группировок, поэтому их количественное определение возможно

только после кислотного гидролиза до моносахаридов. Сахароза после

гидролиза образует молекулу глюкозы и фруктозы, а крахмал

распадается на несколько сотен молекул глюкозы.

При смешивании раствора сернокислой меди и щелочного

раствора сегнетовой соли идут реакции:

CuSOj

2 NaOH = Си(ОН)

+ NajS0

Н Н медный

ОН-С- COONo , О-С- COONo шкоголят

Си(ОН)

+ I -> Си сегнетовой

ОН-С- COOK

О-С- COOK соли

Н Н

Таким образом получают комплексное соединение окиси

меди, которая находится в растворе. Если в этот раствор добавить

испытуемый раствор моносахаридов, окись меди восстанав-ливается

до закиси меди, которая выпадает в осадок красно-бурого цвета.

/ О

[СиО] +CHjOH(CHOH)/: *Hfi =>Си/)

CHflH(CHOH)<COOH

Н закисная глюконовая

глюкоза медь кислота

Осадок закисной меди учитывается объемным методом. На

асбестовом фильтре в трубке Аллена осалок растворяют сернокислым

раствором железоаммиачных квасцов.

СщО

2FeJS0

)

HJO, = 2 CuS0

2Fe S0

Железо из трехвалентного переходит в двухвалентное, которое

затем оттитровывается раствором КМп0

, точно известной

нормальности.

Количество перманганата эквивалентно количеству меди,

которая выпала в осадок. Рассчитывают осадок меди в мг, а затем по

специальным таблицам Бертрана находят соответствующее количество

глюкозы в мг.

4.16.1.

Ход анализа.

На аналитических весах берут навеску воздушно-сухого

растительного материала 1 г ± 0.001 в химический стакан на ISO -200

мл.

Приливают цилиндром 125 мл горячей дистилированной

воды и ставят на водяную баню, предварительно нагретую до

80°

С.

Одновременно ставят контрольный стакан с водой, в него

погружают термометр.

Экстрагируют углеводы в течении 30 мин. при температуре

75-80° С, периодически перемешивая стеклянной палочкой с

резиновым наконечником. Палочка всегда находится в стакане.

Охлаждают суспензию до комнатной температуры и

осаждают белки. Для этого в надосадочную жидкость по каплям

приливают раствор уксуснокислого свинца. Каждую каплю энергично

размешивают. На осаждение белков расходуется около 0,5 мл

осадителя в зависимости от качества анализируемого материала.

Учитывают общее количество осадителя в каплях или в мл. Нельзя

допустить недостаток или избыток свинца. Полное осаждение или

созревание осадка белка проходит в течение 4 часов, лучше осадок

оставить на ночь.

Возможный избыток уксуснокислого свинца осадить 10%-

ным раствором NajS0

, прибавив его в тройном количестве по

отношению к израсходованному раствору свинца. Тщательно

перемешать суспензию в стакане. Оставить для созревания осадка.

6. Отфильтровать суспензию через бумажный складчатый

рыхлый фильтр и стеклянную воронку диаметром 8-10 см в мерную

колбу на 200 мл. Осадок полностью перенести на фильтр, промыть

содержимое стакана и осадок на фильтре малыми порциями горячей

дистиллированной воды. Охладить раствор, перемешать, довести до

метки и снова тщательно перемешать. Фильтрат прозрачный, окраска

от слабо-желтой до соломенно-желтой за счет растительных

пигментов.

Для следующих определений используются объемы:

200 мл фильтрата

20 мл 50 мл 50 мл

моносахариды сумма Сахаров небелковый азот

4.16.2. Определение моносахаридов.

В коническую колбу Эрленмейера на 100 мл с узким горлом

внести пипеткой 20 мл раствора CuS0

, добавить 20 мл раствора

сегнетовой соли, хорошо перемешать.

Добавить в колбу 20 мл испытуемого раствора углеводов,

перемешать. Последовательность внесения растворов и их

соотношение не менять! Поставить на горелку с асбестовой сеткой или

электроплитку, нагреть смесь, кипятить при слабом кипении 3 мин. по

песочным часам. На дне колбы образуется красно-бурый осадок закиси

меди.

Отфильтровать раствор в горячем состоянии через

асбестовый фильтр, помещенный в трубку Аллена, в большую колбу

Бунзена с помощью водоструйного или вакуумного насоса.

Промыть осадок закисной меди 7-8 раз малыми порциями

горячей дистиллированной воды и количественно перенести его на

фильтр. Осадок на фильтре должен быть покрыт водой, на воздухе не

оставлять!

Осадок, промытый, с трубкой Аллена перенести на малую,

приблизительно 250 мл, чистую колбу Бунзена.

6. Растворить осадок в трубке при выключенном иасосе

железоаммиачными квасцами (около 10-15 мл), приливая их в

коническую колбу, так как там могут быть следы закиси меди, а затем

вылить в трубку. Осторожно растворить осадок с помощью малой

стеклянной палочки. Содержимое трубки промыть 5-6 раз малыми

порциями горячей воды при включенном насосе.

Раствор и промывные воды в малой колбе Бунзена не

охлаждая, осторожно, при слабом перемешивании оттитровать

раствором перманганата 0.02 или 0.05 и. до слабо-розовой окраски.

4.16.3. Расчет.

I мл 0.1 н. КМп0

соответствует 6,36 мг Си.

а мл KMnOj соответствует Xмг Си

где:

а - объем перманганата (мл), пошедшего на титрование; X -

количество меди в осадке (мг).

По таблицам Бертрана находим:

Л"мг Си соответствует А мг глюкозы, а далее:

•

Р•100

содержание моносахаров [%] =

где:

А - мг глюкозы по таблицам Бертрана (стр. 107-109); Р -

разведение 200/20; Н - навеска воздушно-сухого вещества, г; 1000 -

пересчет мг в г.

4.17. Определение суммы Сахаров растворимых углеводов

Взять 50 мл фильтрата в мерную колбу на 100 мл, прилить

цилиндром 5 мл конц. НО и поставить на водяную баню,

предварительно нагретую до 80°С. В контрольную колбу налить 50 мл

воды и

мл кислоты, опустить термометр, поставить в баню.

Гидролиз Сахаров проводят в бане при постоянном

помешивании при температуре 68-70° С в течении 5 мин. по песочным

часам.

Охладить раствор, добавить 2-3 капли фенолфталеина, далее

нейтрализовать его малыми порциями сухой соды, используя объем «

100 мг на кончике скальпеля (до слабо розовой окраски). Каждую

порцию соды тщательно перемешивают круговым движением колбы

не отрывая ее донышко от стола. Не допускать бурного вспенивания

раствора. Довести раствор до метки водой, тщательно перемешать.

Использовать раствор для определения суммы Сахаров. Так

как в растворе после гидролиза находятся только моносахариды,

определение ведем по той прописи, которая приводится выше.

•

Р•100

Содержание суммы Сахаров [%] , где:

В - мг глюкозы по табл. Бертрана

(стр.

107-109); Р - разведение

„ (200 ШЛ

р =i 1»" "

на

»еска воздушно-сухого материала, г.

Далее можно рассчитать содержание непосредственно

дисахаридов:

% дисахаридов = (% суммы Сахаров - % моносахаридов)

•

0.95

(0.95 - поправочный коэффициент, так как одна молекула сахарозы

дает при гидролизе 0.95 молекулы глюкозы).

4.18. Определение небелкового азота.

Суммарное количество небелкового азота в растительном

материале удобно определять из одной навески с углеводами. При

таком ходе анализа обеспечивается достаточно высокая точность

определения.

50 мл фильтрата помещаем в колбу Кьельдаля с широким

горлом, упариваем до 5-7 мл на электроплитке, охлаждаем.

Приливаем в колбу Кьельдаля 7 мл концентрированной

серной кислоты и озоляем раствор до бесцветного состояния. Обычно

катализатор не добавляют.

Содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят в

отгонный аппарат и проводят определение на микрокьельдале или

переносят в соответствующую мерную колбу и проводят

колориметрическое определение аммиачного азота с реактивом

Несслера (см. стр. 18-19). '

4.18.1.

Реактивы.

4%-ный раствор (CHiCOOhPb.

10%-ный раствор NajS0

НС1

концентрированная (плотность -

1.12).

Натрий углекислый (сода) NaJ20

•

HjD.

Фенолфталеин.

4%-й раствор CuS0

Щелочной раствор сегнетовой соли CjH&gKNa

•

4HjO.

Железоаммиачные квасцы.

Раствор КМп0

0,02 н.; готовится из фиксанала.

• Приготовление реактивов см. стр. 218, 219 "Практикум по

агрохимии", 1989 или на стр 110-111 данного пособия

4.19. Определение растворимых углеводов фотометрически с

пикриновой кислотой

Моносахариды, имеющие альдегидную или кетонную

группировку, могут восстанавливать динитросоединения, при этом

образуются интенсивно окрашенные соединения. Окраска

пропорциональна количеству углеводов в реакции, поэтому возможно

их колориметрическое определение.

Используют реакцию восстановления пикриновой кислоты

(2,4,6-тринитрофенола) в пикрамииовую.

ОН ОН

// \

, О N0

I 11+ CH/JHfCHOHJjC -» I 11+ CHfiH(CHOH)jCOOH

И / * H \\ /

NOj глюкоза NOj глюкуроновая

пикраииновая кислота

пикриновая кислота кислота

окраска желтая окраска красная

Таким методом можно определять глюкозу, фруктозу,

маннозу, галактозу, ксилозу, арабинозу. Дисахариды - сахароза,

целлобиоза, лактоза, мальтоза - определяются после кислотного

гидролиза; определение крахмала и некоторых других полисахаридов

можно проводить после слабого кислотного гидролиза.

4.19.1.

Ход работы.

Для экстракции растворимых углеводов взять навеску 0.1-

0.5+0.0001 г воздушно-сухого растительного материала. Перенести в

стакан емкостью 100 мл и залить 50 мл дистиллированной воды.

Содержимое стакана тщательно перемешать стеклянной

палочкой и поставить в водяную баню. Если материал не содержит

крахмала, то экстракцию углеводов ведут в течение 30 мин при 70°С.

При наличии крахмала (зерно, клубни) экстракцию ведут при 40 - 50°С

в течение

часа.

После экстракции углеводов провести в растворе осаждение

белков. Полного осаждения белков для определения углеводов не

требуется, но необходимо, чтобы раствор не содержал

опалисшруюших компонентов. Для этого при анализе зерна и зеленых

частей растений в стакан с экстрактом углеводов прилить 0.7 мл 10 %-

го уксуснокислого свинца, при анализе корнеклубнеплодов - 0.3 - 0.4

мл 10%-го уксуснокислого свинца, тщательно перемешать и оставить

на 20 мин. для созревания осадка.

Профильтровать раствор через сухой фильтр средней

плотности в мерную колбу на 100 мл, можно фильтровать в колбы на

200 мл, если ожидается высокое содержание углеводов.

4.19.2. Определение моносахаридов.

В сухие химические пробирки емкостью 20 - 40 мл берут

микропипеткой 1-3 мл фильтрата, содержащего от 0.2 до 0.3 мг

редуцирующих Сахаров. Если количество фильтрата менее 3 мл, то до

этого объема доводят дистиллированной водой.

В пробирку прилить 3 мл пикриновой кислоты и 3 мл 20%-

го раствора соды (соотношение компонентов

1:1:1),

закрыть пробкой,

тщательно перемешать.

Открыть пробку и поставить пробирку в кипящую водяную

баню на 30 мин. Уровень воды должен быть не ниже 2/3 высоты

объема смеси в пробирках. Для установки пробирок в баню

использовать пластмассовый или металлический штатив.

Через 30 мин пробирки вынимают и охлаждают. Затем

содержимое пробирок через воронку без фильтра переносят в мерные

колбы на 50 мл, ополаскивая несколько раз пробирки

дистиллированной водой. Содержимое колбочек доводят до метки

дистиллированной водой, раствор перемешивают и колориметрируют

при 490 нм.

Холостое определение проводят одновременно. В стакан на

100 мл приливают 50 мл дистиллированной воды, добавляют в него 0.7

мл уксуснокислого свинца. Содержимое стакана переносят в мерную

колбу на 100 мл, доводят до метки. Из колбы берут 3 мл раствора в

пробирку, прибавляют 3 мл пикриновой кислоты и 3 мл 20%-го

раствора соды, перемешивают, выдерживают 30 мин в кипящей

водяной бане. Охлаждают и переносят в мерную колбу на 50 мл.

Раствор, полученный таким образом, используют как раствор

сравнения при колориметрировании.

4.19.3. Расчет.

Р•100

Содержание моносахаридов [%} = —

где:

С - количество глюкозы по графику, мг; Р - разведение (100/3); Н -

навеска воздушно-сухого материала, г.

4.19.4.

Определение суммы Сахаров.

В сухие пробирки микропипеткой взять по

мл фильтрата и

прибавить 0.5 мл 10 %-го раствора HCL Поставить штативы в

кипящую водяную баню на 5 мин. для гидролиза дисахаров.

После гидролиза содержимое пробирок охладить, прибавить

0.5 мл 20 %-го раствора соды для нейтрализации соляной кислоты.

Добавить в пробирку 3 мл пикриновой кислоты,

перемешать, прилить 3 мл 20 %-го раствора соды, тщательно

перемешать.

Поставить пробирку в кипящую водяную баню на 30 мин.,

охладить. Через воронку без фильтра перенести в мерную колбу на 50

мл.

Провести колориметрическое определение моносахаридов.

Сумма Сахаров рассчитывается по формуле приведенной

выше.

Количество днеахаров определяется по разнице:

дисахара % = (% Сахаров -% моносахаров)

•

0.95

(0.95 - коэффициент пересчета глюкозы в дисахара).

4.19.5. Приготовление шкалы стандартных растворов

1 г просушенной в течении 2 часов при температуре 60-70° С глюкозы

растворяем в 1 л дистиллированной воды. Для построения графика

набирают в пробирки 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4; Кб; 1.8; 2.0; 2.2; 2.4;

2.6 мл стандартного раствора, доводят до 3 мл водой и далее

поступают так же, как и в случае определения моносахаридов. При

построении графика и при определении углеводов сравнение ведут по

раствору, содержащему все реактивы, прибавляемые к 3 мл воды.

4.19.6.

Приготовление реактивов.

Насыщенный раствор пикриновой кислоты: 20-30 г

пикриновой кислоты заливают примерно 500 мл воды. Тщательно

перемешивают в течение 5-10 мин. Для работы из этого объема

отфильтровывают необходимое количество надосадочной жидкости, а

в исходный раствор периодически доливают воды до тех пор, пока на

дне есть осадок. Раствор в склянке из темного стекла может храниться

неопределенно долго.

20 %-ный раствор соды (Na/OOi). После растворения соды

раствор необходимо профильтровать. 200 г соды растворяют в 800 мл

дистиллированной воды.

3.10 %-ный раствор НО. 236.8 мл конц.

НС1

(плотность -1.19)

вливают в

л мерную колбу, предварительно налив туда 500 мл воды,

доводят до метки.

4.20.

Определение крахмала в зерне на поляриметре

по

Эверсу.

Крахмал - углевод, входящий в группу полисахаридов второго

порядка, представляют собой вещество с большим молекулярным