Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

LAL = профермент

эндотоксин

-» активированный^

—

е)

фермент(ы)

активированные ферменты

коагулоген

Хизат * белковые агрегаты

помутнение

определение

вязкости

визуальная

оценка (тест

на гелеобра—'

зование)

определение

светорассеяния

спектрофото-

метрия

определение белка

методы оценки

Фосфолипидный слой имеет внешний и внутренний "листки",

из которых внешний содержит значительную долю липополисаха-

ридных молекул. В целом этот слой имеет жидкостно-мозаичную

структуру, содержащую набор из 3 — 4 мажорных белков, погру-

женных в фосфолипидный матрикс, и на долю которых приходится

до 70% всех белков наружного слоя, а также набор из 10 — 20

минорных белков. С фосфолипидным слоем (его внутренним

листком) нековалентно связан липопротеин из третьего слоя.

Липопротеиновый слой выступает как бы посредником, неко-

валентно связывающим наружный слой с пептидогликаном. Он

включает жирные кислоты, аминокислоты, глицерин; молекуляр-

ная масса его порядка 7 кДа. Так липопротеин клеточной стенки

Escherichia coli содержит 15 аминокислот в разной повторности

(всего 58 аминокислотных остатков), среди которых не обнаруже-

ны гистидин, глицин, пролин, триптофан и фенилаланин. Он

представляется в виде блочной структуры, на конце которой

имеется глицерил-цистеин, этерифицированный остатками жир-

ных кислот. Значительная часть такого липопротеина (4,8»

мо-

лекул на клетку) находится в свободном состоянии, меньшая часть

(2,4^10°) ковалентно связана с пептидогликаном (с диаминопиме-

линовой кислотой в тетрапептиде муреинового "каркаса").

Белки клеточной стенки отличаются от белков клеточной мем-

браны. Ранее упомянутые белки-порины образуют трансмембран-

ные диффузионные каналы для прохождения неспецифических

малых гидрофильных молекул, некоторые из них выступают ре-

цепторами фагов. Выделяют мажорные, или omp-протеины (от

англ. one of major protein), и минорные, или малые протеины. По

кодирующим структурным генам мажорные белки подразделяют

на отр А, отр С, отр F, отр Н:1°; они имеют различную

молекулярную массу (от 16 кДа до 42 кДа). Первый из них (отр

А) выступает местом взаимодействия с F-пилями при конъюгации

бактерий; отр С и отр F (белки-порины) в комплексе с пептидо-

гликаном формируют поры, отр Н:1° обладает катионными свой-

ствами и причастен к ионным взаимодействиям в среде обитания

клетки. Минорные белки участвуют в транспорте специфических

малых молекул через наружный слой и в рецепции фагов, некото-

рых бактериоцинов (например, рецептор для фага Т6 и колицина

"заинтересован" в транспорте нуклеозидов). Минорные белки

вовлекаются в транспорт мальтозы, комплексов Fe

, витамина Bi2.

Белки внешнего слоя выполняют и некоторые другие функции.

Среди протеинов клеточной стенки грамотрицательных бакте-

рий обнаруживаются многие ферменты (аспарагиназа, фосфатазы,

эндонуклеаза и др.).

Клеточную стенку удается достаточно легко отделить от содер-

жимого клетки, окруженного клеточной мембраной (протоп-

ласт).

Если часть клеточной стенки каким-то образом удержива-

ется на клеточной мембране, то в этом случае говорят о с ф е -

ропласте. Имеются разноплановые мнения о легкости

формирования протопластов у грамположительных или, напротив,

у грамотрицательных бактерий. Очевидно, и протопласты и сфе-

ропласты могут быть дериватами тех и других бактерий — все

зависит от особенностей штамма (вид, возраст, условия культиви-

рования, используемый стабилизатор — сахароза или какие-либо

соли, и т. д.), воздействующего агента (лизирующий клеточную

стенку фермент, блокатор биосинтеза компонента или компонен-

тов клеточной стенки).

Между клеточной стенкой и клеточной мембраной имеется так

называемое периплазматическое пространст-

в о, лучше выявляемое у грамотрицательных бактерий. Это оче-

видно связано с тем, что внутреннее осмотическое давление выше

у грамположительных бактерий [(8,1 - 20,2)»

Па], чем у грамот-

рицательных

[(3,03-

5,05)»10

Па].

периплазматическомпростран-

стве обнаружены ферментные и неферментные белки.

Известны прокариоты, оболочки которых существенно отли-

чаются по составу от оболочек грамположительных и грамотрица-

тельных бактерий. В качестве примера можно назвать кислото-

устойчивые микобактерии (таблица 7). Из таблицы видно, что

Таблица 7 Компонентный состав оболочек грамположительных, грамот-

рицательных и кислотоустойчивых бактерий

Бактерии

грамположительные

Пептидогликан

(многослоен, толщина

0,02-0,6

мкм)

Протеины

Липотейхоевые кислоты

Тейхоевые кислоты

Тейхуроновые кислоты

Полисахариды

кислотоустойчивые

Пептидогликан

(однослоен!?, толщина

0,01 мкм)

Полипептиды

Миколовая кислота - '

гликолипиды

Арабиногалактаны

Воск Д

Корд-фактор

Сульфолипиды

Микозиды

грамотрицательные

Пептидогликан

(однослоен, толщина

0, 01 мкм)

Липопротеины

Фосфолипиды

Липополисахарид

Протеины

Полисахариды

различия в компонентном составе клеток, относящихся к разным

группам, достаточно велики. Например, оценивая строение пепти-

догликанов у

Е.

coli и Staphylococcus aureus, можно видеть различия

между ними в характере интерпептидных мостиков. Так, у Е. coli

(равно как и у всех грамотрицательных бактерий, коринебактерий

дифтерии, нокардий, микобактерий и видов, относящихся к роду

Bacillus) пептидогликан относится к типу А (рис. 25а), у

Staphylococcus aureus (стрептококков, микрококков) — к типу В

(рис.

256); пептидогликан типа С (рис. 25в) обнаруживается редко.

EZ3—

—I М 1 1г I—

Рис. 25 Схемы (а, б, в), построения трех типов пептидогликанов (А, В, С) в которых

М—N-ацетилмурамовая кислота, Г—N-ацетилглюкозамин;

1,2,3,4-тетрапептид,

со-

стоящий из L-аланина (1), D-iso-глутаминовой кислоты (2), meso-DAP (или

L-лизина)

(3),

D-аланина

(4),

х и z-интерпептидные мостики, У-амидный заместитель, связанный

с а-карбоксигруппой D-iso-глутаминовой или 3-гидроксиглутаминовой кислоты.

Инвариантность тетрапептида обусловлена постоянным нали-

чием D-аланина, выступающего связующей единицей между цепя-

ми пептидогликана. Дисахаридные блоки МГ (см. рис. 25а, б, в)

численно варьируют от менее 10 до более 170, что зависит от вида

бактерий. С учетом сказанного можно изобразить связь пептидо-

гликана с липопротеином в клеточной стенке Е. coli (рис. 26).

Рис.

26. фрагмент пептидогликана Е. coli, связанный с липопротеином через

meso-DAP в тетрапептиде (обозначения смотри на рис. 25).

Углеводные звенья в пептидогликанах могут быть различными.

Например, имеются О-ацетильные группы в мурамовой кислоте

или глюкозамине, в эндоспорах бацилл может присутствовать

лактам мурамовой кислоты.

гпиколилмурамовая кислота,

где R - гпиколил

лактам мурамовой кислоты

сн

он

сн

—сн—со

мамнозамим мурамовой кислоты

Находят (около 2%) маннозамин мурамовой кислоты, например

у М. luteus. У микобактерий и некоторых нокардий (N. kirovani)

присутствует N-гликолилмурамовая кислота. В позиции С6 гидро-

ксильных групп мурамовой кислоты или глюкозамина могут нахо-

диться фосфодиэфирные остатки, которые у грамположительных

бактерий способны связывать тейхоевую, тейхуроновую кислоты,

он

но-р-о-сн,-сн-сн-сн-сн,-с

•р-о-сн,-сн-сн-сн-сн,-о

р-о-сн

-сн-сн-сн-сн,он

"%?

CH-NH,

сн.

он

III

OR О О

"со"

CH-NH

сн.

он

I I I

о_^о

со

CH-NH,

сн,

рибиттейхоевая кислота Вас. subtilis, R - остаток глюкозы (Р)

соон

сн

он

NHCOCH

а также другие полисахариды. С полисахаридами клеточных стенок

у микобактерий и некоторых нокардий связаны эфирной связью

миколовые кислоты. Они же могут быть компонентами свободно

экстрагируемых гликоли-

пидов, известных как к о

рд-факторы (от англ.

cord — веревка, струна),

которые выявлены также

у некислотостойких пато-

генных для человека ко-

ринебактерий. Число уг-

леродных атомов в кори-

немиколовых кислотах

достигает 32 — 36, в но-

кардиомиколовых кисло-

тах примерно 50, в мико-

ловых кислотах микобак-

терий порядка 90. Мико-

ловые кислоты являются а-замещенными Р-гидроксижирными

кислотами с общей формулой:

R-CH(OH)-CH(Ri)-COOH

теихуроновая кислота из

клеточных стенок бацилл

4 т. 8524

Различают а-, (3-

у-миколовые кислоты туберкулезных мико-

бактерий; первые содержат от 78 до 88 углеродных атомов, вторые

— от 83 до 89, третьи — 91.

-(CH,)-CH-CH-(CH,)

-CH-CH-(CH,)-CH-CH-COOH

\/ I I

сн

он

а-миколовая кислота

ск-(сн ) -сн-сн-(сн

) -сн-сн-(сн

) -сн-сн-соон

I I \ /

I I

СН3ОСН3

СН

ОН

р-миколовая кислота

сНз-(сн

)

- сн-(сн

)

-со-сн-(сн

-сн-сн-соон

СН

ОН

у-миколовая кислота

Корд-факторы представляют собой 6,6'-димиколиловые эфиры

а,а,-1,Г- диглюкозы (трегалозы).

миколоеая кислота

О—СН

<^У_

, миколовая

кислота

Корд-фактор обладает токсичностью, которая потенцируется

сульфогликолипидами, локализующимися

ним

клеточной стен-

ке микобактерий (например,

М. tuberculosis сульфогликолипид

представляет собой 2,3,6,6'-тетраацетилтрегалозо-2'-сульфат).

В клеточной стенке микобактерий имеются еще микозиды,

ответственные

за

рецепцию бактериофагов. Микозиды содержат

6-дезокситалозу

и ее

О-метиловые эфиры, фукозу, рамнозу. Раз-

личают микозиды А, В

С. Микозиды А и В являются фенольными

гликолипидами, микозиды

— пептидогликолипидами.

со—сн

О—СН

OS0

ОСОСН3 'сН

—О—СО—СН

сульфогликолипид из М. tuberculosis

При оценке биологических свойств продуктов клеточных сте-

нок микобактерий вначале предполагали, что иммуноадьювантной

активностью обладают их уникальные липидные компоненты.

Однако на основании детального анализа установлено, что таким

действием обладают водорастворимые пептидогликаны, содержа-

щиеся в клеточных стенках большинства бактерий. Самый малый

активный фрагмент оказался мурамилдипептидом, представляю-

щим собой 1Ч-ацетил-мурамил-Ь-аланил-0-изоглутамин. Мурамил-

дипептиды — высокоактивные иммуноадьюванты нашли практи-

ческое применение, в том числе — в качестве компонентов вакцин,

рекомендованных для профилактики и лечения СПИД.

СН-а СНя

NOC—(СН

)

—QH—NH—

СО—

СН—

NH—СО—СН—О

соон

НзС0С

мурамилдипептид

Клеточная мембрана прокариот принципиально сходна по ар-

хитектонике с мембраной эукариотической клетки. Тем не менее,

она не является тем трехслойным сэндвичем (от англ. sandwich —

бутерброд), о котором говорили до недавних пор. В состав мембран

входят фосфолипиды с полярными "головками", обращенными

кнаружи; взаимодействующие между собой их гидрофобные хво-

сты из остатков жирных кислот обращены внутрь. Мембранные

белки полностью или частично погружены в липидный слой (рис.

27),

в котором имеют место гидрофобные взаимодействия между

белками и липидами. Гидрофильные участки белков взаимодейст-

Рис.

27.

Модель клеточной мембраны прокари-

от: I — липидный бислой, II — интегральные

белки, III — олигосахаридная боковая цепь в

гликолипиде, IV — углевод V — гликопротеин.

Рис.

28. Жидкостно-мозаичная

модель клеточной мембраны.

вуют с полярными головка-

ми фосфолипидов: Мемб-

рана в целом приобретает

жидкостно-мозаичную

структуру (рис. 28), в кото-

рой имеющиеся слои пред-

ставляют собой нековален-

тно собранные термодина-

мически стабильные, но метаболически лабильные структуры.

Белковые молекулы как бы заякорены в мембране и несут специ-

фические функции. Лишь гликопротеины в мембране не сопряже-

ны с другими компонентами и могут диффундировать латерально

в плоскости мембраны; другие, напротив, интегрированы с мат-

риксом мембраны прочно. Не исключена возможность их роли в

признании и селекции функциональных молекул, в которых про-

является (или должна проявиться) заинтересованность клеточной

мембраны. Контактирующие с ней ферменты и ферментные сис-

темы подвергаются специфическим конформационным изменени-

ям,

что сказывается на характере их взаимодействия с субстратами

и лигандами. Другими словами, клеточная мембрана выступает

организатором и регулятором активности связанных с нею фер-

ментов и ферментных систем. При этом на уровне мембраны

происходят химические и физические процессы.

Какие же принципиальные различия существуют между кле-

точными мембранами прокариот и эукариот? Эти различия каса-

ются химического состава и функций (таблица 8). По химическому

составу клеточные мембраны представляют собой гликопротеоли-

пиды или гликолипопротеины, или, наконец, липогликопротеины,

100

что зависит от таксономического положения организма. В клеточ-

ной мембране золотистого стафилококка на долю углеводного

компонента приходится до 40%, столько же — на долю белкового

компонента и лишь 20% — на липидный компонент.

В усредненном варианте содержание указанных компонентов

в клеточной мембране большинства исследованных прокариот

распределяется следующим образом: белки — до 50%, липиды —

до 30%, углеводы — до 20% (из расчета на сухую массу); для

эукариот эти данные соответственно таковы: белки — до 70-80%,

липиды — до 15 — 25%, углеводы — до 5 — 15%. Однако

применительно к структуре различных мембран указанные вели-

чины могут сильно различаться и, например, на липиды может

приходиться до 50% от сухой массы мембранной фракции эндоп-

лазматического ретикулума, тесно связанного с клеточной мемб-

раной. А в миелиновых мембранах нервных волокон содержание

липидов достигает 80%.

Клеточные мембраны у всех организмов проявляют полифун-

кциональные свойства: осморегуляция, барьерные функции с се-

лективной проницаемостью за счет пор, насосов, рецепторов;

транспорт веществ (в том числе активный с затратой энергии),

участие в создании мембранного потенциала, в превращении

энергии при фотосинтезе и окислительном фосфорилировании.

Глубокое знание структуры и функции оболочки бактерий (или

клеточной мембраны у видов, лишенных клеточной стенки) облег-

чает использование биообъектов в конкретных целях, например,

для получения вторичных метаболитов (см.), когда процессы пере-

носа вещества в клетку (равно как и секреторные процессы)

выступают на первый план. В целях сравнения можно привести

пример с Leuconostoc mesenteroides и Xanthomonas compestris. В

определенных условиях первый из них секретирует фермент

декстрансахаразу, с помощью которой возможен синтез полиса-

харида декстрана без участия клеток, то есть in vitro; второй вид

синтезирует полисахарид ксантан, но уже на уровне клеточной

мембраны и в этом случае без клеток X. campestris биосинтез in

vitro невозможен. Следовательно подходы здесь к осуществлению

процессов биосинтеза полимеров различны, поскольку механизмы

функционирования соответствующих биосистем (в том числе —

оболочки бактерий) неравнозначны.

101

Таблица

Основные различия между клеточными мембранами

и их про-

изводными

прокариот

эукариот.

Признак

Мезосомы

Тилакоиды

Фикобилисомы

Аэросомы

Хлоросомы

Карбоксисомы

Гидрогеносомы

Лизосомы

Пероксисомы

Гликосомы

Митохондрии

Эндоплазматичес-

кий

ретикулум

(ЭПР)

Компартмента-

лизация клетки

за

счет

ЭПР

Система

внутрицитопла-

зматической

мембраны

(не

ЭПР)

Комплекс Гольджи

Хитосомы

Ломасомы

Вакуоли

Хлоропласты

Эндоцитоз

Экзоцитоз

Насыщенные

мононенасы-

щенные жирные

кислоты

Полиненасы-

щенные жирные

кислоты

Простагландины

Прокариоты

Имеются

преимущественно

грамположительных

бактерий

Имеются

цианобактерии

_ " _

Имеются

фототрофов

Имеются

зеленых

фототрофных бактерий

Имеются

фототрофов

некоторых

хемолитотро-

фов

Отсутствуют

_ " _

Отсутствует

Имеется

метанокисляющих,

нитрифицирующих

фототрофных бактерий

Отсутствует

Отсутствуют

„ " _

Не

образуются

большинства бактерий

Отсутствуют

Отсутствует

_ " _

Имеются

Отсутствуют

Эукариоты

Отсутствуют

_ " _

Имеются

некоторых

трихомонасов

Имеются

_ " _

Имеются

Protozoa

Имеются

Имеется

Отсутствует

Имеется

Имеются

грибов

Могут образовываться

за

счет

ЭПР

Имеются

клетках

растений (хроматофоры

водорослей)

Присущ

Отсутствуют

Имеются

некоторых

грибов

102