Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

системах (см. раздел 5.1). Репродукцию вирусов можно подразде-

лить на семь этапов: адсорбцию, пенетрацию (проникновение

вируса в клетку), транскрипцию, трансляцию, репликацию, сборку

вирусных частиц и выход организованных вирусных частиц из

клетки. На каждом этапе совершаются многоактовые процессы,

зависимые как от вирусов, так и от клеток — их реципиентов.

На рис. 22 а, б представлены схемы строения вируса гриппа (а)

и ретровируса — ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) — воз-

будителя СПИД (б). При репродукции вируса гриппа генетическая

информация передается по схеме РНК —• РНК —• Белок. У них

биосинтез РНК осуществляется на матрице вирионной РНК под

каталитическим действием вирионной РНК-зависимой РНК-пол-

имеразы, или вирионной транскриптазы. У ВИЧ генетическая

информация передается по схеме РНК—*ДНК—«-РНК—•Белок, то

есть вначале по матрице РНК синтезируется ДНК с помощью

фермента обратной транскриптазы, а затем все протекает по

универсальной схеме ДНК—«-РНК—"-Белок. Структурный материал

в обоих приводимых случаях используется из содержимого реци-

пиентных клеток.

Рис. 22. Схемы строения вирусов гриппа (а):

— гемаглютинин, 2 — нейраминидаза,

3 — липидный бислой, 4 — белковый слой, 5 — рибонуклеопротеин; и ретровируса

ВИЧ (б): 1 — гликопротеин-120, 2 —- сердцевина, 3 — гликопротеин-41, 4 —

липоидная мембрана, 5 — РНК, 6 — обратная транскриптаза.

Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа состоит из 8 сегмен-

тов,

каждый из которых на З'-конце заканчивается уридиновым

остатком. Общая молекулярная масса РНК составляет 2 — 4 тыс.

кДа. Вследствие такой сегментированности геном вируса гриппа

отличается высокой частотой рекомбинации, способностью к ре-

активации и синтезировать гемагглютинин и нейраминидазу после

химического подавления вирусной инфекционное™.

Частицы ВИЧ образуются из трех различных по составу и

молекулярной массе белков — протеина 25(24), гликопротеинов 41

и 120. Первый из них р25(24) входит в состав сердцевины вириона,

гликопротеины (др41 и др120) формируют "шипы" оболочки час-

тицы. В сердцевину также входят однонитевая РНК, несущая

генетическую информацию, и фермент обратная транскриптаза,

под действием которой синтезируется провирус — ДНК-копия

вирусной РНК. Провирус встраивается в хромосомную ДНК клет-

ки — реципиента и персистирует (от лат. persistens — стойкий,

сохраняющийся, остающийся) до того времени, пока не будет

активирован. После такой активации происходит его репродукция.

Если ретровирусные РНК структурно заканчиваются прямыми

повторами нуклеотидов числом 10 — 80 пар, то свободные линей-

ные двухнитевые ДНК-копии заканчиваются длинными одинако-

выми повторами — LTR (от англ. long terminal repeat) числом 250

— 1400 нуклеотидных пар, укороченных на две пары с каждого

конца (рис. 23).

s\*r\

Y3'

Y5'

agpol

Y3'

Y5'

провирусная ДНК

LTR LTR

Рис. 23. LTR в составе линейной ДНК копии РНК вируса иммунодефицита человека

Сборка новых вирионов происходит на клеточной мембране.

В процессе агрегации вирусных белков она начинает набухать и

выпячиваться, высвобождая в конечном итоге новоорганизован-

ные частицы вирусов.

Вирусы прокариот, или бактериофаги, в большинстве своем

имеют структурно-функциональное сходство. В частности, они

содержат лишь один какой-то тип нуклеиновой кислоты — ДНК

или РНК в качестве генетического материала (у большинства фагов

имеется двунитевая ДНК); нуклеиновая кислота упаковывается в

головку фага; преобладающее большинство фагов имеет хвостовой

отросток для прикрепления к поверхности реципиентной клетки;

наконец, бактериофаги сходны по характеру индуцируемых ими

событий, развивающихся в клетке после ее заражения — фаги

являются облигатными паразитами.

Различия бактериофагов обусловлены тонкой структурой нук-

леиновых кислот (в последовательности нуклеотидов, наличием

или отсутствием липких концов, в линейности или кольцевидной

замкнутости и пр.), типами молекулярной симметрии капсидов,

деталями строения хвостовой части, специфичностью действия в

отношении чувствительных клеток.

Известны три состояния, в которых могут находиться недефек-

тные фаги и три типа влияния фаговой инфекции на судьбу

зараженной клетки. К числу первых относят: свободное состояние,

вегетацию и состояние профага (для так называемых умеренных

фагов); к числу вторых — гибель зараженной клетки (фаги здесь

называют истинно вирулентными); переход клетки, несущей уме-

ренный фаг (профаг), на путь лизогенного развития, или, в случае

индуцибельности профага и воздействия индуцирующими факто-

рами (УФЛ, некоторые мутагены и др.) — на путь лизиса; наконец,

при третьем типе влияния фаговой инфекции не наблюдается

каких-либо заметных отклонений в характере поведения заражен-

ных клеток — гибели их не происходит; фаги при этом могут

высвобождаться из клеток или постоянно реплицироваться, нахо-

дясь внутри их и слегка замедляя скорость размножения клеток.

Учитывая сказанное, следует подчеркнуть, что бактериофаги име-

ют большое значение в биотехнологии еще и потому, что они могут

выступать ощутимыми вредителями в микробиологических произ-

водствах, базирующихся на эксплуатации прокариотических орга-

низмов.

Результаты фундаментальных исследований структуры вирои-

дов упрочили самостоятельность этой группы микробов в царстве

Vira. Ныне вироиды подразделяют на три группы согласно нукле-

отидных последовательностей в их РНК:

1) группа ВВКК, включающая вироиды веретеновидности клуб-

ней картофеля и все другие вироиды кроме ВКККП и ВСПА (см.

ниже);

у них имеются значительные области гомологии последо-

вательностей (50 — 80%) и относительно протяженная полипури-

новая последователь-

ность; они содержат

высококонсерватив-

ную центральную об-

ласть (рис. 24); 2) виро-

иды болезни каданг-ка-

Рис.

24. Вироиды: 1 — линей-

ные и 2 — кольцевые формы

денатурированных молекул

вироида ВВКК (электронно-

микроскопический снимок)

(по Т. О. Динеру, 1984).

данг кокосовой пальмы (ВКККП), содержащий консервативную

центральную область, короткую последовательность пуринов, а за

пределами центральной области проявляет малую гомологию по-

следовательностей;

3) вироиды болезни "солнечная пятнистость авокадо" (ВСПА)

с небольшой центральной консервативной областью и малой го-

мологией последовательностей с последовательностями у любого

другого вироида.

Высказывается предположение в том, что вироиды произошли

от интронов (см.) и что недалеко то время, когда они будут

рекомендованы в качестве векторов в фитобиотехнологии реком-

бинантных ДНК.

4.2.

Клетки прокариот. Почти во всех больших траксономиче-

ских группах имеются представители, с успехом использующиеся

в соответствующих биотехнологических процессах — будь это

сапрофитные или патогенные виды. Для сравнения можно указать

на лактобактерии и туберкулезные микобактерии. Первые исполь-

зуются для приготовления молочнокислых продуктов и в силосо-

вании кормов, вторые — для приготовления вакцины BCG и

туберкулина (диагностическое средство при туберкулезе). Из ар-

хеобактерий большое значение имеют метаногенные бактерии —

продуценты метана. Пневмококки используются для изготовления

полисахаридных вакцин, применяемых для профилактики и лече-

ния пневмоний, вызванных различными сероварами Streptococcus

pneumoniae.

Археобактерии заметно отличаются от эубактерий по

химическому составу клеточной стенки и клеточной мембраны, по

последовательности нуклеотидов в рибосомных нуклеиновых кис-

СООН лотах, или рРНК (в 5S- и 16S рРНК) и по

некоторым другим признакам. Так, в кле-

точной стенке у них отсутствует типичный

пептидогликан — муреин, хотя у некото-

рых археобактерии имеется псевдомуре-

ин,

в котором вместо ацетилмурамовой

кислоты содержится талозаминуроновая

кислота; интерпептидные мостики вклю-

чают лишь L-аминокислоты, так как D-ами-

нокислоты отсутствуют в псевдомуреине.

У метанококков клеточная стенка формируется из белка, у мета-

носарцин — из нейтральных углеводов, уроновых кислот и ами-

носахаров, у метаноспирилл имеется полипептидный чехол.

Особенностями химического состава клеточной стенки архео-

бактерии можно объяснить неэффективность пенициллина, цефа-

н.он

талозаминуроновая кислота

лоспорина и D-циклосерина против этих микроорганизмов. Иначе

говоря, для данных антибиотиков отсутствуют мишени в клетках

археобактерии. Клеточная мембрана их также существенно отли-

сн,—о

сн—о.

ChUOH

сн,

сн—о

бифитанил-глицерин (бифитанил-диглицерол-диэфир)

сн,он

сн

- СН,

сн

он

бифитанил-диглицерин (бифитамил-диглицерол-тетраэфир)

чается от клеточной мембраны эубактерии. В частности, в ней не

обнаружены фосфатидилглицерины, но содержатся бифитанил

(С 2о)-(изопреноид) -глицерин, а у некоторых представителей архе-

обактерии — бифитанил (С4о)-(изопреноид)диглицерин. Обнару-

жены и нейтральные липиды в форме свободных Ci5- и Сзо-изо-

преноидных углеводородов (сесквитерпены и тритерпены).

Рибосомы археобактерии и эубактерии сходны между собой,

Н,С=С-СН=СН-СН=С-СН=СН-СН=С-СН=СН,

•9

СН,

сесквитерпен (С

)

Н,С=С—СН=СН- -СН=С—СН=СН

СН,

сн=с—сн=сн.

сн,

тритерпен (С

)

по константе седиментации относятся к типу 70S, но последова-

тельность оснований в

5S-

16S-

рибосомных РНК у археобактерии

33 32 31

36 35

сосо

СНт СгЦ СгЦ

г/ \л

CH=N—N

N—С1-Ц

\6_J/

рифампицин-3=(4'-метил-Г-пиперазинилиминометил)-рифамицин SV

иная. ДНК-зависимые РНК-полимеразы, в отличие от эубактерий,

состоят у них из более чем четырех субъединиц, и эти ферменты

не чувствительны к антибиотику рифампицину.

геноме археобактерии выявлены интроны, что ранее рассмат-

ривалось принадлежностью генома эукариот. Поэтому в настоящее

время сформировалось два направления по трактовке места архе-

обактерии и их происхождения. Ученые — приверженцы первого

направления считают, что интроны в геноме эукариот есть резуль-

тат эндоцитоза древними эукариотическими микроорганизами

клеток прокариотических археобактерии, которые впоследствии

(в процессе эволюции) трансформировались в митохондрии. При-

верженцы второго направления считают археобактерии прароди-

телями эубактерий, то есть по их мнению эволюция шла по линии:

Археобактерии -> Эукариоты -> Эубактерий.

Промежуточное положение эукариот в приведенной последо-

вательности как бы разрывает одно надцарство прокариот на два,

однако принципиальная организация ядерного аппарата у архео-

бактерии и эубактерий во многом сходна , следовательно, приве-

денная схема эволюционных событий представляется как бы не-

достаточно обоснованной. С учетом современных знаний о прока-

риотах эволюцию их можно представить в двух следующих вари-

антах (см. стр. 89).

Во второй схеме отсутствует прямая связь между археобакте-

I) Археобактерии » Эубактерии »Эукариоты

v '

Прокариоты

или Археобактерии —v Эубактерии

Эукариоты

II) Растения Животные "] ЭУКА-

РИОТЫ

Грибы Простейшие

/ /

Водоросли

]

Эубактерии Археобактерии ПРОКА—

- РИОТЫ

Древние предковые формы

риями и эубактериями. Не следует забывать и того факта, что без

бактерий жизнь всех других, более высоко организованных (эука-

риотических) существ на Земле, вообще прекратилась бы.

Из приведенных данных следует, что представления об эволю-

ции микроорганизмов (равно как и других существ) до сих пор

остаются во многом не разрешенными. Тем не менее, сегодня мы

больше знаем, чем два

—

три десятилетия назад, о структурно-фун-

кциональной организации клеток различных организмов и заметно

расширили арсенал промышленно полезных видов.

Эубактерии включают все прокариоты кроме археобак-

терии. Их подразделяют на две группы — фототрофные и хемо-

трофные бактерии. Этим подчеркивается их принципиальное раз-

личие по используемому источнику энергии. Фототрофы исполь-

зуют кванты солнечного света, тогда как хемотрофы — энергию

химических связей в различных химических соединениях. Среди

фототрофов различают оксигенные цианобактерии, в процессе

жизнедеятельности которых выделяется молекулярный кислород

(1),

и аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии, не выделяю-

щие кислорода (2а,б,в).

В реакциях 2а,б,в донорами электронов соответственно явля-

ются сероводород, газообразный водород и изопропанол.

Цианобактерии являются важными поставщиками кислорода

в атмосферу, а из атмосферы они поглощают (фиксируют) моле-

кулярный азот.

Хемотрофные эубактерии могут образовывать (или не образу-

ют) эндоспоры. Клетки их весьма разнообразны по морфологии:

прямые, изогнутые, палочковидные, круглые, овальные, бобовид-

ные,

спиралевидные, нитевидные и др. Удельный вес микробной

клетки составляет примерно

1,038—

1,065.

Тогда, исходя из средних

6H.O+6CO. —Ь^ • (СН

0),+60

^ I ^ цианобактерий

Z 'о . ^

Здесь донор электронов - вода. Следует иметь в виду, что среди цианобактерий

есть виды, способные окислять сероводород и переходить на фотосинтез без

выделения кислорода.

S+CO? — • CH

0+H

0+2S

2 2 пурпурные серные и зеленые 2 2

серные бактерии, некоторые

цианобактерий

Сера затем окисляется до сульфата. Тогда суммарная реакция будет следующей:

2а) H

S+2C0

+2H

0 — • (CH

*•

пурпурные серные и зеленые z. L L "i

серные бактерии, некоторые

цианобактерий

26) 2Н

+ СО

— » СН

0+Н,0

ь ь пурпурные несерные и 2 2

зеленые несерные бак-

терии

2в)2СН

СН(ОН)СН

+С0

^^-СН

0+2(СНз)

СО+Н

изопропанол

се

ные

бактерии щион

размеров бактерии 2 х 0,5 мкм, вес ее составит 4,12«10"

мг, то есть

в 1 г будет содержаться 2,42»

таких клеток.

Важным параметром, характеризующим большинство прока-

риотических клеток, является скорость их размножения, измеря-

емая минутами (в среднем от 8 — 10 мин до 30 — 40 мин). Это

важно в тех случаях, когда биомасса клеток является целевым

продуктом в конкретном производстве, или когда количество

образующегося метоболита (целевого продукта) находится в пря-

мопропорциональной зависимости от количества вырастающих

клеток за конкретный временной интервал.

Все обменные процессы развивающихся прокариотическйх

клеток осуществляются с участием клеточной мембраны. Через

мембрану поступают внутрь клетки питательные вещества, через

нее же секретируются определенные продукты из клетки в окру-

жающую среду; мембраны участвуют в регуляторных процессах и

энергообеспечении

клетки.

Вот почему, начиная с 70-х

—

80-х годов

XX в., когда удалось в чистом виде изолировать и исследовать

мембранные фракции различного происхождения, интерес к мем-

бранам резко возрос. Сформировалась самостоятельная научная

дисциплина — мембранология, а специалисты, работающие

в этой области, стали называться мембранологами.

Клеточная стенка прокариот занимает свое особое место в

структуре и архитектонике клеток. Ее нельзя исключать из мета-

болических процессов, так как она занимает пограничное положе-

ние между внутренней (протопласт) и внешней средами, и через

нее должны проходить различные вещества в обоих направлениях.

Однако главные функции ее — поддержание формы клетки и

защитная, тогда как основная функция клеточной мембраны —

регуляторно-метаболическая. Клеточная стенка и клеточная мем-

брана вместе формируют оболочку.

В эволюционно-биохимическом плане клеточная стенка у про-

кариот претерпела структурные изменения в направлении: Архе-

обактерии

—>

Грамположительные бактерии

—>

Грамотрицатель-

ные бактерии. У археобактерий нет типичного пептидогликана,

хотя задатки к нему

имеются;

пептидогликан у грамположительных

бактерий многослоен, тогда как у грамотрицательных бактерий он

однослоен. Лишая клетки прокариот клеточной стенки, их относи-

тельно легко удается получать в виде протопластов или сферопла-

стов,

которые могут быть использованы в клеточно-инженерных

работах.

Вместе с возможным капсульным слоем на оболочку приходит-

ся 20% и более сухой массы клетки. В оболочке имеются поры для

транспорта питательных веществ (диаметр их от 0,001 до 0,01 мкм)

и рецепторы (белки-порины) для фагов и бактериоцинов, а также

места взаимодействия с антителами и комплементом. В оболочках

грамотрицательных бактерий содержатся токсические и аллерген-

ные соединения.

Электронно-микроскопические снимки поверхностей прока-

риотических клеток отличаются большим разнообразием. Причем,

в противоположность сравнительно тонко очерченной поверхно-

сти у грамположительных бактерий, большинство представителей

грамотрицательных видов имеет исключительно складчатую по-

верхность.

У многих прокариот кнаружи от клеточной стенки располага-

ется капсульн^й материал, состоящий в большинстве случаев из

полисахаридов — гликанов (например, у Acinetobacter spp.), либо

— из протеинов (например, у Вас. licheniformis).

Клеточная стенка утолщается с возрастом клетки и может

достигать, например у Lactobacillus acidophilus, 0,8 мкм. Клеточная

мембрана, напротив, остается более или менее постоянной по

толщине во.все периоды развития прокариотических клеток (0,0075

мкм) и с более или менее постоянными порами диаметром около

1 нм.

В клеточной стенке грамоположительных бактерий сосредото-

чен пептидогликан — муреин, имеются тейхоевые кислоты, белки;

у стрептококков группы А в диффузно-распределенном виде в

наружном слое клеточной стенки находится также М протеин,

являющийся фактором вирулентности этих микробов. М протеин

может быть гидролизован с помощью трипсина без нарушения

жизнеспособности клеток.

У грамотрицательных бактерий четко обозначается трехслой-

ность клеточной стенки: липополисахаридный слой (О-антиген),

наружный слой (нередко обозначаемый как "внешняя мембрана"),

состоящий из двух фосфолипидных

листков,

и подлежащий липоп-

ротеиновый слой. Липополисахарид проявляет свойства эндоток-

сина, он занимает пограничное положение между внешней средой

и подлежащим фосфолипидом (преимущественно — фосфатиди-

лэтаноламином).

Липополисахариды получают в производственных условиях в

качестве средств, обладающих различными биологическими свой-

ствами: токсическими (связанными с липидом А в липополисаха-

риде),

пирогенными, митогенными (для мышиных лимфоцитов),

стимуляторами развития клеток костного мозга, активаторами

фактора VII свертывания крови (фактор Хагемана) в тромбоцитах

и комплемента; липополисахарид в концентрации 1»10"

г вызы-

вает свертывание лизата амебоцитов дальневосточного краба

Limulus poliphemus. Реакцию широко используют при выявлении

липополисахарида в каких-либо субстратах, лекарственных сред-

ствах и др. Взаимодействие между эндотоксином и лизатом аме-

боцитов протекает по следующей схеме: