Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

экзоцитоз, слияние везикул в цитоплазме, поглощение одной ве-

зикулы другой (аутофагия), почкование; по транс-механизму про-

текают: захват мембранных везикул, разделение везикул, эндоци-

тоз.

Функция эндосомы — первичная внутриклеточная переработка

захваченных веществ при рН ниже 7,0 с последующим транспор-

том их в лизосомы или, обходя последние, в места хранения

(гранулы).

Эндосомы могут сливаться с клеточной мембраной, и тогда их

содержимое выводится из клетки — экзоцитоз. Участки

мембраны (пэтчи) могут отделяться с частью содержимого от

эндосомы и возвращаться в одних случаях — на прежнее место

(такой процесс называется регургитацией, от франц.

regurgitation — излияние, извержение), в других случаях — на

противоположную сторону клетки, где сливаются с мембраной и

немодифицированный материал выводят наружу — д и а ц и-

т о з (от греч. dia — через). Продукты экзоцитоза (литические

ферменты, гормоны и другие вещества) поступают в околоклеточ-

ные пространства, в кровяное русло, в специализированные сек-

реторные протоки (например, слюна, секрет поджелудочной же-

лезы и т. д.).

В некоторых случаях эндосомы на время превращаются в

вакуоли, то есть когда по каким-либо причинам слияние их с

лизосомами приостанавливается. Регуляторами таких процессов

могут выступать некоторые гликопротеины (например, конканава-

лин А), микобактерии туберкулеза и другие факторы.

Весьма существенной для жизнедеятельности эукариотических

клеток является способность мембран любых компартментов клет-

ки сливаться и разъединяться. Поэтому регулируемый поток в

мембранных образованиях в направлении: клеточная мембра-

на (эндоцитоз) —» эндосома —> лизосома —> комплекс Голь-

джи —> ЭПР -» коплекс Гольджи -» секреторная гранула

(экзоцитоз) в основном экспериментально установлен и, следова-

тельно, реален.

Лизосомы (0,5 х 2-3 мкм в диаметре) происходят из эндосом.

Их число в клетке может достигать нескольких сотен. Лизосомы

характеризуются большим полиморфизмом и размерами. Они

представляют собой мембранные образования, в которых проис-

ходит "переваривание" поступающих в клетку веществ с помощью

гидролаз при рН= 3,5-5,0. В лизосомах обнаружено свыше 50

133

гидролитических ферментов. Продукты гидролиза ранее поступив-

шего материала проникают через мембрану лизосом во вне — в

цитозоль (основной наполнитель клетки, состоящий из воды с

водорастворимыми компонентами), в том числе — связанные с

выработкой энергии (гликолиз).

Известны лизосомотропные вещества, которые в непротони-

рованной форме (незаряженной) проникают через мембрану ли-

зосом и могут накапливаться в них. Они, как правило, являются

лиофильными слабыми основаниями и могут быть использованы

в практических целях. К их числу относятся противомалярийный

NH-CH-(CH )-N=(C,H,), препаратхлорохин-про-

I I 2 3 ^ э * изводное 4-аминохиноли-

^^Nf"^^

3 на. Накапливаясь в лизо-

сомах, хлорохин блокиру-

ет метаболизм гемоглоби-

на — единственного ис-

точника питания малярий-

ного плазмодия.

Лизосомотропизм слабых оснований базируется на механизме

протонной ловушки. Такой механизм присущ и эндосомам, неко-

торым отделам комплекса Гольд-

П ?' . п ^

жи

- (Р

ис

хлорохин

но

В клетках печени и почек мле-

«кмос)

копитающих, растений и грибов

имеются пероксисомы —

неровные округловатые мембран-

ные образования

0,5-10

мкм в ди-

Рис.

47.

Лизосома

—

протонная ловуш- аметре, заполненные компактным

ка; П —препарат, ПН — протонизиро- аморфным матриКСОМ С ПЛОТНОЙ

ванный препарат, 1 — быстрое проник-

новение, 2

протонный насос, з - кристаллоиднои сердцевиной. В

медленный выход.

ный метаболизм, главным

них осуществляется окислитель-

участником которого высту-

пают пероксисомальные ок-

сидазы и каталаза: Можно

полагать, что "пероксисо-

мальный тип дыхания" (не

АН

А и А"

—

субсраты (А"

—

низкомолекулярный)

134

экономичный, но простой по реализации) возник задолго до того,

как были "включены" в аэробное дыхание митохондрии. Перокси-

сомы — органеллы, возникшие в ответ на появление кислорода в

атмосфере. В пероксисомах происходит Р-окисление жирных кис-

лот. Субстратами окисления (кроме жирных кислот) могут быть

разные соединения, включая D- и L-аминокислоты, гидроксикис-

лоты, спирты, амины, пурин, но никогда НАД»Н, который окисля-

ется в митохондриях. Пероксисомы участвуют также в синтезе

углеводов.

У инфузорий (Tetrahymena pyriformis) пероксисомы называют

глиоксисомами, в которых содержатся лишь два фермента

глиоксилатного пути окисления веществ — изоцитрат-лиаза и

малат-синтаза.

У некоторых протозойных организмов имеются одномембран-

ные органеллы — гликосомы и гидрогеносомы. В

первых протекает гликолиз, во вторых — окисление пирувата,

сопряженное с синтезом АТФ (у Trichomonas vaginalis нет мито-

хондрий, но есть пероксисомы). При аэробных условиях высво-

бождающиеся при окислении электроны передаются на кислород

с образованием Н2О; при анаэробиозе электроны переходят к

протонам (Н

) и образуется водород (Н2).

этой последней реакции

участвуют гидрогеназа и ферредоксин (белок с низким окисли-

тельно-восстановительным потенциалом).

У грибов имеются хитосомы, содержащие фермент

хитинсинтазу, катализирующую реакцию синтеза микрофибрилл

хитина. Хитосомы транспортируют микрофибриллы к клеточной

стенке, где и собирается хитин. Так же у грибов известны л о-

м а с о м ы, располагающиеся между клеточной стенкой и клеточной

мембраной. Как производные клеточной мембраны они могут

возникать в результате дисбаланса пластичности и тургора клеток,

то есть когда мембрана образуется "с избытком". Функция их

окончательно не выяснена, но, очевидно, ломасомы могут быть

причастными к процессам экзоцитоза и секреции веществ, хотя

такой вывод не является окончательным.

При выделении органелл и последующей работе с ними опи-

раются на маркерные структуры, топологически привязанные или

ассоциирующиеся с ними. Чаще всего такими маркерами являются

ферменты (таблица 12).

135

Т а б л и ц а 12. Маркерные ферменты клеточных органелл

Фермент - маркер

Аденилатциклаза

-АТФ-аза

- Нуклеотидаза

Лейцинаминопептидаза

у - Глутамилтранспептидаза

Глюкозо-6-фосфатаза

НАДФ»-цитохром-

О-редуктаза

Эпоксигидролаза

Галактозилтрансфераза ,

Сиалилтрансфераза

НАДф-фосфатаза

Сукцинатдегидрогеназа

Цитохромокисидаза

Ротенон -нечувствительная

НАД»Н-цитохром

с-редуктаза

Моноаминооксидаза

Кинуренин -3-гидроксилаза

Кислая фосфатаза

р - Глюкуронидаза

Каталаза

Лактатдегидрогеназа

Классификационный

номер фермента

1КФ)

4.6.1.1

3.6.1.37

3.1.3.5

3.4.11.1

2.3.2.12

3.1.3.9

1.6.2.4

3.3.2.3

2.4.1.38

2.4.99.1

3.6.1.22

1.3.99.1

1.9.3.1

1.6.99.1

1.4.3.4

1.14.13.9

3.1.3.2

3.2.1.31

1.11.1.6

1.1.1.22

Органелла

Клеточная мембрана

(базолатеральная)

— " —

Клеточная мембрана

(апикальная)

— " —

ЭПР

— " —

-— —

Аппарат Гольджи

— —

— " —

Митохондрии

(внутренняя

мембрана)

— " —

Митохондрии

(наружная мембрана)

— " —

Лизосомы

—

Пероксисомы

Цитозоль

Примечание:

Ротенон является производным изофлавона,

Кинуренин — производ-

ное триптофана

***>Аж.

со—сн

—сн—соон

В последние годы широко используется термин гликока-

л и к с (от греч. glykis — сладкий, calix — оболочка) преимущест-

венно в отношении животных клеток, хотя нередко используют

его и в более обобщенном виде, то есть когда гликокаликсом

называют наружную часть клеточной мембраны эукариот, вклю-

136

KijSfcbs***»

чающую гликопротеины и гликолипиды, предназначенную для

узнавания однотипных и чужеродных клеток. Иногда вместо на-

звания "гликокаликс" пользуются термином "пушистая оболочка",

особенно тогда, когда идет речь о толстой оболочке, выстилающей

кишечник. Как бы то ни было, термин "гликокаликс" приложим

ко всем клеткам (в том числе — безъядерным как, например,

эритроциты), у которых мембранные олигосахаридные цепи в

гликоконъюгатах выполняют функции признания (рекогниции).

Из мембранных гликопротеинов наиболее полно изучены г л и-

кофорин и фибронектин (от греч. foros — нести, от

лат. fibra — волокно, necter — связывать, присоединять). Первый

из них содержится в эритроцитах, в нем около 50% углеводов и

130 аминокислотных остатков, ММ его 30 кДа. Фибронектин

содержится в клеточных мембранах других клеток, он обладает

выраженной адгезивностью (от лат. adhaesio — слипание,

сращение) и способствует конглютинации(от

лат.

conglutinatio

— склеивание) гомологичных клеток.

К мембранным белкам относятся также л е к т и н ы, выпол-

няющие функции признания и защиты. Известны бактериолекти-

ны,

миколектины, лихенолектины, ихтиолектины, зоолектины (все-

го порядка 1000 лектинов). Ряд из них широко используется на

практике для исследования клеточных мембран, в гистохимии, в

структурной химии углеводов и т. д.

Эукариотическая клетка содержит ядро, состоящее из ДНК,

РНК, белков и ряда низкомолекулярных веществ. Низшие грибы

полинуклеарны. Ядро окружено двухслойной липопротеиновой

мембраной, в которой имеются ядерные поры — поросомы. ДНК

вместе с гистонами (нуклеосомы) формируют хромосомы, число

которых различно у разных организмов (чаще число их находится

между 10 и 50). Ближе к центру каждой хромосомы располагаются

центромеры, связывающиеся с ахроматиновым веретеном в пери-

од деления клеток. Оформленное ядро эукариотической клетки

содержит ядрышко, в котором сосредоточены гены, кодирующие

синтез 28S, 18S и 5,8S pPHK. Ядрышко является также местом

образования рибосом. Около ядра клетки располагаются две цен-

триоли, представляющие собой белковые микротрубочки, содер-

жащие белок тубулин (в растительных и грибных клетках центри-

оли не обнаружены). Центриоли входят в состав митотического

аппарата — биполярной структуры в форме веретена.

Рибосомы эукариот по морфологии и функции напоминают

рибосомы прокариот. Однако они сами и их субчастицы характе-

ризуются другими константами седиментации — для недиссоции-

рованных рибосом 80Sj для большой субчастицы 60S, для малой

40S.

137

В цитоплазме эукариотической клетки находится большое ко-

личество (до нескольких тысяч) энергообеспечивающих структур

— митохондрий, возникших эндосимбионтно. Средние прибли-

женные размеры их равны

1x7 мкм. Это — двухмембранная

органелла, причем внутренняя мем-

брана выраженно складчатая.

Складки ее, называемые к р и с -

т а м и (от лат. crista — гребень),

образуют митохондриальный мат-

рикс,

внутри которого локализуют-

ся рибосомы и кольцевидно-замк-

нутая ДНК, кодирующая некото-

рые митохондриалъные белки (ми-

тохондрии во многом сходны с бак-

териальным протопластом). Во

внутренней мембране локализует-

ся цепь переноса электронов и фер-

ментный комплекс, катализирую-

щий реакции образования макро-

эргического АТФ.

На рис 48 показано принципи-

альное сходство эукариотических

клеток млекопитающих, растений и

грибов.

4.4.

Некоторые функциональ-

ные особенности клеток и клеточ-

ных систем. Биотехнология базиру-

ется на практической реализации

метаболической активности кле-

ток, выделенных из природных суб-

стратов или экспериментально со-

зданных в лабораторных условиях.

В зависимости от целевого продук-

та, получаемого при реализации би-

отехнологического процесса, поддерживают соответствующий

уровень метаболической активности биообъекта. Если речь идет о

каком-либо метаболите, тогда задают такие параметры культиви-

рования, которые обеспечивают максимальный выход данного

вещества. Если же конечным продуктом является биомасса клеток

Рис.

48. Эукариотические клетки: I

— грибная, II — растительная, III —

животная. (1 — клеточная стенка, 2

— клеточная мембрана, 3 — ядро, 4

— ядрышко, 5 — конденсированный

хроматин, 6 — рибосомы, 7 — пол-

ирибосомы, 8 — шероховатый эндоп-

лазматический ретикулум, 9 — аппа-

рат Гольжди (диктиосома — у грибов

и растений), 10 — митохондрии, 11

— ядерные поры, 12 — вакуоль, 13

— пиноцитозный пузырек, 14 —

окаймленный пузырек, 15 — лизосо-

ма, 16 — окаймленная ямка, 17 —

волокнистая область, 18 — тонофи-

ламенты, 19 — десмосома, 20 — плаз-

модесма, 21 — плотный контакт, 22

— жировая капля, 23 — центриоль

(триплеты микротрубочек).

138

-isSeSLfc

или тканей, то в процессе выращивания создают условия для

максимального выхода их в расчете на число одиночных клеток,

на вес массы по отношению к объему среды, либо количеству

потребленного субстрата (экономический коэффициент).

Питательные среды, рекомендуемые для культивирования

представителей акариот, прокариот и эукариот принципиально

отличаются между собой в том смысле, что для "выращивания"

акариот необходимы живые клетки или ткани. Так, вирусы гриппа

накапливают в куриных эмбрионах, вирус табачной мозаики — на

растениях табака, фаги — в клетках бактерий и т. д.

Большинство прокариот достаточно легко культивируется на

доступных питательных средах, однако среди них есть виды,

которые с трудом или совсем не растут в таких условиях — им,

как и акариотам, нужны живые ткани (некоторые спирохеты,

пневмоцисты, риккетсии, хламидии). Такие виды называют обли-

гатными паразитами, что необходимо учитывать при организации

соответствующих производств.

Эукариотические клетки, как правило, удается культивировать

в лабораторных и производственных условиях с большим или

меньшим успехом. При сравнении, например, клеток дрожжей —

сахаромицетов, используемых в производстве вин, и клеток —

бластов человека, применяемых в производстве интерферона,

культивирование последних сопряжено с большими трудностями,

чем культивирование первых. В такой же мере можно говорить о

различиях клеток растений и животных. Для клеток растений

характерна тотипотентность, то есть способность любой отдельной

растительной клетки в соответствующих условиях культивирова-

ния трансформироваться в целое растение. Клетки животных не

обладают такой способностью и выращивать их труднее, чем

клетки растений.

Питательные среды для прокариот и эукариот должны содер-

жать все необходимые ингредиенты, используемые в конструктив-

ном и энергетическом обмене (источники азота, углерода, серы,

кислорода, водорода, фосфора, витамины). В качестве примеров

можно привести питательные среды для Escherichia coli, Penicillium

chrysogenum, культур клеток табака и В-лимфобластов человека

(таблицы 13-16). Е. coli широко используют в биотехнологии, в

частности, штаммы, несущие чужеродную генетическую инфор-

мацию о синтезе человеческого гормона соматотропина, или штам-

139

мы,

секретирующие энтеротоксин,

другие; отдельные виды

пенициллов являются продуцентами антибиотиков пенициллино-

вого ряда: бензил-, оксибензил-, феноксиметил-,

-пентил-,

п-геп-

тил-, п-амил-, аллилмеркаптометилпенициллинов

общей форму-

лой:

Культуру клеток

tabacum используют для пол-

учения алкалоида никотина,

а культуру клеток лимфобла-

стов,

например,

В-ряда

—

для получения белка

а-ин-

терферона.

R—со—NH

^-N «-<

(снз)

СООН,

где

R -

один

из

названных радикалов

Таблица 13. Состав питательной среды для Escherichia coll

Ингредиент

Мясной экстракт

Пептон

Натрия хлорид

Натрия

| гидрофосфат

Миллимоли

—

мг/л НгО

1.10

3»10

2«10

мг%

1»10

300

200

Т а б л и ц а 14. Состав питательной среды для Penicillium chrysogenum

Ингредиент

Кукурузный

экстракт

Гидрол

Лактоза

Аммония нитрат

Натрия сульфит

•5Н

Натрия сульфат

•юшо

Магния сульфат

•7Н

Марганца

сульфат

•

5НгО

Цинка сульфат

Калия

дигидрофосфат

Кальция карбонат

Кислота

фенилуксусная

миллимоли

—

8,7

4,6

1,6

0,008

0,1

мг/л НгО

3*10

5*10

3*10

1,25*10

1»10

500

250

2*10

3*10

1»10

МГ%

300

500

300

125

100

200

300

100

140

ИНКЗ^НЫ;^

Питательная среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга (MS) для культиви-

рования клеток N. tabacum включает следующие компоненты

(таблица 15).

Таблица 15 Питательная среда для N. tabacum

о~============__====

Ингредиент

Калия нитрат

Аммония нитрат

Магния сульфат «7Н20

Кальция хлорид «2Н20

Калия дигидрофосфат

Марганца сульфат МНгО

Цинка сульфат «4Н20

Кислота борная

Калия иодид

Меди сульфат «5Н20

Натрия молибдат »2НгО

Кобальта хлорид «бНгО

Железа закисного

сульфат «7Н20

Натрия ЭДТА

«2Н

Мезоинозит

Тиамин гидрохлорид

Пиридоксин гидрохлорид

Ксилота

никотиновая

Глицин

Гидролизат казеина

Сахароза

БАП*

НУК'

ДФУК'

Миллимоли

1,5

2,9

1,2

0,1

0,0037

0,1

0,005

0,0001

0,001

0,0001

0,1

0,6

0,0014

0,0024

0,004

0,027

87,7

0,002

0,0053

0,0009

мг/л НгО

1900

1650

370

440

170

22,3

8,6

6,2

0,83

0,025

0,25

0,025

27,8

37,3

100

0,4

0,5

10000

30000

0,5

0,2

мг%

190

165

2,23

0,86

0,62

0,083

0,0025

0,025

0,0025

2,78

3,73

0,04

0,05

0.2

1000

3000

0,05

0,1

0,02

Примечание:* ЭДТА — этилендиаминтетраацетат; БАП (цитокинин) — 6-бензиламинопу

рин; НУК (ауксин) — а-нафтилацетат; ДФУК (ауксин) —

2,4-дихлорфеноксиацетат.

MS-среда многоцелевая, универсальная, подходит для каллусо-

образования и индуцирует морфогенез многих двудольных расте-

ний.

Среды для культивирования клеток животных являются более

сложными по сравнению с приведенными выше средами, предназ-

наченными для бактерий, грибов и клеток табака. Так, X. Игл

предложил минимальную незаменимую среду (MEM), вариант

которой по

Р.

Далбекко (ДМЕМ) содержит следующие компоненты

(таблица 16).

141

Таблица16. Состав среды ДМЕМ для культивирования В-лимфоцитов человека

Ингредиент

Глюкоза

Натрия пируват

L-Аргинин гидрохлорид

L-Валин

L-Гистидин гидрохлорид • НгО

Глицин

L-Глутамин

L-Изолейцин

L-Лейцин

L-Лизин

гидрохлорид

L-Метионин

L-Серин

Тирозин (двунатриевая соль)

L-Треонин

L-Триптофан

L-Фенилаланин

L-Цистеин дигидрохлорид

i-Инозитол

Никотинамид

Кальция пантотенат

Пиридоксаль (гидрохлорид)

Рибофлавин

Тиамин гидрохлорид

Кислота фолиевая

Холин битартрат

Натрия хлорид

Калия хлорид

Кальция хлорид

Магния сульфат

Натрия дигидрофосфат • 2НгО

Натрия гидрокарбонат

Железа закисного нитрат

•9Н

феноловый красный

Миллимоли

5,5

0,4

0,3

0,2

0,4

0,8

0,86

0,2

0,4

0,8

0,078

0,4

0,2

0,044

0,03

0,0096

0,02

0,001

0,013

0,006

0,02

109,4

5,4

1,8

0,8

21,4

0,0002

0,02

мг/л НгО

1000

ПО

584

104,8

146,2

89,5

95,2

62,6

7,2

0,4

7,2

6400

400

200

97,7

125

1800

0,1

мг%

100

8,4

9,4

4,2

58,4

10,48

14,62

4,2

8,95

9,52

1,6

6,6

6,26

0,72

0,4

0,04

0,4

0,72

640

9,77

12,5

180

0,01

0,5

По сравнению со средой MEM в среде ДМЕМ почти в два раза

увеличино содержание аминокислот и в 4 раза — витаминов. Ее

используют для культивирования различных видов клеток.

С учетом особенностей клеток в среды MEM и ДМЕМ можно

вносить какие-либо добавки, например, трансферрин, инсулин,

бычий сывороточный альбумин, цельную или диализованную сы-

воротку крови (5-10% по объему).

Кроме подобных сред предложены также бессывороточные

142