Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Некоторые из нуклеотидных фрагментов входят не только в

состав интронов, или фланкирующих (от англ. flank — бок,

сторона, прикрывать с фланга) последовательностей мРНК, но и

могут выполнять функции сигнальных последовательностей,

узнаваемых белками (промоторы транскрипции, точки начала ре-

пликации ДНК, сайты скручивания хромосом и др.). Все эти

сигнальные последовательности, повторяющиеся в геноме в виде

идентичных или сходных тандемных (от англ. tandem — гуськом,

цугом) копий, имеют небольшую длину. При разделении ДНК в

градиенте плотности хлористого цезия сигнальные последователь-

ности (порядка 5%) удается отделять от основной массы ДНК в

виде сателлитной ДНК (дополнительный(е) пик(и) при центрифу-

гировании). Эти ДНК могут быть тяжелее или легче основной

фракции ДНК и могут быть метилированными. Множество тан-

демных повторов в сателлитной ДНК придает ей определенную

аномальность при центрифугировании (сходство поведения с ос-

новной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия). В таких

случаях говорят о криптической (от лат. cryptus — скрытый)

сателлитной ДНК.

Установлено, что высокоповторяющиеся последовательности в

сателлитных ДНК обычно не транскрибируются. Следует отметить,

что сателлитные ДНК локализуются в области центромеры хромо-

сомы (выполняет структурную функцию). Предполагается, что

сателлитные ДНК произошли от мозаики последовательностей,

состоящих из 9 пн в трех повторах:

В начале 80-х годов в геноме человека были

A TGA обнаружены последовательности ДНК, обладаю-

GAAA А щ

е свойствами структурного полиморфизма —

Т ACT

это так

называемые гипервариабельные области

(ГВО),

обычно содержащие короткие, ГЦ-обога-

щенные и тандемно повторенные единицы. ГВО рекомендуются в

качестве маркеров-зондов при картировании генов. Варианты

кор-последовательности ГВО гена человеческого миоглобина были

названы минисателлитными.

В 1985 г. был предложен метод "генетической дактилоскопии

— ДНК" (от греч. dactilos — палец, scopein — смотреть) в целях

оценки эволюции человека по отцовской и материнской линиям

(А. Дж. Джеффрис, У. Уилсон, С. Л. Тейн). В последовательностях

ДНК отражаются происшедшие в прошлом мутации или, по Ф.

Крику, "замороженные события". Это, в частности, поможет кар-

тировать варианты последовательностей в локусе минисателлит-

ной ДНК. Эволюцию по женской линии удобно картировать по

163

митохондриальной ДНК, так как в сперматозоидах практически

нет митохондрий, но ими "начинены" яйцеклетки. Вот почему ДНК

клеточного ядра является сочетанием материнской и отцовской

ДНК, тогда как ДНК митохондрий передается только яйцеклеткой.

Отсюда становится понятным, почему в конце 70-х годов текущего

столетия возникла новая научная дисциплина молекулярная ант-

ропология.

ДНК различных организмов содержатся еще так называемые

палиндромы (от греч. palindrome — перевертыш) — последова-

тельности, повторяющиеся в обратном порядке:

5'-ЦТТЦГАТГГААГ-3'

3'-

ГААГЦТАЦЦТТЦ

- 5'

В суперспирализованном состоянии длинные палиндромы (10

и более пар оснований) образуют крестообразные структуры,

служащие сигналами для узнавания определенных участков ДНК

ферментами-метилазами, рестриктазами и регуляторными белка-

ми,

регулирующими действия генов.

В хромосомных ДНК прокариотических и эукариотических

клеток имеются также контролирующие или так называемые

"прыгающие" подвижные гены — транспозоны (Тп), впервые

открытые Б. Мак-Клинток в 1940 г. у кукурузы. Они находятся на

значительном расстоянии от других генов, на которые оказывают

влияние. Благодаря мутациям, названным "транспозонными взры-

вами", возможно массовое и в известной мере направленное

перемещение генетических элементов. Транспозоны способны

реплицироваться и внедряться (инсерция) в виде одной из копий

в новое место генома (ДНК

ядра).

бактерий преобладающая часть

транспозонов кодирует фермент транспозазу, катализирующую

реакцию встраивания транспозона в ДНК. В последнее время их

отождествляют с интронами, рассмотренными выше.

При сравнении последовательности нуклеотидов в хозяйской

ДНК до и после встраивания транспозона оказывается, что не-

сколько нуклеотидов этой ДНК после встраивания удваиваются —

дуплицируются. Эти дупликации ДНК окаймляют транспозон.

164

Причем, для каждого транспозона характерно определенное коли-

чество дуплицированных нуклеотидов. Принято считать, что при

встраивании транспозонов хозяйская ДНК перед этим фермента-

тивно расщепляется с образованием липких концов, к выступам

которых присоединяется транспозон, а оставшиеся бреши затем

заполняются нуклеотидными последовательностями, в результате

чего и образуются небольшие дупликации.

Следует подчеркнуть, что транспозонов много и они различны

(лишь перечень Tn-ов у дрозофилы составит целую книгу). Следо-

вательно необходима точная классификция их, и, возможно, в

недалеком будущем удастся ее создать.

К настоящему времени принято считать, что механизм транс-

позиции заключается в удвоении подвижных элементов и после-

дующем встраивании одной из копий транспозона в новое место

генома, а другая копия остается в прежнем месте. Вот почему

термин "транспозиция" неточен, поскольку транспозон не покида-

ет своего первоначального места, или сайта. Более правильно

рассматривать транспозицию процессом, в результате которого

возрастает число копий транспозона. Во благо сохранения струк-

туры генома (консерватизма его) транспозиции происходят очень

редко. Так, в среднем, частота их сравнима с частотой спонтанных

мутаций, то есть 10"

—10"

на поколение, а частота реверсии путем

делеций, или выпадений, отмечается еще реже (10~

—10"

Обращает на себя внимание тот факт, что Tn copia из мушки

дрозофилы ведет себя и как транспозон, и как ретровирус (к их

числу, кстати сказать, относится вирус иммунодефицита человека

— причина СПИД). В та-

Ц-

ких вирусах интеграция

ДНК осуществляется

способом, сходным с i

Е£ЧТ:

. :зийш&с

транспозицией. Поэтому

небеспочвенной стала

гипотеза о том, что виру-

сы — это транспозоны,

Приобретшие ДОПОЛНИ- ^

/ Встраивание транспозона в ДНК-мишень

г г

" (схема): 1 — транспозон, 2 — центральная часть,

тельные функции ИЛИ, з — концевые повторы, 4 — дупликация ДНК-ми-

напротив, транспозоны шени.

— это выродившиеся вирусы. Проблема остается открытой. Тем

не менее, обнаружены самые короткие транспозоны, кодирующие

165

Рис.

56. Ori-сайты в плазмиде pSClOl E.coli

(цифры по внешнему кругу 1—6 обозначают

места действия различных ферментов-ре-

стриктаз).

белки, которые участвуют

только в транспозиции. Сле-

довательно ДНК таких

транспозонов можно отне-

сти к разряду "эгоистиче-

ской", работающей лишь на

себя, то есть она функцио-

нирует во имя собственного

размножения.

Схематичное встраива-

ние транспозона (после ре-

пликации) в ДНК-мишень

изображено на рис. 55.

Репликация, или самоудвоение присуще ДНК и РНК, то есть в

таких случаях происходит перенос генетической информации

соответственно от ДНК к ДНК или, например у ряда вирусов, от

РНК к РНК. Репликация осуществляется полуконсервативным

способом, когда двухспиральная ДНК деспирализуется и каждая

нить индуцирует синтез комплементарной себе нити при участии

ДНК- или РНК-полимеразы.

Геномы бактерий и фагов реплицируются как единое целое, то

есть как организованные единицы репликации, или репликоны.

Каждый репликон содержит место (точку) инициации Ori (от англ.

origin — начало) — ориентированное направление репликации,

например OriC у Escherichia coli (рис. 56).

некоторых репликонах

содержится около 240—600 пн. В отдельных репликонах сущест-

вует два Ori, например, в так называемых челночных векторах,

способных реплицироваться в клетках прокариот и эукариот.

Инициация репликации осуществляется с помощью специфиче-

ских белков.

Репликация ДНК необходима функционирующей клетке для

восстановления (репарации), обмена генами между участками

хромосом (рекомбинация) и перемещения генов (транспозиции).

В течение однократного деления прокариотической или эука-

риотической клетки, независимо от числа хромосом в ней, весь

геном ее реплицируется также один

раз,

и только после завершения

репликации может произойти последующее деление. Удвоенный

геном подразделяется (сегрегирует) поровну в каждую дочернюю

клетку. Единицей сегрегации является хромосома, а единицей

репликации — репликон. Кроме точки Ori в репликоне имеется

166

Репликация

однонаправ-

ленная

'(Репликация

может про-

исходить в

I обратном

направлении

Репликация т ^

двунаправ- \ g |

ленная

Рис.

57.

Две репликационные вилки в ДНК:

3 — нереплицированная ДНК, 2 — репликаци-

онный глазок, 4 — стационарная точка начала,

5 — движущаяся репликационная вилка, 6 —

две репликационные вилки.

также точка (место) оста-

новки репликации ter (от

лат. terminalis — конечный,

пограничный). Единицы

сегрегации и репликации в

бактериальной хромосоме

совпадают, поскольку бак-

териальная хромосома со-

держит только один репли-

кой. В то же время каждая

плазмида, если она имеется

в бактериальной клетке,

представляет собой авто-

номную кольцевидную ге-

нетическую структуру и

является самостоятельным

репликоном.

Плазмиды, представленные в бактериальной клетке лишь в

одной копии, называются однокопийными, другие плазмиды, пред-

ставленные более чем одной копией, называются многокопийны-

ми.

В эукариотической клетке содержится большое число репли-

конов и единица сегрегации у них включает много единиц репли-

кации. Все компоненты аппарата ре-

пликации называют реплисомой. Ре-

пликация ДНК начинается в стартовой

точке, или репликационной вилке, в

одном (однонаправленная реплика-

ция) или в двух противоположных

(двунаправленная репликация) на-

правлениях. В последнем случае будет

две репликационных вилки (рис. 57).

Реплицированная часть ДНК приобре-

тает форму "глазка", представляюще-

гося 0-структурой.

В случае кольцевой матричной

структуры ДНК точка роста одной раз-

резанной цепи спирали "скользит"

вокруг второй кольцевой матричной

цепи. Возникает структура катящегося

кольца (рис. 58).

Рост клеток бактерий и репликация

ДНК в них тесно связаны между собой.

167

Разрыв

\fi

Точка

роста

•5'Вытесняемая

цепь

Рис.

58. "Катящееся" кольцо мат-

ричной цепи.

Цикл клеточного деления на примере Е. coli можно представить

двумя временными интервалами, обозначаемыми латинскими бук-

вами С и D. Первая из них обозначает фиксированное время,

необходимое для репликации всей бактериальной хромосомы (на-

пример, 15 мин.), что соответствует скорости движения отдельной

Точка начала -. 35/0 гКонцевая точка

((

т_»>£гл°«и«м

т.»™

репликационнои вилки

присоединени-

*" "~\ , ем около 50000 пар оснований в

мин.;

D соответствует промежутку времени

(порядка 20 мин.) между завершением

репликации ДНК и делением клетки —

это как бы накопительный период. Сле-

довательно, весь так называемый корот-

кий клеточный цикл деления Е coli ук-

ладывается в среднем в 35 минут (рис.

59).

Длинный цикл клеточного деления

наблюдается тогда, когда велико время

до начала инициации. Для диплоидных

клеток эукариот характерно митотиче-

ское деление ядра с последующим обра-

зованием новых (дочерних) клеток. Этот

митотический цикл подразделют на 4 фазы: Gj, S, G2 и М. Фаза

Gi обозначает время роста клетки до синтеза ДНК (от англ. gap —

пробел); в фазу S происходит синтез ДНК (от англ. synthesis); G2

— вторая фаза роста в период.после синтеза ДНК; М — фаза

митоза (от англ. mytosis). На рис 60 представлена схема цикла

эукариотических клеток с обозначением продолжительности фаз

в культивируемых линиях дрожжевых клеток Schizosaccharomyces

pombe и клеток млекопитающих. На весь цикл деления клеток

эукариот усредненно приходится следующая доля времени: на

20 15

Рис.

59. Цикл деления Е. coli —

образование хромосомы со

многими вилками в процессе

репликации (а — инициация, б

— деление, в — терминация);

цифры обозначают минуты кле-

точного цикла.

1 г

Рис.

60. Схема цикла клеточного деления эукариотических клеток: 1 —

Schizosaccharomyces pombe, 2 — клетки млекопитающих.

фазу Gi — 30—40%, на фазу S

на фазу М — 5—10%.

30—50%,

на фазу G2 — 10—20%,

168

m-.

За время движения репликационных вилок

клетках эукариот

присоединяется от 1000 до 3000 пн

минуту

—

млекопитающих

до 1000

пн/мин

— у

растений (здесь

не

исключается роль

пониженных температур для размножения клеток растений).

Синтез комплементарных цепей

во

время репликации двухни-

тевой ДНК

прокариот

эукариот катализируется ферментами,

называемыми ДНК-полимеразами. Их известно

(pol I,

pol

и pol

III

прокариот;

a, b и у - у

эукариот). Характеристика ДНК-по-

лимераз приведена

таблице

18.

Таблица 18. Характеристика прокариотических и эукариотических ДНК-

полимераз

ДНК-полиме-

раза

из клеток

Е.

1 coli:

III

из клеток

млекопита-

ющих:

Размер,

кДа

109

120

250

110-120

Состав

одна цепь

—

гетеромуль-

тимер

несколько

субъединиц

1 субъединица

Ферментативная активность

а) элонгация

направлении

—>

3' от 3' - ОН -

затравки

б)

—»

экзонуклеаза

в)

—»

3' -

экзонуклеаза

см.

для

б)

—»

5' -

экзонуклеаза

- в)

см.

для I

репликативный синтез

ядерной

ДНК

(ядерная ДНК-

репликаза)

80%

репарация сегментов

поврежденной

ДНК

репликативный синтез

митохондриальной

ДНК -

2-15%

На раскрученной ДНК происходит непрерывный синтез веду-

щей цепи

направлении

—>

3',

тогда

как на

комплементарной

цепи имеет место прерывистая репликация,

то

есть

направлении

169

-» 3' на ней синтезируется серия фрагментов ДНК (фрагменты

Оказаки), которые затем соединяются, формируя отстающую цепь

(рис.

61). фрагменты Оказаки содержат примерно 1000—2000

'ччнч^тчч^т^

..5'

Т Ц А Г А Г

А Г У Ц У

Т Т А Ц Г

Г Ц

ОН

Рис.

61.

Фрагменты Оказаки, присоединенные к РНК — инициатору: а — матричная

ДНК, б — комплементарная ДНК, в — РНК—праймер, НТ—входящий нуклеозид-

трифосфат.

нуклеиновых оснований, и синтез фрагментов под каталитическим

действием ферментов РНК-полимераз, включая праймазу (ММ-60

кДа),

инициируется РНК—затравками, каждая из которых по длине

соответствует приблизительно 10 основаниям. РНК—затравка уд-

линяется под действием ДНК-полимеразы III, катализирующей

синтез цепи ДНК. РНК удаляется под действием ферментов экзо-

нуклеаз.

В так называемую затравочную реакцию вовлекается комплекс

белков —- праймосома. Например, праймосомный белок SSB свя-

зывается с одноцепочечной ДНК, стабилизируя ее; белок Dna В

образует предпраймерную РНК и участвует в передвижении прай-

мосомы; белок Dna С действует в комплексе с Dna В; белок Lig

сшивает разрывы между фрагментами Оказаки; белок п'-АТФ-аза,

белки п и п" образуют предзатравочную РНК, и др.

Предполагают, что праймосома собирается в каком-то одном

участке с последующим перемещением по одноцепочечной ДНК

к сайтам,тде инициируется синтез затравки. Направление движе-

ния праймосомы противоположно направлению синтеза ДНК от-

стающей цепи, но синхронно движению репликационной вилки.

По расчетным данным репликация ДНК у прокариот (вместе с

170

раскручиванием молекулы по 10 нуклеотидных пар одномоментно)

должна происходить со скоростью 400 000 оборотов в секунду, что

явно превышает реальную скорость репликации. Поэтому было

предположено, что должны существовать фиксаторы, включающи-

еся в молекулы ДНК у всех организмов. Такие фиксаторы были

обнаружены. К ним относятся ферменты — топоизомеразы. От-

дельные из них катализируют реакции объединения молекул ДНК

в зацепленные кольца — катенаны, топоизомераза II, или гираза,

катализирует суперспирализацию ДНК, топоизомераза I способна

разрезать одну из цепей суперспирализованной ДНК, при этом

цепи раскручиваются и число супервитков уменьшается, после

чего этот же фермент устраняет разрыв в нити ДНК.

Двигателем в распределении реплицированных молекул ДНК

по дочерним клеткам (по крайней мере - у прокариот) выступает

клеточная мембрана, к которой прикрепляется ДНК.

Таким образом, весь катализируемый ферментами процесс

репликации ДНК можно подразделить на 3 этапа: инициацию,

элонгацию (рост цепи) и терминацию. В процессе инициации

происходит разделение нитей ДНК с образованием репликацион-

ной вилки, формирование праймосомы и синтез затравочной РНК.

Этап роста цепи, или элонгации, реализуется в синтезе ДНК с

помощью ДНК-полимераз. Терминация, или окончание синтеза

ДНК, происходит благодаря выключению реакции с помощью

специфического "стоп-сигнала" от специального кодона (термина-

тора) в матричной цепи.

Такие же 3 этапа выделяют в процессах транскрипции и

трансляции ДНК.

Транскрипция — это процесс переписывания закодированной

в ДНК информации и перенос ее к месту синтеза белка (на

рибосомы). Этап инициации при транскрипции заключается во

взаимодействии РНК-полимеразы с ДНК-матрицей; элонгация - в

ферментативном синтезе мРНК на матрице ДНК; терминация —

в остановке синтеза мРНК благодаря "стоп-сигналу" от гена —

терминатора.

Трансляция заключается в переводе закодированной в мРНК

информации в полипептидную цепь. Организующими центрами

процесса трансляции являются рибосомы. При трансляции на

этапе инициации происходит активация аминокислот с помощью

ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) при использовании

энергии АТФ с последующим образованием комплекса

инициации, включающего 3 фактора инициации

(IF-1,

IF-2,

IF-3 — у прокариот, eIF-2,

eIF-3,

eIF-5 и др. — у эукариот), мРНК,

171

гуанозилтрифосфат (ГТФ) и 30S(40S) — субчастицу рибосомы.

Указанный комплекс соединяется с 50S(60S) — субчастицей рибо-

сомы и формирует функциональную 70S (80S) рибосому. На этапе

элонгации в ходе трансляции 'осуществляется синтез полипептид-

ной цепи функционирующей рибосомой с участием факторов

элонгации (EF-Tu, EF-Ts, EF-G — у прокариот; EF-1 и EF-2 — у.

эукариот). Указанные факторы не входят в структуру рибосом, а

присоединяются к ним на определенных этапах.

Во время синтеза белка рибосомы движутся вдоль мРНК,

последовательно считывая триплеты и поэтапно наращивая по-

липептидную цепь. У мРНК, как правило, имеется постоянная

рамка считывания — кодон AUG. При элонгации одна мРНК

связывается с несколькими рибосомами, образуя функционирую-

щий комплекс - полирибосомы, или полисомы. Из указанных трех

этапов с наибольшей скоростью протекает элонгация. Терминация

процесса трансляции осуществляется стоп-кодоном в мРНК.

Как следует из представленных выше данных РНК занимает

место посредника между ДНК и белком. Причем эта центральная

функция присуща мРНК, тогда как тРНК и рРНК являются транс-

криптами, обладающими активностью как завершенные в постро-

ении и функции молекулы. Исключение представляют некоторые

РНК — содержащие вирусные геномы, по матрице которых син-

тезируется РНК, причем реализация генетической информации

может осуществляться по схемам: для одних вирусов, у которых

отсутствует транскрипция, РНК —> Белок (вирус полиомиелита

и др.), для других, располагающих собственной вирионной РНК —

зависимой РНК-полимеразой, или вирионной транскриптазой,

РНК

—>

РНК

—>

Белок (вирусы гриппа, кори и др.), и, наконец, для

третьих — РНК -> ДНК -» РНК

—>

Белок (ретровирусы, в том числе

— ВИЧ, или вирус СПИД).

мРНК, рРНК и тРНК у бактерий синтезируются под каталити-

ческим действием одной и той же РНК-полимеразы (ММ-480 кДа).

В клетках эукариот обнаружены три ядерные РНК-полимеразы (I,

II и III), а также РНК-полимеразы митохондрий и хлоропластов.

Установлено, что РНК-полимераза I, находящаяся в ядрышке,

отвечает за синтез про-рРНК, из которой впоследствии образуются

28S и 18S рРНК; РНК-полимераза II катализирует реакцию синтеза

про-мРНК и только с этим ферментом связано так называемое

кэпирование РНК. А. Шаткин в 1976 г. впервые описал характер-

ную группировку, присоединяющуюся к 5'-концу фактически всех

про-мРНК и мРНК посттранскрипционно. Автор назвал ее КЭПом

172