Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Метод микроинъекцйи используют в случаях механического

введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток

млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные мик-

роиглы (рис 69). Этот метод впервые продемонстрировали Дж. Е.

Мерц и Дж. Б. Гердон в 1977 г. на ооцитах лягушек Xenopus.

/^щШШ£

Рис. 69. Микроинъекция в ядро

i 'жаеШ

ооцита

(1 —

ооцит, 2 — пигментиро-

\ чИЭ ванная половина, 3 — микропипет-

\ ^рг ка, 4 — ядро ооцита, 5 — часть

^*- ,^г / нейлоновой сетки для чашки Петри).

рДНК можно переносить в пермиссивные компетентные клет-

ки с помощью липосом, приготавливаемых из смеси фосфатидил-

серина и холестерина (1:1). Например, удается ввести ген (3-лакта-

мазы из плазмиды pBR322 в отрицательно заряженные липосомы

при обработке их ультразвуком. Последующая инкубация "озву-

ченных" липосом с клетками различных культур сопровождается

приобретением (3-лактамазной активности у этих клеток. На плот-

ной питательной среде клетки, несущие рДНК, размножаются и

огромное потомство их (при этом все клетки тождественны) назы-

ваются клоном. Сумму всех клонов, в которую входят почти все

кДНК, соответствующие множеству разных мРНК, образуемых

клеткой, называют "библиотекой кДНК".

Амплификация и экспрессия генов

Амплификация — это образование дополнительных копий

хромосомных последовательностей. Обычно в биотехнологии при-

меняют малые плазмиды длиной около 3 мкм в разомкнутом

состоянии. Такие плазмиды не передаются при конъюгации,

например, прокариотических клеток. Эти плазмиды называют

нетрансмиссибельными. Однако они могут быть

переданы методом трансформации. В результате амплификации

на одну клетку нередко приходится 10-30 копий нетрансмиссибель-

ных плазмид, что существенно повышает клеточную продуктив-

ность применительно к целевому продукту (белку). Схематично

амплификация представлена на рис. 70.

203

(*&#)——©

Рис.

70. Амплификация нетрансмиссибельной плазмиды в реципиентной про-

кариотической клетке (схема):

1 —

клетка-донор (а

—

нуклеотид, б

—

нетрансмис-

сибельная плазмида), 2

—

клетка-реципиент, 3

—

лизис, 4

—

обработка раствором

кальция хлорида иа холоду (или протопластирование, голодание, обработка

ионами лития), 5

—

клетка реципиент с "разрыхленной" клеточной стенкой, 6 -

трансформация,

7 -

клетка-реципиент с нереконструированной клеточной стенкой,

содержащая плазмиду, 8 - реконструкция клеточной стенки, 9 - клетка-реципиент

с реконструированной клеточной стенкой, содержащая плазмиду, 10 - амплифи-

кация плазмиды, 11 - плазмиды (25), образовавшиеся в реципиентной клетке в

результате амплификации.

Множественные (аплифицированные в миллион раз) копии

определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью

широко используемой в настоящее время полимеразнои

цепной реакции, или ПЦР. Ее впервые описали в 1985 г.

Р.

К. Сейки, С. Шарф, Ф. Фалуна, К. Б. Муллис, Г. Т. Хорн, X. А.

Эрлих и Н. Арнхейм. ПЦР высоко специфична и чувствительна, с

ее помощью можно обнаружить, размножить и исследовать даже

единичную копию гена в исходном материале.

течение трех часов

обычно протекает 30 циклов,амплификации.

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как

минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК.

Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 основа-

ний, представляющие собой концевые последовательности инте-

ресующего нас фрагмента ДНК. Используя комплементарные к

этим участкам олигомеры

—

праймеры, запускают амплификацию.

Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК,

а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, от-

жига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера).

Тепловая денатурация с опровождается расплетением двойной спи-

рали ДНК. При снижении температуры имеет место отжиг олиго-

нуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных

праймеров со своими комплементарными последовательностями.

Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой

в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, и в результате

достраивается новая комплементарная цепь ДНК.

При повторных циклах тепловой денатурации, отжига и синтеза

образовавшиеся новые нити ДНК выступают в качестве шаблонов

(матриц) для праймеров, что вызывает экспоненциальное нараста-

ние участка ДНК, ограниченного праймерами, входящими в состав

этих фрагментов.

К завершению 20-30 циклов амплификации фрагменты ДНК

представлены с избытком в сравнении с остальной геномной ДНК

со свободными концами и образовавшейся в первом цикле ампли-

фикации (рис. 71-1).

Практически эффективность каждого цикла амплификации

составляет

20-50%

от теоретически возможной

при 100%-й

эффективности). Следовательно, можно получить возрастание

ко-

личества специфической последовательности кратное миллиону.

В случаях амплификации геномной ДНК из клеток (тканей)

позвоночных животных иногда происходит накопление фрагмен-

тов неясного происхождения. Тогда проводят серию дополнитель-

ных амплификации, применяя другой набор олигонуклеотидных

праймеров — "nested primers" (от англ. nest — гнездо, гнездиться,

primer — начальный, основной). В этой связи и метод называют

nested oligo" (от греч. oligos — малый). В данном методе продукт

первичной ПЦР используется в качестве матрицы в последующих

циклах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имею-

щими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифи-

цированного фрагмента. При этом получается множество укоро-

ченных (по сравнению с исходным) фрагментов индивидуальной

последовательности ДНК, которые затем подвергаются необходи-

мому анализу.

Таким образом, под названием ПЦР понимают основной цикл

денатурации, отжига и синтеза фрагментов ДНК в присутствии

ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и прайме-

ров.

Процесс по существу является цепным, так как продукты

данной реакции служат матрицей для последующих реакций.

На первых этапах использовали в ПЦР так называемые "кле-

новские фрагменты" ДНК-полимеразы I E. coli (названы по фами-

лии ученого — X. Кленова), которые оказались термолабильными,

и после каждого цикла денатурации необходимо было добавлять

новую порцию фермента. Кроме того, при пониженной темпера-

туре отжига снижалась специфичность амплификации.

С выделением термостабильных ДНК-полимераз, в частности,

из бактерий Thermus aquatieus (Taq-noAHMepa3a)n Pyrococcus

205

Ц 1=1 =а

DGDDDD = В

DDDODDDl> = г

Цикл 1

5'Т ¥3

ДС

Цикл 2

' 5rt|3-

3'1т5' 3^^5

г"1ГЧ

—

Циклы 3-25

if р I*

rm mi

i otat oi

Л"

о s

а"«

I afi УI «I ss gi яг

15'*

3-1 I

•

J| 11 a*

0,5 pM PS ДНК

S-10 pM

ДНК

(0,5 pM)

.3'«

dG5

Рис. 71. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР): I — в классическом

исполнении (а — ДНК-мишень, б — праймер в ПЦР, в — новая ДНК, г — направление

амплификации, дс — денатурация и синтез); II — заякоренная ПЦР (1 — мРНК, 2

— синтез кДНК, 3 — наращивание полидезоксигуанозинового конца, 4 — приго-

товление заякоренного полидезоксицитидинового праимера и синтез второй нити

ДНК, 5 — добавление специфического праимера, амплификация при использовании

обоих праймеров, 6 — концевой праймер, 7,8 — якорный праймер); III — инверти-

рованная ПЦР (1 — кор с известной нуклеотидной последовательностью, 2 — место

действия рестриктазы, 3 — "переваривание", 4 — циклизация, 5 — рестрикция в

пределах кора, , 6 — добавление праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов и

Taq-полимеразы, 7 — амплифицированная область, фланкирующая кор); IV —

асимметричная ПЦР (А — праймер в избытке, 50 пикмолей -рМ; В — лимитирован-

ный праймер — 0,5 рМ; ц — циклы, ds — двухнитевая ДНК, ss — однонитевая ДНК).

woesii (Pwo-ДНК-полимераза), существенно возросла эффектив-

ность ПЦР. Taq-полимераза сохраняет активность после тепловой

денатурации ДНК и не возникает необходимости заменять фер-

206

мент после каждого цикла. Температурный оптимум реакции

составляет 70-75°С, что значительно повышает специфичность,

количественный выход и возможную длину копий амплифициру-

ющихся фрагментов ДНК.

На рис. 71-1 полностью показаны лишь два первых цикла.

Начиная с третьего цикла, не отражена судьба исходной ДНК и

продуктов достройки, синтезированных на ее цепях. Длинные

фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются в

арифметической прогрессии, тогда как короткие фрагменты, ог-

раниченные на концах праймерами и впервые появляющиеся в

конце третьего цикла амплификации, накапливаются в геометри-

ческой прогрессии.

Недостатки ПЦР: возможное загрязнение при взятии образцов

материала для анализа, для каждой пары праймеров требуются

индивидуальные условия реакции, ПЦР опирается только на точ-

ную информацию о секвенировании последовательностей.

Однако преимущества ПЦР несомненны и практические воз-

можности ее огромны. Затравочным материалом для ПЦР можно

использовать мРНК. Тогда с помощью обратной транскриптазы

синтезируют кДНК, которую затем используют в качестве матрицы

для амплификации. В случае применения одного известного прай-

мера, второй праймер будет искусственным, представляющим

собой якорную последовательность, присоединенную к гомополи-

мерному "хвосту". Такой подход называют якорнойПЦР (рис.

71-П).

Известна еще инвертированнаяПЦР, когда пара

праймеров отжигается с известной последовательностью, но ори-

ентируется таким образом, что синтез идет в противоположном

направлении через зону с неизвестной последовательностью (рис.

71-III).

В 1988 г. описана асимметрическаяПЦР, в которой

происходит амплификация однонитевой ДНК (рис. 71-IV).

В 1987 г. фирмой Perkin-Elmer Cetus (США) разработана авто-

матизированная приборная техника для ПЦР, которая благотворно

сказалась на генетических исследованиях.

В 1991

г. этойже фирмой

предложена вторая генерация ПЦР-технологии с использованием

амплификатора 9600 (Gen Amp PCR System 9600), благодаря кото-

рой удалось достичь новых порогов чувствительности и продук-

тивности ПЦР (таблица 21).

Фирма "Ока" (г. Пущино, Московская область) предлагает

собственный оригинальный амплификатор высокого качества, по

стоимости более дешевый, чем зарубежные аналоги.

20/

Таблица21.

Сравнительные данные ПЦР при использовании автоматизиро-

ванных приборов — амплификаторов первого (ДНК-термоцик-

лера 480) и второго (Gen Amp PCR System 9600) поколений.

ПЦР,

мишень

ФагХ

ИЛ1 а

ВИЧ-1

HLA-DQa

t°,°C

Скорость цикла (мин.) в:

термоциклере 480

единичного

0,5

полного

4,33

4,8

5,0

4,58

генном амплификаторе 9600

единичного

0,1

1,25

0,25

1,0

0,5

0,16

полного

2,42

2,05

2,62

1,92

Функциональная активность генов проявляется в периоды

транскрипции и трансляции и называется экспрессией

генов. Степень сродства РНК-полимеразы к промотору оперона

обусловливает эффективность транскрипции, а стабильность

мРНК и ее способность связываться с рибосомами обусловливает

эффективность трансляции.

Экспрессия прокариотических генов преимущественно зави-

сит от выбора промотора в клонируемых генах тех же или близ-

кородственных видов. Чем отдаленнее геномы прокариотических

клеток друг от друга, тем система "транскрипции-трансляции"

генов срабатывает хуже или вообще не срабатывает. Вот почему

здесь важными оказались векторы.

Экспрессия эукариотических генов в прокариотических клет-

ках не реализуется или реализуется с большим трудом.

ядерных

генах эукариот имеются интроны, а у бактерий нет системы

сплайсинга, поэтому образующиеся чужеродные конечные про-

дукты в бактериальных клетках, как правило, неактивны. Однако

использование векторных систем

(в

том числе "челночных") и ПЦР

позволило успешно решать проблемы, связанные с созданием

рДНК их клонированием и экспрессией в различных реципиент-

ных клетках (прокариотических и эукариотических).

Экспрессия генов сопровождается, как правило, выработкой

белковых молекул. Поэтому важно использовать такие клетки,

208

несущие рДНК, которые секретировали бы белок во внешнюю

(культуральную) среду. Если этого не происходит, то для получения

целевого продукта приходится разрушать (дезинтегрировать) клет-

ки и уже из " экстракта" — дезинтеграта выделять соответствующий

белок. Е. coli, выступая на первых порах в качестве монопольной

"рабочей лошадки" биотехнологии, оказалась затем менее пригод-

ной, чем, например, Вас. subtilis, P. aeruginosa, S. cerevisiae и другие

виды, в отличие от которых Е. coli почти совсем не секретирует

белки. Лишь недавно с помощью BRP-векторов удалось преодолеть

барьерную функцию оболочки Е. coli й трансформировать ее в

секретирующую клетку (от ант. Bacteriocm Release Protein).

настоящее время, на основании экспрессии соответствующих

генов в рДНК удалось внедрить в производство штаммы бактерий

и дрожжей, продуцирующие инсулин, соматотропин, интерферо-

ны,

интерлейкины и т. д. Получены штаммы — суперпродуценты

некоторых веществ; выведены бактерии, способные очищать ка-

менный уголь от серы и превращать его в жидкое и газообразное

топливо. Применительно к фитобиотехнологии удалось создать

растения повышенной кормовой и питательной ценности, с воз-

росшей активностью фотосинтеза и азотофиксации, резистентные

к некоторым микробам — фитопатогенам и др.

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в

частности^ соматотропином, или гормоцом роста) оказались важ-

ными для животноводства (возрастание привесов животных, лак-

тации). Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые

клетки млекопитающих

(в

пронуклеусы оплодотворенных ооцитов,

или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс-

генных животных. Клоны реципиентных клеток, содержащие

донорныи хромосомный материал, или трансгены, различаются

по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная

активность и регуляция экспрессии клонированных генов изуча-

ются на целом организме, то и говорят о трансгенном

организме. Схема получения, например, трансгенных мышей

введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное

яйцо приведена на рис. 72. - .

С получением трансгенных животных открываются перспек-

тивы развертывания заманчивых исследований на рубеже XX и

XXI вв. Уже сегодня имеется информация о том, что в Эдинбурге

(Великобритания) есть стадо овец, несущих гены человека, инду-

цирующие выработку факторов свертываемости крови (борьба с

гемофилией у человека благодаря, например, использованию в

209

линия CBA/J

неполовозрелая производитель х половозрелая

линия PARKES

вазэктомия*с

гиперовуляция

__* с/

естественное

спаривание

псевдобеременная

реципиентная

самка

стерильный

самец

коллекция преимплантированных

эмбрионов

оплодотворенное

одноклеточное яйцо

микроинъекции |

выделение и

очистка ДНК

пересадка

в яйцевод

мышь-кормилица

кесарево

и вскармливание

рождение

естественным путем

выделение ДНК

ич ткяири VRnf-тя *

из тканей хвоста•

анализ выделенной

ДНК

идентификация трансгенных

мышеи

скрещивание анализ экспрессии генов

Рис. 72 Схема получения трансгенных мышей.

210

пищу овечьего молока, где содержались

бы

такие факторы); удалось

ввести ген гормона роста крупнорогатых животных в геном клеток

поросят, заставили расти их быстрее и с меньшим количеством

жира. Однако подобные результаты, очевидно, будут сопряжены

и с неудачами. Необходимы кропотливые исследования во всех

направлениях генетической инженерии, чтобы добиться успехов

в практическом воплощении наиболее приемлемых результатов в

биологическую технологию.

В связи с экспрессией генов большое значение приобретает

"белковая инженерия", дорожку которой проторила генетическая

инженерия, первая вытекает из второй и, следовательно, белковая

инженерия также является методом науки "Биологическая техно-

логия". Целевые установки здесь сводятся к изучению и понима-

нию главного звена в структуре ферментов (почему они функци-

онируют так, а не иначе?), к возможности научиться видоизменять

природные белки или, того больше, уметь их заново проектировать,

к выяснению причин и механизмов изменения фенотипа под

влиянием генотипа.

Природные белки имеют свою молекулярную архитектонику

— то это вытянутые, то специфически изогнутые или скрученные

структуры. Поэтому в научной литературе, посвященной белковой

инженерии, можно встретить выражение "архитектурный дизайн",

кода говорят о конструировании молекул белков с заданной архи-

тектурой по заведомо и специально подобранным аминокислотным

текстам. Белковая инженерия в любом проявлении будет базиро-

ваться в основном на продуктах экспрессии естественных и ре-

комбинантных генов.

Таким образом, последовательность этапов клонирования и

экспрессии гена может протекать в следующей очередности:

1) сортинг хромосом (может быть автоматизированным) и

получение ДНК (или только выделение ДНК, например, из прока-

риотических клеток);

2) введение ДНК в вектор (плазмидный);

3) трансформация (трансфекция, инфекция, инъекция);

4) обнаружение и накопление клона (клонирование) клеток;

5) выделение рДНК (плазмиды);

6) определение нуклеотидной последовательности в клониро-

ванном фрагменте рДНК (может быть автоматизировано);

7) конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее

функций;

8) трансформация;

211

9) обнаружение и накопление клана;

10) выделение плазмиды;

11) проверка нуклеотидной последовательности в рДНК (может

быть автоматизировано);

12) трансформация;

13) выращивание культуры на предмет получения экспресси-

руемого белка;

14) выделение белка.

Каковы же место и роль рДНК-биотехнологии в человеческом

обществе?

На фоне растущих народонаселения на планете Земля и эко-

логических бед место и роль рДНК-биотехнологии определяются

потребностью людей в пищевых продуктах и, прежде всего, в

белках, в различных лекарствах; в исправлении многочисленных

наследственных заболеваний. В общенаучном плане важными

являются исследования: а) процессов переноса генетической ин-

формации между видами и расшифровки механизмов функциони-

рования клеток;

б) путей и методов создания новых существ — химер и новых

организмов, возможно — монстров;

в) эволюции различных существ, включая человека (при допу-

щении альтернативной оценки всего живого как вечной материи,

подвергающейся изменчивости в пространстве и времени).

5.3.

Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии.

С каждым годом взаимоотношения различных организмов с окру-

жающей средой все более осложняются

—

растет народонаселение

Земли и неуклонно истощаются ее ресурсы. Уже сегодня количе-

ство веществ, загрязняющих биосферу, трудно поддается учету

или, в ряде случаев, не поддается совсем. По имеющимся данным

первое место среди загрязнителей природы занимают пестициды

(от лат. pestis — зараза, caedo — убиваю), второе — тяжелые

металлы. С 1985 по 1990 год химическая промышленность произ-

водила ежегодно не менее 250 млн. тонн продукции, из которых

до 30% поступало в окружающую среду.

Несмотря на резкое отрицательное отношение людей к атом-

ным электростанциям, не просматривается альтернативы термо-

ядерной энергии, которая вместе с генной инженерией могут

надолго обеспечить выживание человечества на нашей планете. С

другой стороны, возрастание в обществе роли ядерных изотопов

влекут за собой увеличение числа нежелательных мутаций (от лат.

mutare — превращаться) в соматических и половых клетках. Все

212