Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

только одной специфичности — моноклональные антитела (вари-

антов антител может быть также 10". Если антиген содержит

несколько специфических (детерминантных) групп, то антитела

образуются против каждой детерминанты. В-лимфоциты не удает-

ся поддерживать в культуре.

Если В-лимфоцит перерождается и трансформируется in vivo

в злокачественную опухоль, то такая опухоль — миелома

синтезирует большое количество антител, специфичность которых

неизвестна. Однако возникают и такие варианты миеломных

клеток, в которых отсутствует экспрессия генов в отношении

синтеза тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Миеломные

клетки могут поддерживаться в культуре неопределенно долго.

Совместив способность миелом к длительному культивированию

в условиях in vitro и способность В-клеток продуцировать моно-

клональные антитела, Келер и Милыптейн получили гибрид, сек-

ретирующий моноклональные антитела. Для этих целей они ис-

пользовали мышиные клетки миеломы и нормальные В-клетки

селезенки мыши, иммунизированной заданным антигеном (см.

специальную часть). Подобные гибридомы широко используются

теперь для получения различного рода моноклональных антител,

применяемых в диагностических, лечебных и других целях.

Необходимо иметь в виду, что, в отличие от половой гибриди-

зации, соматическая гибридизация эукариотических клеток завер-

шается объединением под одной мембраной не только ядерных

геномов двух (или более) особей, но и генов цитоплазмы (митохон-

дриальных, хлоропластных, емкостью в 1000—2000 генов), что

может отразиться на функциональной активности гибрида. У

межвидовых гибридов часть хромосом может утрачиваться за счет

элиминации, которая оказывается видоспецифичной. Так в гибри-

дах протопластов клеток "мышь х человек" и "человек х комар"

элиминируются хромосомы человека и комара соответственно.

При морфологическом различии хромосом такие гибриды удобны

для картирования генов. Напомним, что в соматических клетках

мыши содержится 20 пар хромосом, в клетках человека 23 пары

хромосом и три пары — в диплоидных клетках комара.

Таким образом, на практике стремятся осуществлять сомати-

ческую гибридизацию для заметного расширения рамок скрещи-

вания, для включения (переноса) внеядерных генов и их функций

в гибридное потомство и для локализации генов в хромосомах.

В случае переноса изолированных хромосом от клетки-донора

183

одного организма в клетку-реципиент другого организма говорят

о хромосомной инженерии. О. Мак Брайд и X. Озер

впервые в 1973 г. осуществили такой перенос хромосом (в стадии

метафазы) китайского хомячка в клетки мыши.

Хромосомная инженерия — ветвь генетической инженерии.

Объектами ее являются хромосомы клеток прокариот и эукариот.

Донорами хромосом могут быть различные суспензионные и суб-

страт-зависимые клеточные линии. Из клеток прокариот хромосо-

му (ДНК) выделяют из супернатанта после центрифугирования

дезинтеграта или лизата клеток (протопластов). Клетки эукариот

блокируют на стадии мейоза, хромосомы выделяют, применяя

"гипотонический шок" и гомогенизацию с последующей очисткой

их дифференциальным центрифугированием. Хромосомы осажда-

ют на поверхности реципиентных клеток хлоридом кальция и через

несколько часов клетки обрабатывают реагентом — "перфорато-

ром" (например, глицерином). Реципиентные клетки могут содер-

жать донорныи материал в широком диапазоне (встроенным в

геном, изолированно).

Благодаря хромосомной инженерии стали возможными пол-

учение высокомолекулярных БАБ, присущих человеку, лечение

наследственных заболеваний, селекция пород домашних живо-

тных и различных видов растений.

Естественное или искусственное скрещивание растений и жи-

вотных, когда происходит оплодотворение женской гаметы муж-

ской, по сути своей касается переноса и слияния хромосом с

последующим возникновением жизнеспособных гибридов. Меж-

видовое скрещивание как правило сопровождается худшими ре-

зультатами — получаемые гибриды обладают сниженной плодови-

тостью или могут быть совершенно бесплодными.

Целые наборы хромосом от разных видов могут соединяться

вместе и в результате возникают аллополиплоидные формы (от

греч. alios — другой). Можно соединять и неполные хромосомные

наборы. Так, при скрещивании 42-хромосомной пшеницы с пше-

нично-ржаным амфидиплоидом, содержащим 56 хромосом, возни-

кает гибрид с 49 хромосомами, у которого 42 хромосомы принад-

лежат пшенице и 7 хромосом принадлежит ржи.

При искусственном скрещивании растений или животных

стремятся получать в потомстве комбинацию различных ценных

родительских признаков.

Теоретически любые клетки могут бь1ть использованы либо в

качестве донора хромосом, либо в качестве реципиента их, хотя

184

на практике стремятся иметь подходящие реципиентные линии

клеток, акцептирующие чужеродную ДНК с повышенной актив-

ностью, например, клетки карциномы мочевого пузыря человека

(линия EJ).

В процессе выделения хромосом из клеток на стадии митоза

эксперименты проводят при пониженных температурах

(

+ 4°С),

используя пластиковые пипетки во избежание деструкции хромо-

сом. Перед механическим разрушением клеток их суспендируют

(10

клеток/мл) в гипотоническом растворе, а затем центрифуги-

руют при 2500 g на холоду (примерно 25 мин. при 4°С). Выход

хромосом составляет около

10%

от всех хромосом клеток-доноров.

Очищенные хромосомы должны быть использованы в опытах по

переносу в реципиентные клетки (трансфекция) немедленно.

Хромосомы можно выделять из клеток, блокированных в ме-

тафазе, различными способами, в том числе с помощью щадящих

поверхностно-активных веществ, например, стероидного сапони-

на-гликозида дигитонина, представляющего собой пентагликозид

дигитогенина. Олигосахаридная часть присоединяется через гид-

роксил в позиции СЗ агликона. Она включает 1 остаток ксилозы

и по 2 остатка галактозы и глюкозы.

ОН

СН

ОН

Таким образом, соподчиненность генной, геномной и хромо-

сомной инженерии можно представить в виде схемы:

Генетическая инженерия

генная инженерия геномная инженерия хромосомная инженерия

половая соматическая

гибриди- гибридизация

зация (клеточная

инженерия)

Такое подразделение генетической инженерии и терминология

185

сн

он

;са

он о ^

достаточно условны, поскольку, в конечном итоге, результаты

манипуляций с рекомбинантной ДНК получают на клеточных

культурах. Поэтому при выделении двух уровней биотехнологии

— молекулярный и клеточный (включая к л е т о ч-

но-инженерный) следует иметь в виду, что первый относится

к получению и клонированию рекомбинантной ДНК, второй — к

выращиванию вирусов, клеток и тканей (клеточно-инженерный —

к протопластированию и гибридизации протопластов), хотя, как

уже было сказано, все уровни можно свести к одному — клеточ-

ному.

УУ/УУУУЧАуА/чл/УА АААДмРНК

ревертаза, или обратная

транскриптаза;

нуклеозидтрифосфаты;

олигодезокситимидин (dT)

S/V/4A./4A/4A/V4/V/VA

А А А А мРНК

II II II II II

—^—~—^————— Т Т Т Т Т комплементарная цепь

денатурация

ДНК=полимераза I

(фрагмент Кленова) + дезоксинуклеозидтри-

фосфат ((1НТФ)

AAAAA

II II II II II ДНК с одноцепочечной

X X X X Т петлей

нуклеаза S1 из Aspergillus oryzae

ААААА

двуцепочечная компле-

N N N II II ментарная ДНК(кДНК)

терминальная трансфераза, сЩТФ

А ААААЦЦЦЦЦЦЦ $£™

II II II II II ДШЧСГО-

Т Т Т Т Т

мополи-

мерными

последо-

ватель-

ностями

<1Ц

Рис.

65.

Схема получения из мРНК фрагмента

ДНК,

пригодного для клонирования.

186

5.2.2. рДНК-биотехнология. Практическое использование ре-

комбинантных ДНК различного происхождения составляет основу

так называемой "рекомбинантной ДНК-биотехнологии", или со-

кращенно рДНК-биотехнологии. Теоретически все 50—200 тысяч

структурных генов человека доступны экспериментальному ана-

лизу, хотя это еще не было бы проникновением в природу человека

в целом. Тем не менее, с помощью рДНК-биотехнологии открыва-

ются невиданные доселе перспективы производства различных

веществ для народного хозяйства.

рДНК-биотехнологию подразделяют на следующие этапы: по-

лучение чужеродной ДНК, разрезание полученной ДНК на фраг-

менты и их очистка, включение фрагмента чужеродной ДНК в

векторную плазмиду и получение рекомбинантной ДНК, или

рДНК, введение рДНК в пермиссивные клетки и клонирование

генов, амплификация и экспрессия рДНК.

Получение чужеродной ДНК. Чужеродную ДНК можно по-

лучить с помощью химического или ферментативного синтеза,

либо из любого организма или из вирусов с последующим опре-

делением ее первичной структуры. Если ДНК выделяют из клеток

эукариот, то для клонирования, амплификации и экспрессии не

нужны интроны. Поэтому в таких случаях используют мРНК,

образующуюся в процессе сплайсинга (рис. 65).

Как видно из рис. 65/терминальная трансфераза катализирует

реакцию присоединения гомополимерных последовательностей

дезоксицитидина. Таким образом создаются предпосылки для по-

следующего клонирования, в частности, используя плазмидный

вектор (см.) PBR322, несущий гены устойчивости к ампициллину

и тетрациклину. После расщепления рестриктазой (см.) Pst 1 (из

Providencia stuartii) эта плазмида имеет гомополимерные последо-

вательности аТ:

Pstl

—Ц—Т—Г—Ц—А—Г

—Г—А—Ц—Г—Т—Ц—

Pst 1

За счет этого вектор можно использовать для встраивания

полученного фрагмента ДНК с гомополимерными последователь-

ностями йЦ.

Для изоляции неповрежденных генов из ДНК можно исполь-

зовать ультразвук или гидродинамическое дробление ДНК в соот-

ветствии с нижеследующей последовательностью этапов.

В соответствии с особенностями структуры полученного фраг-

187

мента его включение в pColi

будет обеспечиваться связыванием

типа поли-dA—dT.

ДНК из E.coli

гидродинамическое дробление (или ультразвук)

фрагменты ДНК

—

рестриктаза фага X

дополнительная специфическая фрагментация

терминальная трансфераза,

с!АТф

ДНК,пригодная для включе-

ния вплазмидный вектор,

dA например, Coli E1

•

N—^H—(CH

)

-S*-[CH7K

СО

С ООН

СИ,

Разрезание ДНК на фрагменты. Любая нативная ДНК может

быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди

которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные

эндонуклеазы). Биологическая роль их, например, в клетках про-

кариот заключается В активный метил

гидролизе чужеродной

ДНК, проникающей в

клетки извне. Собст-

венная хромосомная

ДНК при этом остается

незатронутой рестрик-

тазами, что обусловле-

но наличием фермен-

тов,

называемых моди-

фикационными мети-

лазами, узнающими

одинаковые с рестрик-

тазами сайты. Назван-

ные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в

немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего

метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке ре-

стриктазами. Переносчиком метильных групп выступает S-адено-

зил-Ь-метионин (SAM).

настоящее время известно свыше

500

рестриктаз и для многих

из них определены узнаваемые последовательности. Значительное

число рестриктаз производится в качестве конечных продуктов

биотехнологии, например, такими компаниями как Sigma (США),

188

ОН ОН

SAM

Pharmacia (Швеция), Serva (Германия) и др. Эти ферменты способ-

ны узнавать специфические места (с а й т ы) и расщеплять

нуклеотидные последовательности в ДНК, индуцируя формирова-

ние тупых или липких концов.

Рестриктазы вначале подразделяли на 3 группы в зависимости

от длины узнаваемой последовательности:

I— узнают тетрануклеотиды, например Alu I из Arthrobacter

luteus,

II — узнают пентануклеотиды, например Есо RII из Е. coli,

III — узнают гексануклеотиды, например Есо RI из Е. coli;

Alu I катализирует расщепление последовательности АГ^^ЦТ

с образованием тупых концов во фрагменте ДНК, EcoRII и EcoRI

расщепляют последовательности .^-- ЦЦ(АУТ) ГГ и Г.,—-ААТТЦ

соответственно с образованием липких концов во фрагментах

ДНК.

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с

учетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, мети-

лирования (модификации) и посадки соответственно. К первому

из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в

произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК

(для обеих нитей ДНК известны системы

R2M2S);

ко второму классу

(их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты

рестрикции и посадки совпадают — RS и MS. Образующиеся при

этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине.

Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеука-

занных трех групп, преимущественно используются на практике.

Рестриктазы III класса (например из фага

Р1,

системы 2R MS)

объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Отдель-

ные из них, например, не узнают сайтов посадки. Их редко

используют на практике.

По предложению

Смита и Д. Натанса

(1973) номенклатура рестриктаз строится

по следующему принципу: название фер-

мента складывается из букв и

цифр:

первая

буква принадлежит родовому названию

источника рестриктазы, две другие буквы

относятся к названию вида источника; в

некоторых случаях дополнительно указы-

вают штамм или серовар; далее следуют

р,,,..

взаимодействие Есо

обозначения RM-системы (не всегда) и ну-

ДНК:

—

вид сверху, б

мерация фермента (таблица 20).

—

вид сбоку.

Из таблицы видно, что число узнаваемых рестриктазами нук-

леотидньгх последовательностей варьирует от 4 до 13 (преимуще-

ственно 4—6). На рис. 66 показано взаимодействие Есо RI с ДНК.

189

В зависимости от источника ДНК число расщепляющихся

сайтов в ней будет неодинаковым. Например, действию рестрик-

ционных эндонуклеаз подвергаются ДНК фага X (инфицирует Е.

coli К — 12), аденовируса 2 и вируса SV — 40; в этом случае число

расщепляющихся сайтов соответственно будет следующим: для

Alul - более 50, более 50, 32; для BamHI —

5,3,1;

для Ball — 15,17,0;

для Hind III — 6, 11, 6; для Mbo I — 50,50,6 и т. д.

Т а б л и ц а 20. Характеристика некоторых рестрикционных эндонуклеаз

(рестриктаз)

Наименование

фермента

Aatll

Асе I

Alul

Ava I

Avail

Bal I

Bam HI

Ban II

Bel I

Bgll

Bglll

Bst EII

Clal

Dpn I (должно

быть согласно

принятой

номенклатуры

Spn I)

Dral

ЕсоШ

(рекомбинант)

EcoRI

EcoRV

Источник получения

Acetobacter aceti

Acinetobacter calcoaceticus

Arthrobacter luteus

Anabaena variabilis

Brevibacterium albidum

Вас.

amyloliquefaciens H

Вас.

aneurinolyticus

Вас.

caldolyticus

Вас.

globigii

— " — " —

Вас.

stearothermophilus ET

Caryophanon latum L

Diplococcus pneumoniae

(Streptococcus pneumoniae)

Deinococcus radiophilus

E. coli, несущая

плазмиду

гиперпродукции Eco RI

E. coli RYI3

E. coli

Сайт узнавания

в последовательности ДНК

- ГАЦГТ/Ц - 3

- ГС7(А, Ц) (Г, Т) - АЦ - 3

- АГ/ЦТ - 3

- Ц/РуЦГРиГ - 3

- Г/Г(А, Т) ЦЦ - 3

- ТГТ/ЦЦА - 3

- Г/ГАТЦЦ - 3

- ГРиПДРу/Ц - 3

- Т/ГАТЦА - 3

- rqqNNNN/NITU. - 3

- А/ГАТЦТ - 3

- Г/ГШАЦЦ - 3

АТ/ЦГАТ - З

- Г^А/ТЦ - 3

- ТТТ/ААА - З

- ГУААТТЦ - 3

;

- ГУААТТЦ - 3

5' - ГАТ/АТЦ - 3

190

Продолжение табл. 20

Наименование

фермента

Fspl

НаеП

Нае III

Hhal

Hinc II

Hind III

Hinf I

Hpal

Hpall

Kpnl

Mbo I

MboII

Mlul

Msp I

Ncol

Ndel

PstI

Pvul

PvuII

Sma I

Xbal

Источник получения

Fischerella species

Haemophilus aegyptius

— " — " —

— " — haemolyticus

— " — influenzae Re

Из штамма E. coli,

несущего плазмиду

гиперчувствительности

Hind III

Haemophilus influenzae

серовар f

Haemophilus

parainfluenzae

— " — " —

Klebsiella pneumoniae

Moraxella bovis

— " — " —

Micrococcus luteus

Moraxella species

Nocardia caroffina

Neisseria denitrificans

E. coli,

несущая плазмиду

гиперпродукции Pst I

Providencia stuartii

Proteus vulgaris

— " — " —

Serratia marcescens Sb

Xanthomonas bardii

Сайт узнавания

в последовательности ДНК

- ТГЦ/ГЦА - 3

- РиГЦЩ/Ру - 3

- ГГ/ЦЦ - 3

- ГЦГ/Ц - 3

- ГГРу/РиАЦ - 3

- А/АГЦТТ - 3

- Г/АГчГГЦ - з'

- ГГТ/ААЦ - 3

Ц/ЦГТ

- 3

- ПТАЦ/Ц - 3'

- N/ГАЦТ - 3

5' - ГААГА (N)

/ - 3

- А/ЦГЦГТ - 3'

Ц/ЦГТ

- З

- Ц/ЦАТГТ - 3'

Ъ' - ЦА/ТАТГ - 3'

Ъ' - ЦТЩА/Г - 3'

- ЦТЩА/Г - З

Ъ' - ЦГАТ/ЦГ - 3'

- ЦАГ/ЦТГ - 3'

- ЦЦЦ/ПТ - 3'

Т/ЦТАГА

- 3

Примечание: 1) в скобках указаны альтернативные нуклеотиды,

2) Ри.Ру — любое пуриновое, пиримидиновое основание,

3) N — любой нуклеотид,

4) Г

— метилированный гуанин,

5) (N)e — нуклеотид, повторяющийся 8 раз.

191

Расщепление сайтов может происходить симметрично (см. Alu

I, Bal I, Dpn I и др.) с образованием тупых концов в ДНК

и асимметрично (Aat II, Асе I, Ava I, II, Bam HI и др.) с образованием

липких концов:

Hinc II

-ЦТАГГЦАГЦТГГАЦГТ-

-Г АТЦЦГ ТЦГ АЦЦ ТГЦА-_

Hinc II

ДНК

-ЦТАГТЦАГ ЦТГГАЦГТ-

,-ГАТЦЦГТЦ, [ГАЦЦТГЦА-,

фрагменты ДНК с тупыми концами

Hind III

- ГТЦГТААГЦТТЦЦГТГ-

:'-::'••'::'•':::': ДНК

- ЦАГЦАТТЦГААГГЦАЦ- _

Hind HI

- ГТЦГТА АГЦТТЦЦГТГ-

|-ЦАГЦАТТЦГА | [ АГГЦАЦ-|

фрагменты ДНК с липкими концами

Рестриктазы расщепляют ДНК примерно через 250 нуклеоти-

дов,

исходя из формулы 4" (4 — нуклеотиды — А, Г, Т, Ц; п —

число повторов сайтов в ДНК).

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделя-

ют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламид-

ном — ПААГ), из которых их экстрагируют, вырезая соответству-

ющие участки геля; эти участки геля, например агарозного, рас-

плавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом,

затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и

проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов. При не-

192