Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

обходимости можно дополнительно провести препаративный гель-

электрофорез.

Из 160 мкг

ДНК нематоды Caenorabiditis elegans

удается получать 2-4 мкг какого-либо одного фрагмента.

Рестрикты (особенно — с липкими концами) могут быть сшиты

с помощью ДНК-лигаз. При необходимости липкие концы отжи-

гают (отжиг—это специфическая реассоциация комплементарных

цепей

образованием двухцепочечных молекул):

•5'-Т ЦТАГ-А-3'-+- -З'-АГАТЦ

Т-5'-

5'-Т * Ц

•

• Г •

3'-

З'-А

Г •

•

Ц . Т

5'-

реассоциант

пробелами между

Т и Ц

в обеих нитях ДНК

В пробелах между нуклеотидами отсутствуют фосфодиэфир-

ные связи, которые могут быть воссозданы с помощью ферментов

лигаз, катализирующих реакции синтеза за счет 3

-гидроксильной

и 5

-фосфатной групп

--о

нуклеиновое

СН

о основание

ОН

"Г"

-н,о

\р нуклеиновое

s,0-

основание

ОН

-- о

нуклеиновое

С «2

О^

основание

он—Р=О

нуклеиновое

CHj

основание

7 т. 8524

он

193

Таким путем восстанавливаются ковалентные связи в пробелах:

• • •

/—Т—Ц—Т—А—Г—А—З

'' '3

—А—Г—А—Т—Ц—Т—5

Для сшивания фрагментов ДНК используют также линке-

ры и адаптеры. Линкер (от англ. link — соединять) — это

синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содер-

жащий сайты узнавания для ряда рестриктаз; он может быть

присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью

какой-либо рестриктазы, в процессе реконструирования рДНК.

Например, линкер Eco RI представляет собой d

(ГГААТТЦЦ)

Адаптер — это линкер, содержащий больше, чем один сайт

узнавания рестриктазой, и обеспечивающий получение фрагмен-

тов от действия одной рестрикционной эндонуклеазы для включе-

ния в сайт другой рестриктазы, то есть адаптер предназначен для

объединения фрагментов с несовместимыми концами. Пример

адаптера Есо Ш к Sma I: (ААТТЦЦЦГГГ). Тупые концы ДНК,

образованные после рестрикции, могут относительно легко сши-

ваться под действием ДНК-лигазы фага Т4.

Метод клонирования широко используют для выделения инди-

видуальных генов прямо из генетического материала, располагая

при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зон-

дами. Эти последние взаимодействуют только с определенными

последовательностями и гибриды их с генами регистрируются

радиоавтографией на рентгеновских пленках. Пример анализа по

Саузерну (по англ. southern-blotting

—

промокание по Саузерну)

показан на рис. 67. Аналогичный подход применим и для анализа

РНК (метод Нозерн* -блотинга).

В генетической инженерии следует различать копийную

ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК, и векторы, несущие

клоны геномной или хромосомной ДНК. При

клонировании всего генома ("шотган-эксперимент", от англ.

shotgun — дробовик) его разделяют с помощью рестриктазы,

узнающей короткую (4 пн) последовательность нуклеотидов. Раз-

рушение проводят в таких условиях, чтобы осуществлялась час-

— Здесь использована игра слов Southern и Northern, то есть южный и север-

ный, хотя в первом из них отражена фамилия ученого.

194

Рис.

67. Схема выделения фраг-

ментов ДНК из смеси рестриктов

ДНК по Саузерну: 1 — расщепление

геномной ДНК на случайные фраг-

менты с помощью рестриктазы (Р), 2

— электрофорез фрагментов ДНК в

агарозном геле, 3 — недифференци-

рованное пятно ДНК, 4 — тепловая

денатурация ДНК с образованием од-

ноцепочечных фрагментов и перенос

их на нитроцеллюлозный фильтр для

фиксации (blotting), 5 — гибридиза-

ция с радиоактивным зондом, 6 —

6 гибридные последовательности, вы-

явленные с помощью радиоавтогра-

фии, 7 — выделение фрагментов из

агарозного геля для исследования.

тичная рестрикция ДНК. Образующиеся при этом фрагменты

будут разной длины, но каждый из них заканчивается одной и той

же последовательностью. Наличие во фрагменте липкого конца

делает его удобным для клонирования. Разделенные фрагменты

всего генома встраивают затем в клонирующий вектор с образо-

ванием набора химер, который может храниться в течение неог-

раниченного времени. Такой набор клонированных фрагментов

ДНК называют библиотекой генома. С помощью нового

(оригинального) зонда библиотека может быть сразу же использо-

вана для поиска специфического фрагмента.

Включение фрагмента чужеродной ДНК

в векторную плазмиду

На латинском языке vector значит везущий, несущий; в мате-

матике вектор — это прямолинейный отрезок, которому придано

определенное направление. Понятие "вектор" в молекулярной

биологии объединяет сущность данных выше двух определений и

название "Вектор для клонирования" введено М. Томасом в 1974

г. для ДНК, способной переносить в клетку — реципиент чужерод-

ную ДНК любого происхождения. Вектор — самый важный ком-

понент процесса клонирования. Он должен удовлетворять следу-

ющим требованиям: 1) относительная легкость накопления и вы-

деления его в достаточном количестве,

2) он должен содержать генетические маркеры для отбора

последующих трансформантов,

3) наличие в векторных ДНК нескольких сайтов узнавания

различными рестриктазами в целях получения для клонирования

серии разных молекул ДНК.

195

Следовательно, векторы — это молекулы ДНК, обеспечиваю-

щие амплификацию фрагмента (образование дополнительных ко-

пий его) в растущей популяции клеток соответствующего вида

организма.

Для клонирования ДНК например в клетках Е. coli можно

использовать два класса векторов — плазмиды и фаги. Из числа

ДНК-плазмид для практических целей рекомендованы и имеются

на рынке следующие: Col EI из Е. coli штамм С600, Col EI Amp из

Е. coli штамм KR245, резистентный к антибиотику ампициллину;

pBR322 из Е. coli штамм RRI, резистентный к ампициллину и

тетрациклину; pBR325 из Е. coli штамм

НВ101,

резистентный к

ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу (левомицетину);

pUC-плазмиды (pUC8, pUC9, pUC18, pUC19) из Е coli штамм RRI,

резистентный к ампициллину и дефектный по (3-галактозидазе;

pUBl

из Вас. subtilis штамм BD170, резистентный к канамицину;

рУАС-клонирующие векторы, впервые предложенные в 1987 г. (Д.

Т. Бурке, Ф. Г. Карл, М. В. Олсон) — рУАСЗ, рУАС4, рУАС5. Они

представляют собой дрожжевую (от англ. yeast), искусственную

(А, от англ. artificial) хромосомную (С, от англ. chromosome) кло-

нирующую систему для клонирования больших (50-100 кЬ в длину)

фрагментов ДНК; Ti-плазмиды (от англ. Tumor inducing — вызы-

вающие опухоль) из Agrobacterim tumefaciens

(pTi —

В6-806) штамм

А277,

утилизирующий октопин, и pTi — С58 из A. tumefaciens

штамм С58, утилизирующий нопалин.

N-C=NH

NH-(CH

)

-CH-COOH

NH-CH-COOH

сн

октопин

(синтезируется из аргинине и пирувата}

HOOC-CH-NH-CH-COOH

I I

(СН

)

(СН

)

I I

СООН NH

-с=ын

нопалин

196

Октопин и нопалин, равно как и атропин, относятся к группе

/ \

HjN-CCMCHpj-CH О

NH СН-(СНОН) -СНОН

\ /

/Ч

агропим

о п и н о в — низкомолекулярных веществ, синтезируемых

клетками злокачественной опухоли двудольных растений — ко-

рончатого галла. В этой связи различают опухолевые клетки

агропинного, нопалинового и октопинового типов.

Из бактериофагов используют ДНК-содержащие колифаги Т2,

Т4,

Т5, Т7, фаги

М13тр8, М13тр9, М13тр18, М13тр19, фХ174;

из ДНК вирусов — SV40 и аденовирус 2.

Векторные системы можно конструировать из ДНК, несущих

маркер(-ы), с последующим включением их, например, в клетки

эукариот, в том числе — млекопитающих.

В качестве иллюстраций векторных систем приводим рис. 68а,

на котором изображены плазмиды Col El, pBR322, вирус SV40 и

челночный вектор.

Вирусы растений — как векторы обычно мало пригодны из-за

своей патогенности для растительных организмов и неспособности

встраиваться в хромосомы хозяйской эукариотической клетки. В

настоящее время наметились подходы к изучению и оценке трех

векторных систем: двухцепочечной ДНК вируса мозаики цветной

капусты, одноцепочечной РНК вируса погремковости табака, од-

ноцепочечной ДНК вируса золотистой мозаики фасоли. Из них

лишь первая оставляет надежды на дальнейшее продвижение этой

системы в сторону практической реализации пока в лабораторных

условиях. Не исключается возможность объединения ДНК вируса

мозаики цветной капусты с Т-ДНК Ti-плазмиды из Agrobacterium

и расширить круг растений — реципиентов такой векторной

системы.

Дж. Коллинс и Б. Хон в 1978 г. впервые ввели в практику так

называемый космидный вектор, или cos-вектор, то есть комбини-

рованную векторную систему "плазмида-ДНК фага лямбда". Дан-

ный вектор способен акцептировать до 40-50 тыс. пн. При этом

совмещаются плазмидные репликаторы и cos-сайты фага

в одном

197

геноме. Космидам присущи свойства фагов и плазмид, то есть

способности упаковывать свою ДНК в головке фагов и автономно

реплицироваться. Свойства фагов и плазмид объединяют в себе

фазмиды, к которым можно отнести и космиды.

Включение фрагмента чужеродной ДНК в вектор осуществля-

ют по следующей схеме (рис. 686). Многие плазмиды несут транс-

позоны.

Рис. 68а, б. а — плазмиды: I — Col EI; II — pBR322; III — вирус SV40; IV —

челночный вектор для кишечной палочки и клеток обезьяны (1 — ori-сайт SV40; 2

— промотор SV40; 3 — вероятная сигнальная последовательность; 4 — последова-

тельность, кодирующая гамма-интерферон; 5 — фрагмент кДНК; 6 — ori-сайт

pBR322, 7 — ген устойчивости к ампициллину;

б — включение чужеродной ДНК в плазмидный вектор (схема): 1 — вектор, 2

— ген, 3 — рестрикты, образовавшиеся под влиянием рестриктазы Eco RI, 4-гиб-

ридная (химерная) ДНК, Л-ДНК-лигаза.

Клонирование рДНК

Для клонирования рДНК используют так называемые

пермиссивные клетки (от англ. permission — разрешение).

Клон — это большое число молекул или клеток, идентичных

198

исходной родительской молекуле или клетке. К числу пермиссив-

ных клеток для включения в них рДНК относятся такие, в которых:

1) не разрушаются чужеродные ДНК или РНК собственными

ферментами — нуклеазами,

2) срабатывает механизм репликации вектора,

3) проявляется выраженная активность промотора и/или тер-

минатора транскрипции рДНК,

4) отмечается полный сплайсинг мРНК,

5) наблюдается эффективная трансляция мРНК,

6) нет выраженной активности пептидогидролаз, катализиру-

ющих реакции гидролиза экспрессируемых чужеродных белков.

Излюбленными объектами в генной инженерии являются клет-

ки Е. coli, Вас. subtilis, Saccharomyces cerevisiae и некоторые другие.

Е. coli — грамотрицательные, перитрихальные, прямые палочки

(1,1-1,5x2,0-6 мкм — живые, или 0,4-0,7x1,0-3,0 мкм — высушенные

и окрашенные); факультативный анаэроб, хорошо растет на про-

стых питательных средах при 37°С, содержание

+ Ц в ДНК 50-51

мол% (по температуре плавления и плавучей плотности). Некото-

рые серовары Е. coli патогенны для человека (01, 02, 06, 08, 09, 011,

015,

026, 055, 078, 0111, 0124, 0144, 0148 и др.). Е. coli чувствительна

к включению векторов.

Вас.

subtilis — почвенные, спорообразующие, грамположитель-

ные,

непатогенные, прямые, перитрихальные палочки (0,7-0,8 х

2,0-3,0 мкм), хорошо растет на простых питательных средах при

разных температурах (минимальная 5-20°С, максимальная 45-55°С),

содержание

+ Ц в ДНК от 32 до 62 мол%; обладает высокой

частотой трансформации

(4%),

с кольцевой хромосомой, на которой

известно более 2000 локусов; содержит сайт-специфические нук-

леазы, чувствительна к включению векторов.

Saccharomyces cerevisiae — аскомицетные, одноклеточные, сап-

рофитные дрожжи (группа низших грибов), широко используемые

в микробной биотехнологии для получения разных биологически

активных веществ (БАВ). Вегетативные клетки этого вида однокле-

точные, почкующиеся, круглые или, чаще, овальные, размером

2,5-11x2,5-30 мкм, хорошо растут на средах Сабуро, с пивным

неохмеленным суслом и других при температуре 26°С; содержание

Г + Ц в ядерной ДНК колеблется в средних пределах от 48 до 63

мол%; в отличие от бактерий они генетически более стабильны, не

подвергаются фаголизису, способны гликозилировать собствен-

ные белки (продуцируемые эукариотическими клетками белки, как

199

правило, функционально активны в форме гликопротеинов), их

геном лишен оперонов, обладают тремя классами РНК-полимераз,

и т.д. Другими словами — сахаромицетные дрожжи являются

типичными эукариотами, поэтому в них лучше клонировать гены

растений и животных. У S. cerevisiae имеется 17 хромосом, на

которых картировано свыше 600 генов. Для клонирования чуже-

родных ДНК в дрожжевых клетках нередко используют челночные

векторы, имеющие ori-сайты бактериальных и дрожжевых плаз-

мид, а поэтому способные самостоятельно реплицироваться в

бактериальных и дрожжевых клетках. На рис. 68 схематично

изображен челночный вектор иммунного интерферона (INF-y),

который реплицируется в клетках обезьяны и

Е.

coli.

этом векторе

содержится фрагмент из 342 пн, который включает ori-сайт и

промотор из вируса SV-40; данный фрагмент связан с фрагментом

кДНК, включающим кодирующую последовательность npe-INF-y,

и с фрагментом pBR322, содержащим ген резистентности к ампи-

циллину и ori-сайт репликации pBR322.

У дрожжей выявлены 3 вида циклически замкнутых плазмид:

двух- и трехмикронная, митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК.

Первые две относятся к разряду "эгоистических" криптических,

поскольку биологическое значение их остается скрытым, неясным.

Лишенные селективных маркеров они представляют ценность в

качестве векторов только после включения в них соответствующих

хромосомных генов дрожжей, функционирующих как в дрожже-

вых, так и в бактериальных (Е. coli) клетках. К таким генам

относятся те из них, которые отвечают за биосинтез таких фер-

ментных белков, как аргининсукцинатлиаза, аспартат-транскарба-

милаза, галактокиназа, дигидрооротатдегидрогеназа, триптофан-

синтаза и др.

Известно 5 типов дрожжевых векторов, образующих Y-rpyniry

(от англ. Yeasts — дрожжи): Yip, YEp, YRp, YCp, YLp. Первые из

них (Yip) представляют собой интегративные плазмиды, в которых

только один ген принадлежит дрожжевой ДНК, остальные гены

относятся к бактериальным. Yip не способны реплицироваться в

клетках S. cerevisiae, но осуществляют их трансформацию, интег-

рируясь в хромосому через рекомбинацию.

Векторы YEp — эписомальные плазмиды, сконструированные

на основе двухмикронной плазмиды. Частота трансформации S.

cerevisiae этими векторами на три порядка выше, чем в случае

использования Yip, но, к сожалению, получаемые трансформанты

мало стабильны.

200

Векторы YRp — репликативные плазмиды, включающие хро-

мосомные репликаторные последовательности, именуемые ars-no-

следовательностями (от англ. autonomously replicating sequence —

автономно реплицирующаяся последовательность). Трансформан-

ты дрожжей, получаемые с помощью YRp, нестабильны.

Векторы YCp в виде кольцевых мини-хромосом содержат цен-

тромеры дрожжевых хромосом и репликаторы arsl и ars 2. Они

стабильны при митозе и мейозе, и наиболее перспективны для

клонирования генов.

Векторы YLp — линейные мини-хромосомы, конструируемые

на базе YCp. Для этого вводят специфические, шпилечные по

форме, нуклеотидные последовательности на концах хромосом

(теломеры) в кольцевые плазмиды YCp с последующей линеариза-

цией плазмид.

Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в

качестве инертной части генома, поэтому их называют еще кло-

нирующими векторами. В биологической технологии

выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку). Если же

плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации,

когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды)

накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше

образуется целевого продукта.

отличие от хромосомы репликация

плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при останов-

ке синтеза белка, Вот почему, например, при добавлении левоми-

цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным воз-

растанием числа копий плазмиды (увеличение степени клониро-

вания).

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются

различными методами: трансформации, инфекции, микроинъек-

ций. При естественной трансформации рДНК может проходить

через интактную клеточную стенку Вас. subtilis, Streptococcus

pneumoniae, некоторых штаммов Е. coli с ингибированной систе-

мой деградации ДНК, и др.

В 1970 г. М. Мандель и А. Хига предложили метод обработки

бактерий хлористым кальцием на холоду в целях трансформации

ДНК фага в клетки Е. coli. Этот метод используется и теперь. Этапы

его примерно следующие:

1) выращивание культуры в питательной среде при оптималь-

ной температуре в течение суток с последующим разведением

примерно в 50 раз свежим питательным бульоном, выращиванием

201

до

Абоо

= 0,2 (показатель плотности) и охлаждение во льду;

2) центрифугирование суспензии при 3000 g 10 мин, темпера-

туре 4°С и разведение осадка клеток в 0,1 М CaCh, охлажденного

во

льду,

с последующим центрифугированием при тех же условиях;

3) ресуспендирование осадка в минимальном количестве (на-

пример, в 1 мл) охлажденного во льду 0,1 М растворе СаОг,

хранение до использования при 4°С. Это и будут пермессивные

компетентные клетки, готовые претерпевать трансформацию; если

такие клетки, ресуспендированные в 0,1 М СаСЬ, 30% глицерине

заморозить при -70°С, то их можно хранить в течение нескольких

месяцев;

4) добавление плазмидной ДНК к компетентным клеткам (при-

мерно 0,1 мкг ДНК в 0,2 мл суспензии клеток), выдерживание во

льду

час;

5) тепловой шок смеси при 42° С 5 мин.;

.6) разбавление пробы в 10 раз питательным бульоном, инкуба-

ция 1 час на качалке при 37°С; за это время, например, признак

резистентности к какому-либо антибиотику успевает зкспресси-

роваться;

7) посев клеток в серии разведений на чашки Петри с пита-

тельным агаром, содержащим соответствующий(-ие) антиби-

отик (-и), выдерживание в течение суток при оптимальной темпе-

ратуре;

8) изоляция нужной колонии и размножение клона.

рДНК можно ввести в клетки млекопитающих путем слияния

протопластов, например Е. coli, содержащих рДНК, с культивиру-

емыми эукариотическими клетками в присутствии полиэтиленгли-

коля, или ПЭГ, способствующего слиянию протопластов.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последова-

тельностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические

клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов

называют трансфекцией. Альтернативный метод —

использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая

клетка инфицируется — (заражается) вирусом. В качестве

векторов при этом чаще используют литические вирусы типа

вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструи-

рованные на основе ретровирусов и папилломавирусов.

На растительных объектах можно выполнить генно-инженер-

ные эксперименты, используя методы трансформации и инфици-

рования (см. рис. 141).

202